外周血循环RNA、微小RNA与肿瘤诊断*

循环核酸(circulating nucleic acid, CNA)是指存在于血液(血清或血浆)等体液中的细胞外游离DNA和RNA,与生理和病理状态下的细胞代谢密切相关,循环DNA和RNA水平的检测及其在基因诊断等方面的应用对于恶性肿瘤等疾病的诊断和监测具有十分重要的意义。近期人们在进行循环DNA、RNA分子检测的同时,在循环微小RNA(microRNA, miRNA)方面也做了许多的工作,研究结果使得与肿瘤相关的核酸分子检测这一领域变的更加让人振奋。在血液中检出肿瘤特异性的miRNA并将其作为肿瘤的生物学标志对于早期诊断肿瘤具有至关重要的意义。     

应用核酸适配子检测细胞因子的新方法-ELONA法

以人肿瘤坏死因子 (Humantumornecrosisfactor,hTNF α)特异性的核酸适配子为检测分子建立了酶联寡聚核苷酸吸附试验 (Enzyme linkedOligonucleotideassay ,ELONA)方法 ,用于hTNF α的检测。通过SELEX(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment)方法从随机RNA库中筛选到与hTNF-α特异结合的RNA适配子。根据其序列 ,用体外转录方法合成生物素标记的RNA适配子 ,并对其进行了氨基修饰以增加其稳定性。以hTNF-α的单克隆抗体为捕获分子 ,生物素标记的hTNF-α特异性RNA适配子为检测分子建立了ELONA方法 ,并对这种检测方法的灵敏度、精密度和准确度等进行了分析。同时用ELONA和ELISA方法检测了正常人血清中的hTNF-α水平 ,并对检测结果进行比较。结果显示 ,ELONA方法的灵敏度为 100pg/mL ,具有较好的精密度和准确度。ELONA法的检测结果与ELISA法检测结果基本一致。该方法适用于血清、细胞培养上清等多种生物标本中各种细胞因子及其它蛋白的检测。     

双歧杆菌分泌RNA的实验

目的：通过双歧杆菌对数生长期培养液中出现核酸的性质的研究探索双歧杆菌作用于机体的分子机制。方法：采用液体培养双歧杆菌方法;提取对数生长的双歧杆菌培养发酵液中的总核酸;将纯化后的核酸用RNA降解酶降解,电泳观察核酸条带电泳结果。结果：双歧杆菌对数生长期培养发酵液中仅存在RNA。结论：双歧杆菌对数生长期可能分泌100bp RNA。     

女贞的一种小分子闭环RNA

女贞(Ligustrum Cornpactum)叶片的核酸提取物,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),出现两条低分子量的核酸带,DNase 1及RNase A处理证实两条核酸带均为RNA,初步测得迁移率较小的RNA的分子量约为0.7×10~5道尔顿,5＇末端标记,双相及双方向PAGE分析证实,该RNA是存在于女贞叶片细胞内的一种小分子闭环RNA(简称psc RNA),不同离子强度下的RNase A处理揭示,psc RNA分子内有大量碱基互补结构,从点杂交结果推断psc RNA的一级结构中,不含绝大多数闭环类病毒RNA所共同具有的中心保守区段,在本实验的条件下pscRNA不能感染爪哇三七,女贞叶片汁液和按照提取,纯化病毒粒子的程序制备的溶液。在电镜下均没有观察到病毒颗粒,结果表明,女贞叶片细胞中存在一种无蛋白质外壳包被的、具有次量分子内碱基互辅结构的共价闭合环状RNA分子,在其它两种植物中,亦初步检测到此类闭环RNA分子,讨论了此种闭环RNA分子的意义。     

应用核酸适配子检测细胞因子的新方法—ELONA法

以人肿瘤坏死因子(Human tumor necrosis factor,hTNF—α)特异性的核酸适配子为检测分子建立了酶联寡聚核苷酸吸附试验(Enzyme—linked Oligonucleotide assay,ELONA)方法,用于hTNF—α的检测。通过SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)方法从随机RNA库中筛选到与hTNF—α特异结合的RNA适配子。根据其序列,用体外转录方法合成生物素标记的RNA适配子,并对其进行了氨基修饰以增加其稳定性。以hTNF—α的单克隆抗体为捕获分子,生物素标记的hTNF—α特异性RNA适配子为检测分子建立了ELONA方法,并对这种检测方法的灵敏度、精密度和准确度等进行了分析。同时用ELONA和ELISA方法检测了正常人血清中的hTNF—α水平,并对检测结果进行比较。结果显示,ELONA方法的灵敏度为100pg／mL,具有较好的精密度和准确度。ELONA法的检测结果与ELISA法检测结果基本一致。该方法适用于血清、细胞培养上清等多种生物标本中各种细胞因子及其它蛋白的检测。     

生物工程技术讲座(十) 核酸标记—生物探针法

在核酸的研究中不用放射性同位素,而用生物素(biotin)标记DNA或RNA分子做为探针来检测核酸分子的方法,是最近几年内开展起来的实验新技术。按一般常规在进行核酸的分析、鉴定以及分子杂交等实验之前,首先以所谓“DNA缺口翻译”的方法制备用同位素标记的DNA(探针)。即把待标记的已知DNA分子用核酸酶(DNase)切成缺口,加入能识别并附着在缺口上的大肠杆菌     

增强原位杂交探针敏感性的研究

原位杂交(ISHH)属于固相分子杂交范畴,它是用标记的DNA或RNA为探针在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法.     

柑桔树中的一种小分子RNA

从柑桔裂皮病疫区采集的柑桔植株叶片中提取核酸,经双方向聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,发现两种小分子环状RNA,采用分子杂交鉴定,此两种小分子RNA均与大多数类病毒中心保守区段有明显的序列同源性,其中一种分子量较柑桔裂皮病类病毒(CEV)小,与马铃薯纺锤体块茎类病毒(PSTV)大小相近。将含CEV和小分子RNA的柑桔叶汁接种于爪哇三七,经一定时间后,从爪哇三七中提取核酸,通过电泳和分子杂交方法分析,获得与柑桔植株相同的结果。对此种小分子RNA的性质本文进行了初步分析。     

第二章 核酸的化学(提要)

核酸是生物体内普遍存在的一类生物大分子。根据化学组分,核酸可以分为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两大类。所有生物细胞内部含有这两类核酸,但在病毒,要么只含DNA,要么只含RNA,没有既含DNA又含RNA的病毒。类病毒只是游离的小分子RNA。核酸的生物功能是多种多样的,但最主要的是它具有贮存和传递遗传信息的功能。DNA在细胞内主要存在于染色体中,是遗传信息的主要载体,通过半保留复制将全部遗传信息传给子细胞。细胞核和细胞质中都有RNA。RNA至少有三种主要类型:(1)核糖体RNA(rRNA),(2)转移RNA(tRNA),(3)信使RNA(mRNA)。它们在蛋白质生物合成     

H9N2亚型流感病毒核酸参考品研制及荧光RT-PCR检测验证

从H9N2亚型流感病毒A/chicken/Hunan/04.14 (H9N2)核酸中扩增了HA基因的编码序列,克隆测序后,采用体外转录方法制备RNA。用RNA保存液稀释至含量约10~9 copies/μL。分装后进行均匀性和稳定性检验,通过4家实验室协作标定,取平均值作为定值结果。此外,文中建立的实时荧光定量PCR (qPCR)快速检测技术,对临床样品进行准确检测验证,检测限可达10个拷贝。结果表明,文中制备的核酸参考品可作为H9N2亚型流感病毒核酸快速检测方法的阳性定量参考品。     

分子生物学技术讲座（五）：放射性标记的DNA和RNA探针的制备

放射性标记的核酸探针（DNA和RNA探针）目前已被广泛地应用于分子生物学的各个领域,例如克隆的筛选,Southern杂交分析,基因表达水平的测定等等。放射性核酸分子探针是指特定的已知核酸分子片段,内含放射性核素（例：‘千、‘H和”S）,并能与被检测的核酸分子退火杂交（核酸序列互补）,因此可用于待测核酸样品中特定基因序列片段的探测。1探针的种类和选择根据核酸分子探针的来源及其性质可将其分成3大类,即：DNA探针、RNA探针和人工合成的寡聚核青酸探针。而DNA探针又可分为基因组DNA探针和。DNA探针。探针的选择是根据不…     

CRISPR技术在生物传感中的应用——胞内核酸成像、体外核酸检测与胞内DNA记录

核酸分子是生命的遗传物质和生命信息载体。如何观察细胞内外特定核酸序列,快速检测核酸序列和记录检测的细胞活动过程?这些在分子生物学领域重要的科学问题需要强有力的技术来解决。如今,在基因组编辑领域赫赫有名的CRISPR技术开始涉足上述领域。重点介绍CRISPR相关蛋白在生物传感方面的应用,包括细胞内特定基因组序列和RNA的成像、体外核酸快速检测以及细胞内DNA记录。核酸成像与核酸检测是将特定核酸序列的信息,通过CRISPR蛋白的参与转化为易检测的信号(如荧光);而DNA记录则是将细胞的代际或所接触的信号转化为细胞内DNA序列进行储存。这些新兴研究方向的开发和发展将大大促进CRISPR技术在基础科学、合成生物学、分子诊断等领域的应用。     

鸭和人乙型肝炎病毒DNA体外高效转录体系分子克隆的建立

分子生物学的发展主要在于其所必需技术的发展,体外放射标记出高比活的DNA分子探针,可提高核酸分子检测的敏感性。目前,国内使用的HBV DNA分子探针,均为缺刻转移(Nick Translation)方法标记,敏感性可检出1-2Pg,1984年Melton等报告了依DNA为横板在体外转录合成高比活的单链RNA探针(SSRNA-p)敏感10倍。     

一种高等植物小片段RNA分子标记方法

分子生物学技术特别是分子标记方法越来越多应用于研究植物间相似关系及其进化规律。为试图寻找一种适合缺乏分子生物学数据的,以及能够在属以上高阶元间快速比较研究的小片段RNA分子标记方法,作者通过含HAc-NaAc缓冲体系的SDS总核酸提取方法,提取了53种高等植物的总核酸。将总核酸在7%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳,结果发现:(1)在100-200 bases的位置有高丰度的RNA条带,条带稳定清晰,结果可重复再现,用DNaseI和RNaseA处理后认为这些片段属于小片段RNA。(2)比较了绿豆幼苗经0-8h不同光照处理,以及猕猴桃不同品种和器官之间的小片段RNA,表明不同光照时间、不同性别的花蕾、叶片和染色体倍性间的带型一致,说明这些片段部分具有一定的空间结构,其表达极其稳定,无明显差异。(3)同一科内的植物的带型存在多态性,主要是由地理隔绝造成的差异,并且分类阶元高的多态性百分比和多态性信息量高于分类阶元低的。(4)经过比较蕨类植物、裸子植物和被子植物53种植物的小片段RNA,发现在100-200bases中含3-6条清晰的条带,带型跟植物亲缘关系相关。因此,作者认为100-200bases位置的小片段RNA可作为鉴定植物科间和科内亲缘关系的一种分子辅助标记。     

绒毛烟斑驳病毒卫星RNA的一种突变体的初步研究

用电泳检测VTMoV88感染绒毛烟后病毒特异性核酸组份,发现核酸的小分子RNA(卫星RNA)组成发生变化。提纯的病毒通过电镜观察及血清学鉴定并与VTMoV加以比较,证明两者在颗粒形态、大小及血清学关系上一致。以克隆的VTMoV—RNA3 cDNA片断为探针检测VTMonV与VTMoV88卫星RNA分子之间的核苷酸序列同源性,结果显示出两种毒源的卫星RNA具有高度同源性。据此,推测VTMoV88可能是卫星RNA发生变异的突变体,并对VTMoV 83卫星RNA突变体形成机制进行了初步探讨。     

北京苜蓿花叶病毒H-10分离物的研究II.病毒外壳蛋白质及病毒核酸各组分的分离

分离纯化了AMV-H-10 的核酸和外壳蛋白质,测定了核酸的生物活性和分子量。外壳蛋白质分子量约为24,500。四种核酸的分子量：RNA．-1.3×106、RNA2-1.1 x 106、RNA3-0．80×106、RNA4一0．48×106。这数据与Hull所测定的基本相同,但比实际的分子量偏高,文中对此进行了讨论。用电泳洗脱法分离纯化了H—10的RNA3.4.5;RNA,是卫星RNA还是病毒基因组在提纯过程中的降解产物,有待进一步证明。     

定量测定黑鲷生长激素受体mRNA的液相杂交/RNase保护法

目的　建立液相杂交 核糖核酸酶保护测定 (RibonucleaseProtectionAssay,RPA)技术定量检测黑鲷(Sparusmacrocephalus)生长激素受体mRNA水平。方法　将黑鲷生长激素受体cDNA片断亚克隆至pGEM T载体 ,制备特异性的放射性反义RNA探针及正义RNA ,将反义RNA探针与正义RNA及样品总RNA进行液相杂交 ,用RNaseA和RNaseT1 降解杂交产物的单链RNA ,双链杂交体得到保护 ,然后检测杂交体的分子大小及放射强度。结果　检测出了黑鲷生长激素受体反义RNA探针与正义RNA及样品总RNA的特异性杂交片断 ,由此建立了定量测定黑鲷生长激素受体mRNA的液相杂交 RNase保护法 ,并采用该方法在黑鲷的多种组织中检测出了生长激素受体基因的表达 ,表达水平在肝脏中最高。该结果与我们曾采用生长激素放射受体分析法对黑鲷生长激素受体所研究的结果相吻合。结论　为进一步深入研究鱼类生长激素受体分子内分泌的调控理论提供了有力手段。     

应用SELEX技术筛选人类血型IgG适体的实验研究

目的:建立Rh(D)血型的IgG类抗体适体的筛选方法,为后续合成适体并进行新生儿溶血病的防治研究奠定基础。方法:利用SELEX技术,构建含有52个随机序列的单链DNA文库,利用硝酸纤维素膜法筛选与IgG类抗体分子高亲和力结合的核酸分子,同时探索并优化将其扩增为双链DNA核酸库的PCR反应条件;通过膜结合实验检测核酸分子的富集效果并用凝胶阻滞实验初步测定所得核酸适体与Rh(D)血型IgG类抗体的亲和力。结果:随着筛选的进行,核酸分子的富集库向着与靶分子亲和性增强的方向进化,经过了11个循环,筛选出与Rh(D)血型IgG抗体结合力较强的核酸分子,与核酸结合的IgG分子在凝胶阻滞实验中显示出阻滞带。结论:初步建立了利用SELEX技术筛选人类Rh(D)血型IgG抗体适体的方法。     

DNA-膜固相核酸分子杂交技术及其应用

我们曾采用液相核酸分子杂交竞争抑制实验,比较了小鼠正常肝和小鼠腹水肝癌的细胞核RNA和细胞质RNA。液相核酸分子杂交技术具有其优点,如DNA-RNA杂交率比较高等,但也存在有不足之处,如变性DNA的自我“退火”,直接影响到DNA-RNA杂交分子的形成等。有鉴于此,我们又采用了Gillespie和Spie-gelman(1965年)的DNA-膜固相核酸分子杂交技术,分析比较了我所建立的二乙基亚硝     

滚环扩增技术的原理及其应用的研究

滚环扩增是近年来发展起来的一种恒温核酸扩增方法。这种方法不仅可以直接扩增DNA和RNA,还可以实现对靶核酸的信号放大,灵敏度达到一个拷贝的核酸分子,因此,RCA技术在全基因组扩增、单核苷酸多态性、DNA芯片、蛋白质芯片等方面检测中具有很大的应用价值和潜力。