改良逆转录环介导等温扩增检测技术快速实时检测H9亚型禽流感病毒

利用改良逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)技术建立一种快速、灵敏的检测方法用于H9亚型禽流感病毒检测。根据H9亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因保守区序列中的8个区段设计6条特异性引物,在恒温条件下进行核酸扩增反应,并以琼脂糖凝胶电泳和目视检查绿色荧光两种方法对扩增结果进行判定。结果表明,RT-LAMP的最小检测限为100 fg,灵敏度比PT-PCR高100倍,且与H5亚型、H7亚型禽流感病毒,新城疫病毒(NDV)无交叉反应。目视检查绿色荧光与常规琼脂糖凝胶电泳的判定结果一致。整个扩增检测过程在35 min内即可完成。利用临床样本对RT-LAMP法进行验证,结果与RT-PCR一致。由实时浊度分析得到的标准曲线,计算出临床样本中的病毒质粒拷贝数均在2×107-2×104之间。因此,本研究建立的RT-LAMP方法快速、灵敏、特异性强,是H9亚型禽流感病毒的一种高效检测方法。     

口蹄疫病毒RT-LAMP检测方法的建立

利用逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP),建立了口蹄疫病毒快速检测方法,同时评价了该方法的灵敏性和特异性。结果表明,根据口蹄疫病毒多聚蛋白基因保守区段设计的LAMP引物能够在65℃下,1 h内实现目标核酸区段的大量扩增,检测结果可直接用肉眼判断。该检测体系具有极高的特异性,只能检测到目标病毒,与其他类似病毒如猪水泡病病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒等无交叉反应,可检测到10-5稀释度的目标病毒核酸量,比普通RT-PCR的灵敏性高100倍,比荧光PCR高10倍。     

利用RT-LAMP可视化检测技术检测H1亚型禽流感病毒及N1、N2亚型的分型

为直接根据颜色变化进行可视化检测H1亚型、N1亚型、N2亚型禽流感病毒(AIV),根据环介导等温扩增技术(LAMP),建立针对H1亚型AIV及特异性鉴定N1、N2亚型的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。根据GenBank中的AIV基因序列,设计了三套分别针对H1亚型AIV-HA基因及N1、N2亚型AIV-NA基因的特异性简并引物,并优化反应条件和体系。结果表明建立的检测方法对其它亚型AIV及禽呼吸道病原体无交叉扩增反应并能特异性地检测N1、N2亚型AIV,灵敏度优于传统的RT-PCR方法。整个反应在常规水浴中50min就可完成,反应结束后不需打开反应管盖,可根据反应液的颜色变化对结果直接进行判定。120份临床样品用建立的RT-LAMP方法检测到14份H1N1亚型AIV、8份H1N2亚型AIV,结果与病毒分离结果相符。本研究建立的三种RT-LAMP可视化检测技术特异、灵敏、快速、操作和结果判定简便,适合在基层进行H1亚型AIV的快速检测及N1、N2亚型AIV的分型。     

逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)在H5N1禽流感病毒基因检测中的应用

建立一种便捷、灵敏的检测方法,即逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)用于H5N1亚型禽流感病毒基因检测.该技术使用特异对应于靶序列中8个基因区段的6条特异引物,在等温条件下进行核酸扩增反应.对51份实验感染动物及病毒培养标本的H5N1亚型禽流感病毒的HA、NA基因区进行了RT-LAMP检测,并以SYBR Green Ⅰ为反应指示剂进行了逆转录环介导等温核酸扩增技术,对该反应进行实时监控,经对扩增产物做内切酶验证和测序分析,证明RT-LAMP技术的特异性;同时,用10倍系列稀释的RNA样品对该检测方法的灵敏度进行了测试.结果显示:利用RT-LAMP技术成功检测到H5N1禽流感病毒的HA、NA基因区,且RT-LAMP与Real-time PCR结果呈现很好的一致性.此方法的灵敏度可达到能检测10个拷贝RNA分子水平.因此,RT-LAMP技术应用于H5N1亚型禽流感病毒的快速检测是一种可行的方法.     

H5N1禽流感病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立

目的：建立H5N1禽流感病毒环介导等温扩增（LAMP）快速检测方法。方法：从GenBank中获得H5N1禽流感病毒血凝素（HA）基因序列,应用DNAStar软件MegAlign程序分析其序列,利用PrimerExplorerV3软件在序列保守区域设计LAMP引物,即外引物、内引物和环引物,同时以所克隆的阳性质粒为模板,对试验中的几个重要参数进行优化。结果：LAMP检测方法对H5N1禽流感病毒的灵敏度达到4～6个拷贝,其引物对于H1、H9亚型禽流感病毒和新城疫病毒无非特异性扩增,表现出良好的H5亚型特异性。结论：建立的H5N1禽流感病毒环介导等温扩增快速检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,为快速检测禽流感病毒提供了新方法和新思路。     

犬瘟热病毒RT-LAMP检测方法的建立和初步应用

目的利用环介导等温扩增（LAMP）技术建立一种检测犬瘟热病毒感染的新方法。方法根据GenBank中NP基因序列,设计4条LAMP特异性引物,对反应条件、特异性、可视化效果和应用效果进行研究。结果在60℃等温的条件下、1 h内可完成RT-LAMP扩增过程;特异性和可视效果良好;对63份临床标本进行检测,阳性检出率为71.4%（45/63）,检出率高于RT-PCR的63.5%（40/63）。结论建立的RT-LAMP检测方法,显示了较高的特异性和敏感性,而且兼具高效、快捷、可视化的优势,为临床检测犬瘟热病毒感染提供了一种快速简便的新途径。     

湖南湖北两省H6亚型禽流感病毒表面基因的序列分析

2008年至2009年间,在湖南和湖北两省的活禽市场中分离到了14株H6亚型禽流感病毒,为了解这14株病毒之间的分子特征和差异,我们运用PCR和测序鉴定对这14株病毒的NA基因进行了分型,并对其表面基因HA和NA进行序列测定及序列分析.14株H6亚型病毒中,H6N2亚型12株,H6N6亚型2株.序列测定和进化分析结果显示:DK/HN/284的HA基因与其它13株的HA差异性较大,差异性达到19.4%～20.2%,其余13株毒同源性在94.2%～99.9%;N2亚型NA基因的同源性在91.1%～99.9%,差异性比较大;两株N6亚型NA基因同源性为89.5%,差异明显.这些数据表明:不同毒株呈现一定的地域性差异.与我国周边其它地区的H6亚型禽流感毒株序列进行比较发现,只有DK/HN/284的HA基因与香港早期的毒株可能有着共同的来源,其余都与香港和韩国等的毒株有着较大的差异性,并且各个毒株的HA基因上潜在的糖基化位点和受体结合位点也有所不同,这些数据表明,这些毒株表现出明显的异源性.     

1株H6N6亚型禽流感病毒分子遗传特性分析

本研究采用无特定病原体(specific pathogen free,SPF)鸡胚,从某活禽市场环境中分离出1株H6N6亚型禽流感病毒(A/environment/Zhenjiang/zj18/2013,en/zj18)。通过二代测序技术进行全基因组测序,通过BLASTn 进行同源性检索,并采用MEGA5.0软件构建系统发生树。基因进化树分析表明,分离株en/zj18的所有8个基因节段(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS)均与近年来中国华东地区流行的H6N6亚型禽流感病毒的相应基因位于同一进化分支,与参考株的核苷酸同源性达96.7%～99.6%。分离株en/zj18的HA蛋白裂解位点为PQIETR↓GL,是低致病性禽流感病毒的分子特征。HA蛋白上关键受体结合位点190和228位(按H3亚型的HA蛋白序列排序)氨基酸分别是E和G,理论上更易与α2,3-半乳糖苷唾液酸受体结合。结果提示,需加强活禽市场禽流感病毒的持续监测,从而为有效应对禽流感病毒对公共卫生的持续威胁提供科学依据。     

H7亚型禽流感病毒一步法RT-PCR检测方法的建立

通过分析流感数据库45个H7亚型禽流感病毒的HA序列,在保守区内设计并合成引物,建立了一步法RT-PCR检测方法,扩增片段大小为501bp。通过对H7亚型禽流感病毒尿囊液和棉拭子浸出液不同滴度检测,证实病毒尿囊液最低检出量为105.5EID50/mL;阳性棉拭子最低检出量为103EID50/mL。用该方法检测H1～H15亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他14种禽病病原进行检测,仅有H7亚型AIV有特异性目的条带,与其他均无交叉反应。从脏器及咽喉、泄殖腔棉拭子样品的病毒分离和RT-PCR方法比较,表明在10-1的样品浓度下,两者可以达到相同的检出量。表明该一步法RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高和准确率高的特点。     

H5N8亚型高致病性禽流感病毒的全球流行概况

H5N8亚型高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV)随候鸟的迁徙活动及商业贸易活动现已蔓延至亚洲、欧洲、非洲、美洲等国家和地区.2014-2015和2016-2019年H5N8亚型HPAIV已引发两波全球疫情,现正经历第三波疫情,导致家禽及野生鸟类...     

番鸭源H6N6亚型禽流感病毒全基因组的分子特征

【目的】为了丰富水禽源禽流感病毒的分子流行病学资料,明确我国国内首次分离的番鸭源H6N6亚型禽流感(Avian influenza virus,AIV)病毒A/Muscovy Duck/Fujian/FZ01/2008(H6N6)(以下简称MD/FJ/F1/08)全基因组的分子特征,弄清该病毒的遗传进化特点。【方法】对其8个基因片段分别进行扩增和序列测定,并利用分子生物学软件对测序结果进行序列分析。【结果】MD/FJ/F1/08的HA裂解位点附近的氨基酸序列为PSMKVIV↓GL,为非连续的碱性氨基酸,其静脉接种指数(the intravenoys pathogenicity index,IVPI)为0.15,推测其为一株低致病力AIV。其HA基因、NP基因、M基因和PB2基因均与我国台湾分离株A/duck/Kingmen/E322/04(H6N2)该基因的核苷酸同源性最高,分别高达94.2%、95.7%、97.2%和95.6%,均处于同一遗传进化分支。其NA基因和我国远东分离株A/duck/Eastern China/01/2007(H4N6)同源性最高,达97.1%;其颈部有11个氨基酸的缺失(TNSTTTIINNN),为N6亚型神经氨酸酶基因中首次报道,在遗传进化上和H4N6亚型AIV的NA基因处于相同的分支。NS基因和香港地区分离株A/duck/HongKong/3600/99(H6N2)同源性最高,达96.1%;PB1和PA均与高致病性禽流感病毒株A/duck/HongKong/140/1998(H5N1)同源性最高,达95.6%和96.7%。且MD/FJ/F1/08的8基因与H6N6亚型流感病毒北美洲分离代表株均不处在同一遗传进化分支上,相互之间遗传关系较远。【结论】MD/FJ/F1/08可能是由H6N2、H4N6和H5N1等多亚型AIV基因重组而成。     

一种更灵敏的特异性检测H9亚型禽流感抗体的间接ELISA方法的建立

H9亚型禽流感在全球范围内广泛流行,控制其传播需监测H9亚型禽流感病毒的感染情况及疫苗的免疫效果。为了建立便于检测且灵敏特异的H9亚型禽流感抗体间接ELISA方法,本实验利用不同亚型之间变异较大的H9亚型禽流感病毒HA蛋白的头部球状区作为包被抗原,确定了最佳复合封闭液和抗体稀释液,提高了其特异性。结果显示建立的ELISA方法灵敏度高于血凝抑制试验(HI),且与H3N2、H5N2、H7N9亚型流感病毒及新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)和产蛋下降综合征病毒(EDSV)的阳性血清均无交叉反应。另外,利用该方法及HI试验对200份临床鸡血清样本进行检测,两种检测方法的符合率达97%,且存在较高的相关性(R2=0.981 1)。     

人感染H7亚型禽流感事件

本研究综述了自1959年以来国内外发生的人感染H7亚型禽流感事件。大多数是在家禽爆发禽流感期间,农场工人在处置感染鸡群过程中被暴露而感染;也有曾接触活禽或曾到过活禽市场而感染;有经禽流感病毒致病的哺乳动物（海豹）感染于人或实验室感染（事故）所致。引起人感染的H7亚型中已知有H7N2、H7N3、H7N7以及2013年在中国发现的新的致病亚型H7N9。H7N2、H7N3、H7N7感染以结膜炎为主,大多为轻症;而H7N9感染以严重的呼吸道感染为特征,表现为重症肺炎,呼吸窘迫综合症,病死率高达33.6%。     

Quantum‐dots‐based fluoroimmunoassay for the rapid and sensitive detection of avian influenza virus subtype H5N1

The continuous spread of highly pathogenic avian influenza virus (AIV) subtype H5N1 is threatening the poultry industry and human health worldwide. Rapid and sensitive diagnostic methods are required for the H5N1 surveillance. In this study, the fluorescent (FL) probe of CdTe quantum dots (QDs) was designed using covalently linked rabbit anti‐AIV H5N1 antibody. Based on these QD–antibody conjugates, a novel sandwich FL‐linked immunosorbent assay (sFLISA) was developed for H5N1 viral antigen detection. The sFLISA allowed for H5N1 viral antigen determination in a linear range of 8.0 × 10^?3 to 5.1 × 10^?1 μg mL^?1 with the limit of detection (LOD) of 1.5 × 10^?4 μg mL^?1. In comparison with virus isolation for 103 clinic samples, the sensitivity and specificity of sFLISA were found to be 93.6 and 91.1% respectively. The sFLISA supplied a novel approach to rapid and sensitive detection of AIV subtype H5N1 and showed great potential for biological applications in immunoassays. Copyright © 2009 John Wiley & Sons, Ltd.     

H7亚型禽流感病毒与禽类和人类的关系

2013年在中国首次发生了H7N9亚型流感病毒感染人事件,已经证实H7N9型禽流感是一种新型禽流感,是全球首次发现感染人类的新亚型流感病毒,以往这种病毒只在野生鸟类存在和传播。H7N9型禽流感病毒属于H7亚型中的一种,全球感染人的H7亚型病毒主要分为两大支系,即北美支系和欧亚支系,感染人的流感亚型也主要集中在H7N7,H7N3,H7N2等亚型上。为了清晰的了解H7亚型病毒的来龙去脉,本文重点讨论了A亚型流感病毒的宿主分布、H7亚型病毒感染禽类和人类的历史、H7亚型病毒的生物学特性以及未来研究展望。