棉铃虫蛹期血淋巴的蜕皮甾类

目前为止仅在少数几种昆虫中研究过蛹期的蜕皮激素。关于蜕皮甾类的性质分析,结果也颇不一致。本文采用放射免疫分析、薄层层析、高压液相色谱及质谱对棉铃虫Heliothis armigera蛹血淋巴内的蜕皮激素进行了研究。结果如下:1.物理-化学方法证明蛹血淋巴内存在二种蜕皮甾类:蜕皮酮和20-羟基蜕皮酮。2.蛹期蜕皮甾类滴度呈一宽峰,高峰出现在化蛹后的第5天(3435ng/ml)。3.在高峰时,蜕皮酮与20-羟基蜕皮酮的比例为1:3.57,说明20-羟基蜕皮酮是主要的蜕皮甾类。4.比较雌雄两性蛹的蜕皮甾类滴度,未见明显差异。研究表明在棉铃虫中影响成虫发育的主要激素是20-羟基蜕皮酮而不是蜕皮酮。     

棉铃虫蜕皮调节转录因子在大肠杆菌中的重组表达及其包涵体纯化

蜕皮调节转录因子(hormone receptor 3,HR3)在昆虫蜕皮过程中启动蜕皮相关早期基因簇表达,并抑制蜕皮相关晚期基因簇表达,对昆虫蜕皮级联反应起着关键的调控作用。利用合成的特异性引物通过RT-PCR扩增了棉铃虫 Helicoverpa armigera 蜕皮调节转录因子(HHR3),并与pGEX-4T-1载体连接,在大肠杆菌Escherichia coli DH5α内进行扩增,经过PCR筛选获得了HHR3-pGEX-4T-1重组质粒。 用该质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21并进行诱导表达,获得了与谷胱甘肽-S转移酶（GST）融合表达的HHR3包涵体,分子量在94 kD左右,通过无离子去垢剂CAPS（3-［cyclohexylamino］-1-propanesulfonic acid）变性、复性后获得了可溶性GST-HHR3融合蛋白,经凝血酶裂解和SDS-PAGE分离得到纯化的HHR3,经蛋白质N-端测序确认表达正确。用重组表达的HHR3免疫家兔,制备了兔抗HHR3多克隆抗体,免疫印迹检测显示该抗体对HHR3有特异性识别能力, 可以用于HHR3功能与调控等下游研究。免疫印迹检测结果还表明,HHR3在5龄向6龄蜕皮的幼虫脂肪体中高表达,在进入6龄24 h 的幼虫脂肪体中含量明显下降,在6 龄72 h 的幼虫中肠中没有检测到HHR3表达;成虫卵巢中有HHR3表达。     

新型非甾醇蜕皮激素类杀虫剂对棉铃虫幼虫蜕皮的影响

用透射电镜技术研究了新型非甾醇蜕皮激素类杀虫剂W200013对棉铃虫4龄幼虫蜕皮的影响。结果表明W200013使棉铃虫产生早熟、致死的蜕皮。中毒试虫6 h表现出内表皮层沉积加快,皮细胞中粗面型内质网大量增加,糖原颗粒减少;12 h蜕皮间隙开始形成,细胞质凝集;24 h新、旧表皮同时存在,皮细胞空泡化严重;36 h新上表皮覆盖于仅沉积几层的新原表皮上,旧表皮仍然保持,皮细胞呈恶化、降解状态,宏观上虫体不表现出蜕皮行为而死亡。而且比较研究可见W200013在中毒症状、生物测定结果、超微结构水平与RH-5992具有相似的作用。     

滞育和非滞育棉铃虫血淋巴类固醇蜕皮素含量变化的比较

采用放射免疫分析法对不同时期的注定滞育和非滞育棉铃虫的血淋巴中的类固醇蜕皮素的含量进行了测定,发现在预蛹期间,注定滞育的棉铃虫的类固醇蜕皮素含量高于非滞育的棉铃虫,化蛹后,注定滞育的棉铃虫的类固醇蜕皮素含量则迅速降到极低的水平,明显低于非滞育棉铃虫。用20-羟基蜕皮素处理不同时期的滞育蛹,均能打破滞育。由此可见,类固醇蜕皮素含量的降低或缺乏乃是导致棉铃虫滞育的关键因子之一。     

棉铃虫各龄期酯酶同工酶的比较

用高分辨率的薄层等电聚焦对棉铃虫各龄期幼虫的酯酶同工酶进行了比较,结果发现棉铃虫各龄幼虫都有10种相同的酯酶同工酶,它们的pl集中在pH3．5—5,5范围内。本文还从方法学的几个方面进行了探讨。     

20-羟基蜕皮酮对棉铃虫免疫系统的影响

20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)是昆虫生长发育的重要调节激素,其类似物RH2485常作为杀虫剂使用,对昆虫的影响全面而深刻。然而20E对昆虫免疫系统的影响作用至今我们仍了解较少。为探究20E在棉铃虫Helicoverpa armijera生长发育过程中对免疫系统的影响,本研究选取6龄取食期幼虫注射20E,采用半定量RT-PCR检测了24个棉铃虫体液免疫相关基因在脂肪体和血淋巴中的表达变化,并检测了20E对细胞免疫的影响,包括细胞吞噬能力、凋亡状况及细胞密度变化。结果显示20E处理后,在脂肪体和血淋巴中不同免疫基因对20E的响应不同;血细胞密度在处理12 h后增加2倍,24 h后减少近1/2,但其中浆血细胞密度相对增加,细胞间的粘连作用增强,吞噬率提高约15%,凋亡率升高。结果表明,20E对棉铃虫免疫系统有显著影响,其中对体液免疫的影响比较复杂,但对细胞免疫有明显增强作用。     

棉铃虫HaTO-like基因的克隆、序列分析和表达特征

【目的】克隆和分析了棉铃虫Helicoverpa armigera HaTO-like基因的编码框序列,检测了该基因的时空表达谱以及在棉铃虫感染核型多角体病毒HaSNPV后的转录变化,为深入研究该基因的功能提供理论依据。【方法】本研究利用RT-PCR的方法首次克隆获得HaTO-like基因的全长cDNA序列,通过几种生物信息学软件对该基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行了分析,并利用荧光定量PCR技术检测了该基因在棉铃虫不同发育阶段、幼虫组织和成虫组织的表达情况,以及HaSNPV感染对HaTO-like基因表达的影响。【结果】棉铃虫HaTO-like基因cDNA全长为994 bp,开放阅读框为756 bp,编码251个氨基酸,其蛋白序列的N端含有23个氨基酸的信号肽。进一步的序列分析表明棉铃虫HaTO-like与其他昆虫同源蛋白的氨基酸序列一致性不是太高,大概在39%~61%之间,其中与家蚕和脐橙螟在系统进化上关系最近。荧光定量PCR结果表明该基因在棉铃虫的5龄0 h和成虫第1天的的表达量相对较高,在幼虫的头部和表皮内的表达量较其他幼虫组织较高,在成虫的头部和足的表达量也相对较高。而病毒感染则显著地诱导了该基因在棉铃虫幼虫头部和表皮内的表达。【讨论】本研究克隆了棉铃虫HaTO-like基因的全长cDNA序列,分析了该基因的序列特征和表达谱,为进一步阐释该基因的功能奠定理论基础。     

棉铃虫Polycalin基因的克隆及其表达分析

【目的】通过对棉铃虫Polycalin基因的克隆及其表达谱分析,进一步明确Polycalin基因在抗性中发挥的作用,为棉铃虫Helicoverpa armigera的抗性治理提供理论依据。【方法】通过RACE结合PCR技术克隆获得了棉铃虫Polycalin基因的全长序列,利用实时荧光定量PCR技术测定了在棉铃虫不同发育时期、幼虫肠道不同部位的Polycalin基因表达量,比较了棉铃虫取食含Cry1Ac蛋白的饲料后,Polycalin基因表达量的变化。【结果】该基因全长序列为2 955 bp,开放阅读框为2 781 bp,编码926个氨基酸(Gen Bank登录号为KP100652);预测蛋白的分子量为101.68 ku,等电点为4.57。推导的氨基酸序列中,N末端含有20个氨基酸组成的信号肽,含有8个O-糖基化位点,3个N-糖基化位点,C末端存在2个GPI结合位点。Polycalin在棉铃虫所有发育阶段都可以表达,幼虫期表达量较高,尤其在1~3龄幼虫体内表达量最高,在卵、成虫和蛹中的表达量较低。棉铃虫4龄幼虫取食含活化Cry1Ac蛋白的人工饲料后,Polycalin基因的表达受到抑制。【结论】研究结果可以为进一步揭示Polycalin基因的功能及其在Bt杀虫机制中的作用奠定基础。     

棉铃虫Ⅰ型几丁质酶的表达

昆虫几丁质酶主要参与昆虫蜕皮、围食膜降解、细胞增殖、机体免疫防御、生长因子等重要生理生长发育过程。在本研究中,从NCBI下载棉铃虫几丁质酶序列,并克隆验证正确,构建的系统发育树表明属于Ⅰ型几丁质酶。将不包含信号肽的开放阅读框序列(1 707 bp)与pET28a载体连接,转化至大肠杆菌transetta(DE3)中进行诱导表达,Western blot进一步验证融合蛋白His-HaCHT。用镍柱子纯化融合蛋白,纯化获得的融合蛋白对胶体几丁质有降解活性,其酶活力为0.023μg/mL·s~(-1)。不同龄期的qPCR结果显示,该基因在棉铃幼虫的6个幼虫期以及预蛹蜕皮后均有表达,但HaCHTI在4龄和6龄幼虫阶段表达相对较高,而在1龄、2龄、3龄、5龄幼虫和预蛹表达量较低。这些结果表明,异源表达的棉铃虫的I型几丁质酶对胶体几丁质具有降解活性,可能对棉铃虫正常蜕皮有着重要的作用。     

有机磷和拟除虫菊酯抗性棉铃虫靶标抗性的分子机理(英文)

对有机磷和拟除虫菊酯抗性 (R)棉铃虫靶标抗性的分子机理 ,即乙酰胆碱酯酶 (AChE)和钠通道敏感度降低进行了研究。根据AChE的动力学常数表明 ,R品系AChE的活性和Vmax值分别是S品系的 1 0 9和 1 2 3倍 ,但R品系的AChE的Km 值仅是S品系的 0 6 7倍。R品系AChE对DDVP和马拉硫磷的Ki值分别是S品系的 0 4 4和 0 55。这表明AChE发生了质的变化。还应用PCR技术对抗性棉铃虫的击倒抗性 (kdr)进行了鉴定 ,克隆了钠通道的IIS6序列、IIS5和IIS6连接片段以及II和III连接片段 ,测序后比较了R和S品系以及其它昆虫的同源性 ,结果在氨基酸水平未发现有任何差异 ,这表明该抗性棉铃虫品系不涉及kdr。     

棉铃虫幼虫自相残杀习性与其龄期和食物营养的相关性（英文）

【目的】 昆虫自相残杀行为可以促进特定病原体的传播,这在利用昆虫病原体防治害虫方面有潜在的应用价值。本研究旨在探究棉铃虫 Helicoverpa armigera 幼虫自相残杀习性与其龄期及食物营养之间的相关性。【方法】 分别饲喂室内品系和野外品系的棉铃虫幼虫含不同Na⁺浓度的人工饲料,并在饲养至3龄、4龄、5龄和6龄时,将取食相同饲料的10头幼虫为一群组移入同一培养皿中,通过测定各处理幼虫存活率,评估幼虫龄期和饲料中的Na⁺含量对自相残杀行为的影响。【结果】 当以3龄和4龄为群组的起始龄期时,棉铃虫幼虫存活率显著低于起始龄期为5龄和6龄的群组。此外,取食正常人工饲料的幼虫存活率最高,取食缺钠饲料时,幼虫存活率明显下降。最后,幼虫群组起始龄期和食物Na⁺含量对幼虫化蛹率无明显影响。【结论】结果说明,棉铃虫4和5龄幼虫与3和6龄幼虫相比,自相残杀行为发生的概率更大,而Na⁺含量较低的食物在一定程度上促进自相残杀行为发生的可能性。本研究为在这一领域的进一步工作提供了基础。     

棉铃虫漆酶2基因的分子鉴定

【目的】黑化反应在昆虫表皮骨化以及免疫防御过程中起着重要作用, 酚氧化酶是黑化反应中的关键酶类, 漆酶2 (laccase2, LAC2)是酚氧化酶的一种, 在昆虫变态发育和免疫系统中起着重要的作用。本研究旨在探讨LAC2在棉铃虫Helicoverpa armigera表皮骨化中表达模式及激素调控作用。 【方法】采用PCR及RACE的方法, 从棉铃虫5龄幼虫中得到了lac2 cDNA全序列。利用荧光定量PCR、 激素处理及RNA干扰方法, 对LAC2的表达模式差异和激素调控作用进行分析。【结果】序列分析表明, lac2 cDNA全长3 221 bp, 编码框长度为2 268 bp, 编码756个氨基酸残基。发育时序表达分析发现, lac2在幼虫各龄期表达规律相似, 均在蜕皮期高水平表达, 在5龄96 h转录水平达到最高峰。组织表达结果分析, lac2基因在幼虫表皮和成虫卵巢以及触角表达量较高。激素处理实验发现, 保幼激素类似物（methoprene）对lac2基因转录有抑制作用; 蜕皮激素（20-hydroxyecdysone）则促进其表达。进一步利用RNA干扰蜕皮激素受体EcR （ecdysone receptor）和USP （ultraspiracle isoform）基因发现, 干扰后蜕皮激素受体的表达明显受到抑制, 同时lac2基因的表达也显著受到抑制, 表明蜕皮激素调控lac2基因转录。【结论】这些结果为进一步研究漆酶在昆虫表皮的骨化以及免疫防御等方面不同的生理功能提供理论依据。     

Novel polymorphic microsatellite markers developed in the cotton bollworm Helicoverpa armigera （Lepidoptera：Noctuidae）

A novel set of five polymorphic di- or trinucleofide microsatellite loci suitable for population genetic study were developed from an enriched genomic library for the pest insect cotton bollworm, Helicoverpa armigera, and cross-amplifiability of these and other published loci was tested in a closely related species, the tobacco budworm, H.assulta. The expected heterozygosity at these loci ranges from 0.62 to 0.91 in the cotton bollworm. The observed allele numbers varies from 4 to 12 in the limited number of individuals tested. Although a large proportion of cloned microsatellite sequences are present in multi-copy in the cotton bollworm genome, the overwhelming majority of the finalized polymorphic diallelic loci are tri-nucleotide microsatellites - an unexpected outcome, which should facilitate subsequent genotyping analysis.     

棉铃虫卵巢形态与卵子发生过程观察

害虫发生高峰期、 发生量的准确预测和田间防治适期的确定与种群雌虫卵巢结构及卵子发生过程密切相关。为了明确棉铃虫Helicoverpa armigera卵巢结构及卵子发生过程, 本研究利用光学体视显微镜和透射电子显微镜, 对棉铃虫成虫卵巢管和卵子的超微结构进行了研究, 并确定了发育级别划分标准。结果表明: 根据卵巢的形状、 卵的产生过程、 卵黄沉积情况等将棉铃虫卵巢发育程度分为6个级别, 即发育初期(0级)、 卵黄沉积前期(Ⅰ级)、 卵黄沉积期(Ⅱ级)、 成熟待产期(Ⅲ级)、 产卵盛期(Ⅳ级)和产卵末期(Ⅴ级)。根据卵子发生过程中滋养细胞、 卵母细胞的变化, 将卵子发生期分为3个阶段： 卵黄发生前期、 卵黄发生期和卵黄成熟期。本研究首次对棉铃虫的卵子发生进行电子显微观察, 并完善了棉铃虫卵巢发育的分级标准, 为进一步研究棉铃虫的生殖发育机理提供了理论参考, 对田间棉铃虫种群发生期和发生量的预测预报也有重要的实践参考价值。     

Effects of climate change on different geographical populations of the cotton bollworm Helicoverpa armigera (Lepidoptera,Noctuidae)

The effects of climate change on pest phenology and population size are highly variable. Understanding the impacts of localized climate change on pest distribution and phenology is helpful for improving integrated pest management strategies. Here, the population dynamics of cotton bollworms (Helicoverpa armigera) from Maigaiti County, south Xinjiang, and Shawan County, north Xinjiang, China, were analyzed using a 29‐year dataset at lower latitudes and a 23‐year dataset at higher latitudes to determine the effects of climate change on the population dynamics of H. armigera. The results showed that all generations of H. armigera at both sites showed increasing trends in population size with climate warming. Abrupt changes in phenology and population number occurred after abrupt temperature changes. Climate change had a greater effect on the phenology of H. armigera at higher latitudes than at lower latitudes and led to a greater increase in population size at lower latitudes than at higher latitudes; the temperature increase at higher latitudes will cause a greater increase in the adult moth population size in the future compared to that at lower latitudes; and abrupt changes in the phenology, temperature increase, and population size at lower latitudes occurred earlier than those at higher latitudes. Thus, it is necessary to develop sustainable management strategies for Helicoverpa armigera at an early stage.     

光温条件明显影响棉铃虫的滞育强度

为了探明不同地理种群棉铃虫Helicoverpa armigera滞育强度的地理变异, 本研究系统地比较了光温条件（光照时数 11～16 h, 恒温20, 22, 25, 28和31℃及变温）对来自中国的4个地理种群（广东广州、 江西永修、 山东泰安和辽宁喀佐）棉铃虫滞育强度的影响。结果表明： 滞育诱导的光周期对继后棉铃虫的滞育强度有明显影响。在光照时数11～14 h范围内, 各地理种群的滞育持续期均随着光照时数的增加而延长。滞育强度也受到滞育诱导的温周期影响, 当光期温度相同时, 低纬度的GZ种群温周期比恒温有更强的诱导效应; 中纬度的YX种群温周期与恒温具有相同的滞育诱导强度; 高纬度的KZ和TA种群温周期所诱导的滞育强度一般低于恒温。滞育解除过程中的温度也显著影响到滞育的解除, 在20~31℃下, 温度愈高滞育解除愈快; 滞育持续期同时受到滞育诱导温度的影响, 对于北方的泰安种群和喀佐种群, 较高的滞育诱导温度能诱导更强的滞育。     

光强度对棉铃虫交配行为的影响

【目的】为阐明光强度对棉铃虫Helicoverpa armigera (Hübner)交配行为的影响。【方法】本实验设置4个光照强度(0,0.5,5.0和50.0 lx),观察记录不同光照强度下棉铃虫雌蛾的求偶行为;分别通过单个腺体性信息素提取法和解剖雌虫受精囊的方式,检测不同光照强度下棉铃虫的雌蛾性信息素滴度和交配率。【结果】在强光(50.0 lx)下,棉铃虫雌蛾求偶起始时间最长,求偶持续时间最短,求偶次数最少,雌蛾性信息素滴度始终处于较低水平,交配率也属于最低。在微光(0.5 lx)下,雌蛾求偶起始时间最短,求偶持续时间最长,求偶次数最多;雌蛾性信息素始终处于较低水平,但暗期后段求偶率高达40%。【结论】强光(50.0 lx)可以抑制棉铃虫雌蛾的求偶行为、性信息素的合成及交配;微光(0.5 lx)可以促进棉铃虫雌蛾的求偶行为;相对黑暗环境(0 lx),微光(0.5 lx)还可以促进棉铃虫快速(1 h)完成交配,微光(0.5 lx)对棉铃虫的交配行为具有重要意义;求偶和性信息素的合成没有必然联系。本研究可为探讨光对夜蛾交配行为的影响提供一定的理论基础,也可为利用物理、化学通讯信息调控夜蛾行为提供一定的参考。     

Oviposition deterrents from eggs of the cotton bollworm, Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae): chemical identification and analysis by electroantennogram

Our previous results showed that an extract of the abdomens of mated females of the cotton bollworm, Helicoverpa armigera, deterred oviposition of conspecifics. In this paper, we found that the extract, in addition to reducing conspecifics’ oviposition, could elicit strong electroantennogram responses from mated females. The EAG elicitors mainly came from mature chorionated eggs in the ovarioles. Laid eggs or their surface extract evoked similar EAG responses. The main chemical components of the EAG elicitors from mature chorionated and laid eggs were myristic, palmitic, stearic, and oleic acids. A blend of authentic fatty acids at the ratio found in the laid eggs and in an amount equivalent to 100 laid eggs mimicked the EAG response and deterring effect. Moreover, these four oviposition-deterring fatty acids and their corresponding methyl esters evoked significantly higher EAG responses from both mated females and males than hexane blank and background. The EAG values differed among the test chemicals and between sexes. These results demonstrate that the four fatty acids from eggs are at least partially responsible for the oviposition-deterring effect of the extract from the abdomens of mated female H. armigera and that the moths may detect these chemicals olfactorily by antennae.     

棉铃虫幼虫取食Vip3Aa蛋白后的中肠组织病理变化

为了进一步明确Vip3Aa的作用机制, 利用透射电镜观察了棉铃虫4龄幼虫取食含Vip3Aa蛋白饲料后中肠杯状细胞的病理变化, 并比较了其病变与取食含Cry1Ac饲料后棉铃虫组织病变的差异。取食含Vip3Aa饲料后, 棉铃虫幼虫的中肠杯状细胞逐渐发生病变, 主要表现为： 微绒毛肿胀、 脱落; 细胞核核膜界限不清晰, 染色质分布不均匀; 线粒体变形、 数量减少, 内脊不清晰; 内质网杂乱不规则、 数量减少。与取食Cry1Ac的棉铃虫相比, 取食Vip3Aa的棉铃虫中肠杯状细胞发生病变较为缓慢, 在取食12 h后才发现明显病变, 随着取食时间的增加病变越来越明显; 而取食Cry1Ac的棉铃虫2 h后中肠杯状细胞就出现明显病变。本研究可为Vip3Aa作为新毒素策略的重要蛋白在棉铃虫Helicoverpa armigera综合防治中更好地发挥作用提供理论依据。     

Polymorphic microsatellite loci for the cotton bollworm Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) and some remarks on their isolation

Five polymorphic tri‐ and tetranucleotide microsatellite loci suitable for population genetic analysis were identified in the cotton bollworm Helicoverpa armigera from two partial phagemid genomic libraries enriched for microsatellite inserts. The overall microsatellite‐cloning efficiency in H. armigera is 2.5%, which is approximately eightfold lower than that for the gadoid fishes (20%) employing the same enrichment protocol, supporting the notion of a relative low frequency of microsatellite sequences in lepidopteran genomes. In addition, a large proportion of cloned microsatellite sequences turned out to be repetitive DNA, thus further increasing the difficulty of developing such markers in butterflies and moths.