III型分泌系统抑制剂对铜绿假单胞菌PAO1毒性因子的影响

【目的】进一步研究III型分泌系统(Type III secretion system, TTSS)抑制剂对条件致病菌Pseudomonas aeruginosa PAO1的TTSS相关蛋白、鞭毛和纤毛等主要毒性因子的影响,评估TTSS抑制剂的防治效果及潜在风险。【方法】构建TTSS效应蛋白合成基因exoY和exoT转录报告质粒pAT-exoY、pAT-exoT,并将其转入菌株PAO1中。菌株PAO1(pAT-exoY)、PAO1(pAT-exoT) 与TTSS抑制剂共同培养后,检测exoY和exoT的表达。通过SDS-PAGE检测TTSS抑制剂对鞭毛结构蛋白FliC的影响。将PAO1单菌落穿刺接种于含有TTSS抑制剂的1%琼脂糖平板,观察细菌纤毛介导的蹭行运动(Twitching motility)。【结果】转录报告实验结果表明4个TTSS抑制剂可显著抑制exoY和exoT的转录;化合物TS52、TS53和TS94虽不影响胞内TTSS针状顶端结构蛋白PcrV的产量,但可抑制PcrV蛋白的胞外运输。化合物TS53可降低鞭毛结构蛋白FliC的产生。另外,化合物TS52、TS53和TS88可降低菌株PAO1的蹭行运动能力,但TS94可提高菌株PAO1的这种运动能力。【结论】TTSS抑制剂除通过抑制TTSS表达外,还可能通过影响其它毒性因子如鞭毛的合成、IV型分泌系统介导的蹭行运动等方式影响菌株PAO1致病性。     

肉桂酸衍生物对铜绿假单胞菌PAO1 III型分泌系统的影响

【目的】铜绿假单胞菌是引起医院获得性感染最常见的条件致病菌,而III型分泌系统(Type III secretion system,TTSS)是其致病的主要因子之一。本文从合成的21个肉桂酸衍生物中筛选影响TTSS效应子(Effector)产生的化合物,并初步研究其作用机制。【方法】将TTSS效应子合成基因exoS的转录报告质粒pAT-exoS转入菌株PAO1中,获得PAO1(pAT-exoS)。待筛选的化合物与PAO1(pAT-exoS)菌株共培养6 h后,检测exoS基因的表达,从中筛选影响exoS基因表达的化合物。【结果】筛选结果表明：21个化合物中,3个化合物抑制exoS基因表达,2个化合物则促进exoS基因表达。此外,化合物TS128、TS143和TS160对菌株生长有明显的抑制作用。Western blot实验进一步证实筛选得到的化合物TS108、TS128和TS165可抑制ExoS的产生;化合物TS139和TS143则促进ExoS的产生。为进一步研究抑制剂的作用机理,过量表达TTSS主要的调控因子exsA基因可部分消除抑制剂TS108和TS165的抑制效果;而rsmZ rsmY双基因突变体PAO6421中添加抑制剂TS108和TS165并不能显著抑制exoS基因的表达,同样,抑制剂TS108和TS165也不影响受Gac/Rsm信号传导系统调控的群体感应信号分子的产生。【结论】抑制剂TS108和TS165的作用机制可能主要是影响esxA基因,从而影响exoS基因表达及蛋白产量。     

肉桂酸衍生物对铜绿假单胞菌PAO1 Ⅲ型分泌系统的影响

【目的】铜绿假单胞菌是引起医院获得性感染最常见的条件致病菌,而Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,TTSS)是其致病的主要因子之一。本文从合成的21个肉桂酸衍生物中筛选影响TTSS效应子(Effector)产生的化合物,并初步研究其作用机制。【方法】将TTSS效应子合成基因exoS的转录报告质粒pAT-exoS转入菌株PAO1中,获得PAO1(pAT-exoS)。待筛选的化合物与PAO1(pAT-exoS)菌株共培养6 h后,检测exoS基因的表达,从中筛选影响exoS基因表达的化合物。【结果】筛选结果表明:21个化合物中,3个化合物抑制exoS基因表达,2个化合物则促进exoS基因表达。此外,化合物TS128、TS143和TS160对菌株生长有明显的抑制作用。Western blot实验进一步证实筛选得到的化合物TS108、TS128和TS165可抑制ExoS的产生;化合物TS139和TS143则促进ExoS的产生。为进一步研究抑制剂的作用机理,过量表达TTSS主要的调控因子exsA基因可部分消除抑制剂TS108和TS165的抑制效果;而rsmZ rsmY双基因突变体PAO6421中添加抑制剂TS108和TS165并不能显著抑制exoS基因的表达,同样,抑制剂TS108和TS165也不影响受Gac/Rsm信号传导系统调控的群体感应信号分子的产生。【结论】抑制剂TS108和TS165的作用机制可能主要是影响esxA基因,从而影响exoS基因表达及蛋白产量。     

铜绿假单胞菌pcr2基因功能的研究

Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system,TTSS)是铜绿假单胞菌的重要致病因子,pcr2基因位于TTSS基因簇中popN操纵子的第三位,有关该基因的具体功能研究还是空白。首先,本研究采用定点诱变方法构建pcr2-突变体,发现TTSS表达和分泌ExoS和ExoT蛋白的能力显著下降,在HeLa细胞感染实验中,ExoS和ExoT蛋白注入细胞的数量明显低于野生型菌株。其次,我们采用细菌双杂交系统研究了Pcr2蛋白与其它蛋白结合的可能性,发现Pcr2蛋白与PscB蛋白一起能够结合PopN蛋白,同时Western blot实验发现Pcr2蛋白能够调控PopN蛋白的分泌。最后,实验发现Pcr2蛋白本身也能够分泌到细胞外,可能与TTSS分泌器的早期形成过程有关。     

铜绿假单胞菌pcr2基因功能的研究

Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system,TTSS)是铜绿假单胞菌的重要致病因子,pcr2基因位于TTSS基因簇中popN操纵子的第三位,有关该基因的具体功能研究还是空白。首先,本研究采用定点诱变方法构建pcr2-突变体,发现TTSS表达和分泌ExoS和ExoT蛋白的能力显著下降,在HeLa细胞感染实验中,ExoS和ExoT蛋白注入细胞的数量明显低于野生型菌株。其次,我们采用细菌双杂交系统研究了Pcr2蛋白与其它蛋白结合的可能性,发现Pcr2蛋白与PscB蛋白一起能够结合PopN蛋白,同时Western blot实验发现Pcr2蛋白能够调控PopN蛋白的分泌。最后,实验发现Pcr2蛋白本身也能够分泌到细胞外,可能与TTSS分泌器的早期形成过程有关。     

铜绿假单胞菌PAO1中c-di-GMP代谢相关基因PA0575对表型的影响

【背景】铜绿假单胞菌PAO1中存在与环鸟苷二磷酸(cyclic-di-guanosine monophosphate,c-di-GMP)代谢相关基因PA0575。【目的】探讨铜绿假单胞菌PAO1中环鸟苷二磷酸代谢相关基因PA0575对运动能力及生物膜的影响。【方法】通过PCR对菌株遗传背景进行确认;利用刚果红结合实验及电转PcdrA-gfp质粒间接测量胞内c-di-GMP水平;利用泳动性(swimming)、蜂群泳动(swarming)、蹭行运动(twiching)和生物膜定量实验对细菌进行表型分析,并在运动培养基中添加抗生素研究其对运动能力的影响;针对PA0575基因进行融合蛋白表达载体的构建,并对蛋白进行原核诱导表达。【结果】3株突变体菌株的转座子插入突变位点不一致,胞内c-di-GMP水平检测结果显示,PA0575-1菌株的c-di-GMP含量高于野生型PAO1菌株(P0.05),PA0575-2、PA0575-3菌株胞内c-di-GMP水平与野生型PAO1菌株无差异(P0.05)。运动能力检测实验中,与野生型PAO1菌株相比,PA0575-1菌株泳动性增强(P0.05);PA0575-2、PA0575-3菌株的泳动性、蜂群运动均增强(P0.05);该基因不同位点的突变均导致氯霉素对菌株的运动能力产生抑制作用。生物膜定量结果显示,与野生型PAO1菌株相比,细菌培养18 h后PA0575-1的生物膜含量降低(P0.05),PA0575-2、PA0575-3菌株的生物膜含量升高。最后成功构建了PA0575基因不同结构域的8个表达载体,并获得了异源表达蛋白。【结论】PA0575基因降低铜绿假单胞菌胞内c-di-GMP的水平,影响表型的同时也抑制了氯霉素抗性基因的表达。以上研究为PA0575基因对表型的影响奠定了基础。     

铜绿假单胞菌PAO1中c-di-GMP代谢相关基因PA2072的生物学分析

【背景】铜绿假单胞菌为革兰氏阴性杆菌,是医院感染的常见条件致病菌之一。广泛存在于细菌中的第二信使分子环鸟苷二磷酸(cyclic-di-guanosine monophosphate,c-di-GMP)对细菌生理生化功能具有重要的调节作用。铜绿假单胞菌PAO1中存在参与c-di-GMP代谢的基因PA2072。【目的】探讨铜绿假单胞菌PAO1中c-di-GMP代谢相关基因PA2072的生物学功能。【方法】运用PCR及分子克隆技术构建PA2072基因及各结构域的自杀载体,运用基因敲除方法获取PA2072基因的3个突变株;利用泳动性(swimming)、蜂群运动(swarming)、蹭行运动(twitching)和生物膜定量实验对细菌进行初步的表型分析,进一步通过刚果红染色法对菌株进行分析。【结果】成功构建PA2072基因敲除突变菌株及回补菌株;生物膜定量结果发现基因PA2072的敲除会影响细菌生物膜的形成,PA2072蛋白的不同结构域对生物膜的合成也起到了重要作用;细菌运动能力检测中发现PA2072相关基因的敲除对细菌运动能力也有一定影响。刚果红平板检测结果显示,与野生型PAO1菌株相比,P...     

铜绿假单胞菌pfm基因对三型分泌系统效应蛋白的影响

[目的]检测铜绿假单胞菌基因pfm对三型分泌系统效应蛋白的影响.[方法]构建pfm基因互补菌株pfmC.提取野生株PAO1、敲除株Δpfm和互补株pfmC的RNA,利用Real-time PCR从转录水平检测效应蛋白ExoS、ExoT和ExoY转录水平的变化.以ExoS为代表,检测细胞内和分泌到细胞外效应蛋白的含量.收集铜绿假单胞菌PAO1、Δpfm和pfmC菌体内和分泌到细胞外的总蛋白,利用ExoS多克隆抗体进行Western杂交,特异检测ExoS的蛋白水平.[结果]与野生型相比,Δpfm中exoS、exoT和exoY转录水平明显降低,而pfmC中这3个蛋白的转录水平得到回补.Δpfm菌体内和分泌到细胞外的ExoS量均明显低于野生株PAO1,pfmC细胞内和细胞外分泌的ExoS蛋白量均得到恢复.[结论]铜绿假单胞菌基因pfm会影响三型分泌系统效应蛋白的水平.     

苏云金芽胞杆菌bkd基因簇的转录调控

【目的】通过分析苏云金芽胞杆菌bkd基因簇的转录调控和bkdR突变体的表型特征,明确bkdR所在基因簇的转录调控机制和对Cry蛋白产量的影响。【方法】通过生物信息学方法分析bkdR所在基因簇的结构,RT-PCR分析基因簇的转录单元,采用同源重组技术敲除苏云金芽胞杆菌HD73菌株的bkdR基因,利用启动子融合lacZ的方法分析启动子的转录活性。利用总蛋白定量确定Cry1Ac蛋白产量。【结果】bkd基因簇由8个基因组成,其中ptb-bkdB7个基因组成1个转录单元。ptb基因的启动子转录活性在sigL和bkdR突变体中均明显降低。bkdR基因的缺失对菌体生长、芽胞形成率和Cry1Ac蛋白产量无影响,但使运动能力减弱。【结论】bkd操纵子受Sigma 54控制,并由BkdR激活,bkdR基因的缺失对Cry蛋白产量无影响,对菌株的运动能力有影响。     

铜绿假单胞菌PA1550基因对泳动及蹭动的影响

【目的】：研究与铜绿假单胞菌运动能力相关的基因。【方法】：以一株临床分离的铜绿假单胞菌PA68做受体菌,应用人工Mu转座技术建立了库容为2000的突变子文库,从中筛选出泳动能力和蹭动能力丧失或减弱的突变子,通过基因克隆、测序,GenBank BLAST比对测序结果,互补基因表达确定与铜绿假单胞菌运动能力相关的基因。【结果】：突变子Y46在丧失了泳动运动能力的同时,蹭动能力也发生了减弱。在Y46突变子中,Mu转座子插入到功能完全未知的基因PA1550中。对极性效应及PA1550所在操纵子的分析表明,Mu转座子对插入点下游的基因的转录并不造成影响。【结论】：PA1550与铜绿假单胞菌的泳动及蹭动能力有关。     

单增李斯特菌二硫键形成蛋白DsbG介导酸耐受及鞭毛运动性调控北大核心

【目的】本研究旨在通过构建单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)二硫键形成蛋白编码基因dsbG缺失株和回补株,探究该蛋白在酸耐受和鞭毛介导的运动性中发挥的生物学功能。【方法】利用同源重组方法构建单增李斯特菌dsbG缺失株和回补株,比较野生株和突变株在不同pH梯度培养基条件下的生长速率和存活率;通过实时荧光定量PCR方法,比较致死酸应激条件下野生株和缺失株酸耐受基因转录水平。通过半固体培养基、荧光定量PCR方法和鞭毛负染色透射电镜观察,比较野生株和突变株的运动能力、鞭毛相关基因转录水平变化和鞭毛形态差异。【结果】与野生株相比,dsbG缺失株的生长能力和速率差异不显著;在pH 3.5(盐酸和柠檬酸)培养条件下,存活率显著降低;精氨酸合成途径基因argD和argF转录水平分别下调2.4和3.7倍。同时,dsbG缺失株的运动能力减弱,且鞭毛形成相关的flaA、flgB和flgD等基因转录水平显著下调(分别为29.7、6.7和6.9倍),鞭毛形成能力减弱。【结论】本研究首次证实了单增李斯特菌二硫键形成蛋白DsbG能感应低pH应激,并形成耐受;证实了DsbG通过调控鞭毛相关基因的转录进而影响细菌的鞭毛形成和运动性。本研究有助于深入了解二硫键形成蛋白家族介导单增李斯特菌环境适应的分子机制,为食源性致病菌的防控提供理论基础。     

vcrV基因对副溶血弧菌生物学特性及III型分泌系统1效应蛋白易位的影响

【背景】副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)具有两套III型分泌系统(typeIIIsecretion system,T3SS)。T3SS1通过向宿主细胞分泌效应蛋白发挥致病作用,vcrV基因位于T3SS1编码基因簇。【目的】以vcrV基因为研究对象,探索其对副溶血弧菌生物学特性及T3SS1致病机制的影响。【方法】以副溶血弧菌POR-1株为参考菌株,利用同源重组技术构建vcrV基因缺失株ΔvcrV和回补株CΔvcrV,比较各菌株在生长性能、生物被膜形成能力、细胞黏附及细胞毒性等生物学特性的差异,应用Western Blot检测T3SS1诱导条件下POR-1、ΔvcrV和CΔvcrV等菌株效应蛋白分泌量,进一步利用具有过表达载体pMMB207-vp1683-CyaA的各菌株侵染HeLa细胞,通过Western Blot检测细胞内效应蛋白VopR(Vp1683)的易位量。【结果】与基础菌株POR-1相比,缺失vcrV基因不影响副溶血弧菌的生长性能、生物被膜形成能力及细胞黏附等生物学特性,显著降低了对HeLa细胞的毒性作用,具有过表达载体的POR-1、ΔvcrV和CΔv...     

Bt群体信号应答因子nprR基因的缺失对cry1Ac基因表达的影响

摘要：【目的】研究群体信号应答蛋白编码基因nprR在苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）HD-73菌株晶体蛋白形成过程中的作用。【方法】通过同源重组,构建了HD-73 nprR基因缺失突变菌株HD73（ΔnprR ）。利用启动子-lacZ融合、SDS-PAGE方法,测定不同培养基中nprR基因转录活性及nprR基因缺失对cry1Ac转录及表达的影响。【结果】启动子转录活性分析表明,在LB和SSM培养基中nprR基因从对数期结束（T0）开始表达,稳定期持续表达。在LB培养基中,nprR基因的缺失使cry1Ac基因在生长过渡期和稳定期前期转录活性显著提高,同时HD73（ΔnprR ）菌株Cry蛋白生成量也明显高于出发菌株HD-73,但是在芽胞形成释放后,Cry蛋白的表达没有明显的区别。【结论】在丰富培养基中苏云金芽胞杆菌nprR基因的缺失在生长过渡期和稳定期前期能够提高cry1Ac基因转录和表达,从而缩短了cry基因表达时间,并且Cry蛋白总产量与出发菌株相当。     

CodY在单核细胞增生李斯特菌运动和毒力方面的作用

目的:探究全局性转录调控因子CodY在单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)鞭毛运动和细菌毒力方面的作用。方法:通过同源重组的方法敲除Lm染色体上CodY的编码基因codY并成功构建缺失菌株的回复菌株;利用平板泳动法观测鞭毛运动的变化,RT-qPCR检测与鞭毛运动相关基因的转录表达;比较野生型菌株EGDe与CodY缺失菌株对细菌溶血活性、棉铃虫幼虫的半致死剂量和主要的毒力因子LLO和毒力基因调控蛋白PrfA转录表达的影响。结果:同野生型菌株相比,CodY缺失菌株鞭毛运动和相关基因,以及主要的毒力因子LLO和PrfA的转录表达显著降低(P≤0.01),溶血活性显著降低(P≤0.01),对棉铃虫幼虫的半致死剂量上升了5.8倍。结论:CodY在Lm鞭毛运动和细菌毒力调控方面具有重要作用。     

破坏细胞壁蛋白CWP2基因提高重组酿酒酵母β-葡萄糖苷酶胞外酶活

【背景】重组酿酒酵母广泛应用于生产工业酶和药用蛋白,但是目前仍旧存在异源蛋白产量低、分泌效率差的问题,限制了生产应用。【目的】提高重组酿酒酵母异源分泌蛋白的能力,构建高效的异源蛋白生产细胞工厂。【方法】采用基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术,以生产β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母Y294-BGL为出发菌株,构建细胞壁蛋白基因CWP2破坏菌株。【结果】与出发菌株相比,破坏CWP2的破坏菌株在发酵96 h时胞外β-葡萄糖苷酶酶活可提高53%,胞内酶活提高了208%。此外,破坏菌生长未受到影响,对弱酸等环境胁迫的耐性没有下降,未造成过多内质网胁迫。进一步检测发现,破坏菌株胞内活性氧水平下降,同时蛋白胞内运输和分泌途径相关的关键基因表达转录及多个细胞壁生物合成相关基因表达下降。【结论】破坏细胞壁蛋白基因CWP2能够提高异源蛋白β-葡萄糖苷酶的胞外酶活,可作为促进酿酒酵母生产异源蛋白的靶点基因。     

苏云金芽胞杆菌dxr1基因的转录受SigH控制

【目的】萜类化合物广泛分布在生物界,是重要的生命物质。目前发现有两条萜类化合物的生物合成途径,即甲羟戊酸(MVA)途径和2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径。MEP代谢途径中的关键酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构化酶(DXR,EC1.1.1.267)催化1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸生成MEP。枯草芽胞杆菌中dxr基因编码DXR酶,而在苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)中有2个基因(dxr1和dxr2)编码DXR酶。通过分析BtHD73菌株的dxr1基因的转录活性和dxr1突变体表型,明确dxr1基因的转录调控机制和功能。【方法】通过5?RACE分析dxr1的转录起始位点;β-半乳糖苷酶活性测定分析dxr1基因启动子(Pdxr1)的转录活性;采用同源重组技术分别敲除BtHD73菌株的dxr1和dxr2基因;利用总蛋白定量确定Cry1Ac蛋白产量;利用DXR检测试剂盒检测Bt菌株的DXR活性。【结果】dxr1基因的转录起始位点位于起始密码子上游39 bp处的G碱基;与出发菌株HD73相比,Pdxr1在sig H突变体中的转录活性明显降低;dxr1或dxr2基因的缺失对菌体生长、芽胞形成率和Cry1Ac蛋白产量无显著影响,但使DXR活性下降。【结论】Bt中dxr1基因的转录受Sig H控制,dxr1基因的缺失影响DXR的活性。     

花生根瘤菌Bradyrhizobium sp.MZ5 Ⅲ型分泌系统调节基因ttsI突变体的功能分析

【目的】探究慢生型花生根瘤菌Ⅲ型分泌系统在花生-根瘤菌互作的功能。【方法】本研究采用同源重组和三亲本接合转移的方法,构建Bradyrhizobium sp. MZ5的Ⅲ型分泌系统调节基因ttsI突变体;荧光定量PCR检测添加大豆苷元(Daidzein)和染料木黄酮(Genistein)诱导物后野生型和突变株转录水平上ttsI的表达量变化及其差异;蛭石结瘤实验分析ttsI基因突变对花生结瘤能力的影响。【结果】在转录水平上,大豆苷元和染料木黄酮对MZ5的Ⅲ型分泌系统调节基因ttsI的表达具有显著的抑制作用(P0.05)。在MZ5△ttsI突变体中ttsI基因的表达量都明显下调,与野生型菌株的相比都达到极显著水平(P0.001)。蛭石结瘤实验表明,与野生型菌株相比,MZ5△ttsI突变体在不同花生品种的结瘤数和地上部干重都显著性降低。根瘤石蜡切片表明,MZ5△ttsI突变体在根瘤内的含菌量少于野生型菌株。【结论】Bradyrhizobium sp. MZ5菌株中的Ⅲ型分泌系统在花生-根瘤菌互作中对结瘤有积极的促进作用。     

铜绿假单胞菌cntRLMN操纵子介导锌离子摄取的功能鉴定

【目的】本研究以铜绿假单胞菌PAO1 (Pseudomonas aeruginosa PAO1,菌种编号ATCC15692)为对象,研究cntRLMN在锌离子摄取中的功能。【方法】在ΔznuBC的基础上,以同源重组的方法构建了cntRLMN的各种突变菌株,通过质粒接合转移的方法构建其互补菌株及lacZ转录融合报告菌株,运用β-半乳糖苷酶酶活检测研究了Zur蛋白对cntRLMN的转录调控,凝胶阻滞实验(EMSA)检验Zur蛋白与cnt启动子及cnt启动子的突变片段的体外结合,并进一步通过生长曲线分析对cntRLMN中cntR、cntL、cntN等基因的锌离子摄取功能进行了分析和鉴定。最终,通过构建大蜡螟幼虫的侵染模型来研究cntRLMN对铜绿假单胞菌毒力发挥的影响。【结果】lacZ转录融合的酶活分析显示cntRLMN受Zur蛋白的负调控,其表达以Zur蛋白依赖的方式受锌离子饥饿的诱导;EMSA实验的结果显示cntRLMN的启动子可以与His-Zur结合形成DNA-蛋白质复合体,结合位点为GCGTTATAGTATATCAT;生长曲线和大蜡螟幼虫侵染实验的分析结果显示ZnuBC和CntRLMN的功能存在互补性,仅znuBC和cntRLMN双缺失突变时菌株在限锌培养条件下的生长和对大蜡螟幼虫的毒性才受到显著抑制,说明CntRLMN代表另一种独立的锌离子摄取系统。【结论】cntRLMN是受Zur直接负调控的另一种独立的铜绿假单胞菌锌离子摄取系统,对铜绿假单胞菌毒力的发挥起重要作用。     

MHF组蛋白折叠复合体组分编码基因MHF1过表达对重组酿酒酵母纤维素酶生产的影响

【背景】重组酿酒酵母可用于生产多种药用蛋白和工业酶等外源蛋白,但蛋白分泌水平低是限制其异源蛋白高效生产的重要因素。异源蛋白表达和分泌过程可能会对宿主细胞产生多种胁迫,因此,研究胁迫响应相关基因对重组酵母异源蛋白生产的影响具有重要意义。Mhf1p是MHF组蛋白折叠复合体的组分之一,与DNA损伤修复及维持基因组稳定性有关,但其对异源蛋白生产的作用尚不清楚。【目的】研究MHF1过表达对重组酿酒酵母蛋白生产的影响。【方法】在分泌表达纤维素酶的重组酿酒酵母菌株中利用基于CRISPR-Cas9的基因组编辑技术整合过表达MHF1,分析其对产酶的影响,并探讨影响产酶的分子机理。【结果】与出发菌株相比,过表达MHF1菌株的外切纤维素酶CBH酶活性提高了38%。对过表达MHF1的CBH生产菌株中蛋白合成和分泌途径相关基因转录水平进行检测,发现与对照菌株相比,CBH1基因和与分泌相关的SEC22、ERV29等基因在不同时间点呈现不同程度显著上调。【结论】MHF1过表达可促进酿酒酵母异源外切纤维素酶的生产,并影响外源酶基因和分泌途径基因的表达,可能通过对多基因的协同表达影响促进产酶。     

法氏囊活性五肽BP5的抗肿瘤作用

【目的】法氏囊活性五肽Bursopentin(BP5)是一种多功能生物学活性因子,不仅具有免疫调节和抗氧化功能,还具有抗肿瘤活性。目前,BP5发挥抗肿瘤生物功能的作用机制尚不清晰。【方法】本研究利用T7噬菌体展示技术构建鸡DT40细胞T7噬菌体c DNA文库,以BP5-BSA为靶分子对文库进行亲和淘选,通过序列测定和生物信息学分析,获得BP5的结合蛋白。通过分析BP5诱导的鸡DT40细胞mRNA基因表达谱和检测BP5对HCT116细胞中p53 Luciferase活性和p53信号通路中相关蛋白表达的影响来探讨BP5抗肿瘤的作用机制。【结果】构建的鸡DT40细胞T7噬菌体c DNA文库原始滴度为1.2×104pfu/m L,重组率为91.7%,扩增后滴度为1.9×109pfu/m L;通过生物淘选获得3条与BP5结合的鸡源蛋白血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A)、细胞周期蛋白E1(cyclin E1)和运输蛋白颗粒复合体2(trafficking protein particle complex 2)。基因表达谱分析结果显示,BP5参与调节多条与抗肿瘤功能有关的通路,其中包括p53信号通路,且p53信号通路涉及的5个差异表达基因均与细胞周期调控或抗肿瘤相关,其中SIAH1、TP53(p53)、CIP1(p21)基因被上调,CHEK2、CCNE1基因被下调。RT-PCR方法检测10个表达水平有明显变化的差异基因,其结果与基因芯片分析结果相符;BP5对p53 Luciferase活性的影响实验结果显示,BP5在0.2-20μg/m L浓度下能够明显提高HCT116细胞中p53相对Luciferase活性,Western blotting结果证实,BP5能显著促进p53、p21蛋白的表达水平,而CCNE1和CHEK2蛋白的表达水平则明显降低。【结论】本研究结果表明BP5通过p53信号通路途径发挥其抗肿瘤生物学功能,为进一步研究BP5抗肿瘤具体的分子机制提供了参考依据。