生物膜能量偶联 ATP 酶的研究:鼠肝线粒体 ATP 酶(F_1)的解离和重组

纯化的鼠肝线粒体ATP 酶(F_1)在1MKCl-TEA 缓冲液(Tris-SO_4~-,50mM;EDTA,1mM;ATP,2mM;pH=7.6)中,2～3℃下处理40～90分钟丧失ATP 水解活力,比活力从70～100下降到0.5～1.0。7%聚丙烯酰胺凝胶电泳证明,随着酶活力的下降和F_1的电泳酶带的消失,在凝胶柱上出现三条F_1的解离蛋白带。解离后的F_1于30℃对TEA(pH5.7)介质透析脱盐能重新出现有活力的F_1,活力恢复到原来酶活力的19～22%,此种重组的F_1在pH 中性偏碱条件下保持稳定。重组过程不需外加Mg~( )的促进和SH 基的保护。重组的F_1与去F_1的Tu 膜可重新结合,完全恢复原来线粒体内膜的ATP 酶水解活力和对DCCD 的敏感性。     

生物膜能量偶联ATP酶的比较研究——Ⅰ.鼠肝线粒体内膜与ATP酶(F_1)的人工重组及ANS萤光探针与ATP酶的结合

本文报导了大鼠肝线粒体内膜ATP酶的析离和重组,以及膜对ATP酶的结构和功能的影响。用(1)胰蛋白酶-尿素、(2)硅钨酸盐和(3)枯草杆菌蛋白酶三种方法分别制备的去ATP酶(F_1)的线粒体内膜与可溶性的F_1重组后,完全恢复或部分恢复到天然线粒体内膜的ATP酶活力水平。寡霉素敏感性测定、ANS结合的发射萤光光谱测定、电镜负染标本观察和低温处理试验等都一致证明,ATP酶与膜重组后表现了一系列与天然膜相似的性质。ANS萤光探针与线粒体内膜结合的萤光增强效应主要在于ANS与ATP酶(F_1)的结合并与F_1的分子构象有密切关系。经胰蛋白酶-尿素处理去掉F_1的线粒体内膜基本上丧失了ANS的萤光增强效应。可溶性F_1经0℃处理2小时后,丧失酶水解活力的84%和ANS萤光增强效应的96.4%。F_1与膜结合后,则表现了对0℃低温的稳定性。结果提示,ANS可能与ATP酶分子的疏水微区相结合;ATP酶分子疏水结构的存在对于表现酶的水解活力和ANS的萤光增强效应是必要的条件;低温处理破坏了酶分子内的疏水结构;膜与ATP酶结合则有稳定酶分子的疏水结构和分子构象的作用。     

生物膜能量偶联ATP酶的比较研究——Ⅱ.鼠肝线粒体ATP酶(F_1)与人原发性肝癌线粒体内膜的杂交重组及其对肝癌发生的遗传控制的初步分析

1974到1975年,我们用人原发性肝癌细胞的线粒体内膜进行ATP酶活力测定,结果证明人肝癌线粒体ATP酶活力极低(0.04～0.1微克分子/分/毫克蛋白)只相当于正常大鼠线粒体的1/10～1/25(0.49～1.07微克分子/分/毫克蛋白)。Walker肉瘤和人肝硬变组织的线粒体与人肝癌的酶活力相近。电镜负染标本观察证明肝癌线粒体内膜大部分失去特征性的直径为90(?)的ATP酶颗粒,表现为光滑膜。ANS萤光探针的发射萤光光谱测定和2,4-二硝基酚的激活试验均证明人肝癌细胞线粒体内膜的ATP酶大量消失是肝癌细胞的特征之一。用提取的大鼠肝线粒体ATP酶(F_1)与人肝癌线粒体内膜进行人工杂交重组,结果证明,重组后的杂交膜的ATP酶活力比人肝癌线粒体内膜高6～11倍;寡霉素敏感性也显著提高。电镜负染标本观察表明杂交膜出现了典型的直径为90(?)的ATP酶的颗粒形态;ANS萤光增强效应测定证明杂交膜的萤光强度比肝癌膜高276%(相对单位);0℃低温处理2小时,ANS萤光强度不变;酶活力在0℃2小时后,仍相当于原来活力的90%。此项试验结果证明杂交重组获得成功。鼠肝线粒体ATP酶与人肝癌线粒体内膜杂交后的特性表现了与天然线粒体内膜的ATP酶的一系列相似的特性。讨论了ATP酶复合体杂交重组试验在探索肝癌发生与细胞中两个遗传系统控制的可能关系问题。     

外源胆固醇对水稻根端线粒体ATP酶活力的影响

外源胆固醇无论是通过根系吸收或是直接与离体线粒体一起温育的方式,在试验浓度范围内均能提高水稻根端线粒体ATP酶的活力,同时观察到外源胆固醇能明显降低ATP酶表现活化能(Apparent activation energy,AEa)在Arrhenius图上的折点温度。其中通过根系吸收进入线粒体膜内后,其线粒体ATP酶AEa的两个折点温度由对照的27.7℃和15.5℃分别降低到24.5℃和12.7℃;直接与离体线粒体一起温育的两个折点温度分别降低到18.8℃和9.6℃。试验结果证明,适量的外源胆固醇不仅对水稻根端线粒体ATP酶活力具有明显的促进作用,而且对降低线粒体膜脂的相变温度也有明显的调节作用。     

蛋白质嵌入脂质体的研究——Ⅱ.猪心线粒体腺三磷酶复合体在脂质体上进行重组的研究

本文报导从猪心线粒体内膜腺三磷酶复合体拆离疏水蛋白(基部、F_0),成功地与偶联因子F_1组装在脂质体上。并比较了疏水蛋白嵌入脂质体的三种方法(超声法、胆酸盐稀释法、胆酸盐透析法)的重组效果。(1)摸索了从线粒体、亚线粒体提取活力较高的疏水蛋白(F_0)的最适条件。当F_0嵌入脂质体后,腺三磷酶水解活力增高4～6倍,并表现出对寡霉素敏感的特性,酶活力受寡霉素抑制约50%左右。(2)将可溶性腺三磷酶(F_1)与嵌有F_0的脂质体(LF_0)进行重组,~(32)Pi-ATP交换活力、腺三磷酶水解活力以及萤光强度的增加都表明重组获得成功。(3)根据腺三磷酶抑制剂(寡霉素、二环己基碳二亚胺)和解偶联剂(碳酰氰-P-三氟甲氧苯腙)等对重组后上述各项指标的影响,也都表明重组获得成功。(4)对三种嵌入方法(超声、胆酸盐稀释法、胆酸盐透析法)的重组效果进行了比较。实验结果表明,各项指标的表现往往并不一致,重组后~(32)Pi-ATP交换活力以超声法为最高,胆酸盐透析法交换活力最低。     

蛋白质嵌入脂质体的研究——Ⅱ.猪心线粒体腺三磷酶复合体在脂质体上进行重组的研究

本文报导从猪心线粒体内膜腺三磷酶复合体拆离疏水蛋白(基部、F_0),成功地与偶联因子F1组装在脂质体上。并比较了疏水蛋白嵌入脂质体的三种方法(超声法、胆酸盐稀释法、胆酸盐透析法)的重组效果。(1)摸索了从线粒体、亚线粒体提取活力较高的疏水蛋白(F_0)的最适条件。当F_0嵌入脂质体后,腺三磷酶水解活力增高4～6倍,并表现出对寡霉素敏感的特性,酶活力受寡霉素抑制约50%左右(2)将可溶性腺三磷酶(F_1)与嵌有F_0的脂质体(LF_0)进行重组,~(32)pi-ATP 交换活力、腺三磷酶水解活力以及萤光强度的增加都表明重组获得成功。(3)根据腺三磷酶抑制剂(寡霉素、二环己基碳二亚胺)和解偶联剂(碳酰氰-P-三氟甲氧苯腙)等对重组后上述各项指标的影响,也都表明重组获得成功。(4)对三种嵌入方法(超声、胆酸盐稀释法、胆酸盐透析法)的重组效果进行了比较。实验结果表明,各项指标的表现往往并不一致,重组后~(32)Pi-ATP 交换活力以超声法为最高,胆酸盐透析法交换活力最低。     

生物膜组分对膜功能和膜脂相变的调控 Ⅰ.吐温表面活性剂对玉米根端线粒体ATP酶活力的影响

膜脂流动性和膜结合酶的关系极为密切,同时膜脂组分也明显地制约着膜的流动性。本试验选用了三种不同脂肪酸碳链的吐温表面活性剂(Tween 20,Tween40,Tween 80)作为线粒体的添加物,观察对玉米根端线粒体ATP酶活力的调节作用。结果看到玉米根端线粒体ATP酶在8～32℃范围内活化能在15.5℃处出现了一个折点。添加吐温20、40、80后在8～32℃范围内都出现了二个活化能的折点,分别为26.5℃和12.3℃;25.4℃和15.3℃;22.8℃和12.8℃。清洗吐温后ATP酶活化能的转折点温度与添加吐温时没有明显差异,表明吐温的脂肪酸链可能与线粒体膜相结合,因而改变了线粒体ATP酶的活化能的折点温度。     

生物膜组分对膜功能和膜脂相变的调控——Ⅰ.吐温表面活性剂对玉米根端线粒体ATP酶活力的影响

膜脂流动性和膜结合酶的关系极为密切,同时膜脂组分也明显地制约着膜的流动性。本试验选用了三种不同脂肪酸碳链的吐温表面活性剂(Tween 20,Tween40,Tween 80)作为线粒体的添加物,观察对玉米根端线粒体ATP 酶活力的调节作用。结果看到玉米根端线粒体ATP酶在8～32℃范围内活化能在15.5℃处出现了一个折点。添加吐温20、40、80后在8～32℃范围内都出现了二个活化能的折点,分别为26.5℃和12.3℃;25.4℃和15.3℃;22.8℃和12.8℃。清洗吐温后ATP 酶活化能的转折点温度与添加吐温时没有明显差异,表明吐温的脂肪酸链可能与线粒体膜相结合,因而改变了线粒体ATP 酶的活化能的折点温度。     

园二色性光谱研究不同醇对猪心线粒体F_1-ATP酶和H~+-ATP酶复合体构象及其与水解活力的关系

本文测定了ATP酶复合体和F_1—ATP酶(简称F_1)在低浓度甲、乙、正丙、异丙、叔丁醇中的远紫外圆二色(CD)光谱。并且比较了二者受这些醇作用时的水解活力变化。 结果表明:除10％—20％正丙醇。20％的乙醇。异丙醇和叔丁醇使F_1的CD双负峰明显变小。α螺旋量减少外其它5％—20％的各种醇均可使F_1的CD谱双负峰略微变大。α—螺旋量也相应变大。而外加5％—20％的各种醇对ATP酶复合体的CD谱影响不大。α—螺旋量也无明显变化。同时发现ATP酶复合体的水解活力不易受这些醇影响,而F_1的水解活力容易受醇类影响。显然,与游离的F_1相比,ATP酶复合体中疏水蛋白(F_0)及部分磷脂的存在,使其构象及水解功能均呈现了对醇的稳定性。水介活性与CD变化之间的关系文中作了讨论。     

猪心线粒体F_1-ATP酶的水解活性与色、酪氨酸残基相关的构象的关系

线粒体H~ -ATP酶具有双向功能,即ATP的合成与ATP的水解。H~ -ATP酶的头部F_1具有催化这二种功能的活性部位,F_1的活性表现位与它结合核苷酸的类型、数目以及亲和力有关。至于F_1分子活性部位中什么结构与这两种功能有关,目前尚不肯定。自1960年以来关于线粒体F_1的水解功能与其结构中氨基酸残基关系的研究,多采用特异的化学试剂去修饰某些氨基酸残基,然后测其水解活力被抑制的情况。Senior认为不是含—SH基的半胱氨酸而是酪氨酸残基,还可能包括色氨酸残基与ATP的水解有关。也有报道认为是与组氨酸、谷氨酸或精氨酸残基有关。现在蛋白质结构     

线粒体ATP合酶抑制因子(ATPIF1)在能量代谢中的作用

线粒体是真核细胞中动态双层膜结构的细胞器,由外至内可以划分为四个功能区,分别是线粒体外膜(OMM),线粒体膜间隙,线粒体内膜(IMM)和线粒体基质。在线粒体内膜上的复合体V(complex V)即为ATP合酶,其主要功能是合成ATP。实际上,ATP合酶既合成也水解ATP,对细胞ATP水平有双向调节作用。ATP合酶的活性受抑制因子(ATPIF1)的调节。ATPIF1与ATP合酶结合后,对其ATP合成和水解功能进行抑制,从而影响线粒体和细胞内ATP水平。ATPIF1活性受到组氨酸质子化状态和丝氨酸磷酸化修饰的调节。在缺氧,交感神经兴奋和肿瘤等条件下,ATPIF1发挥重要代谢调节作用,但其在代谢紊乱疾病中的作用尚不明确。本文在综述ATPIF1文献的基础上,对其在糖脂代谢紊乱疾病中的作用进行分析及展望。     

绿豆幼苗线粒体氧化磷酸化偶联因子

分离和初步提纯了绿豆黄化幼苗线粒体氧化磷酸化偶联因子 F_1。结果表明,得到的偶联因子 F_1具有 ATP 酶活性。初步提纯的制剂活性比线粒体的活性提高约54倍,达到水解 ATP生成无机磷2.14微克分子/分钟/毫克蛋白,其最适 pH 为8.5,最适温度为45℃。绿豆线粒体的偶联因子是冷不稳定的;当它与膜分离处于溶解状态时,失去对二环己基碳二亚胺(DCCD)的敏感性;它水解 ATP 需要 Mg~(++),能为2,4-二硝基酚(DNP)激活,但 Ca~(++),NaCl和 KCl 的激活作用没有观察到。利用凝胶电泳证明,它的分子量约为380,000。     

溶血卵磷脂对大豆下胚轴质膜H^＋—ATPase ATP和对—硝基苯磷酸水解活性的影响

研究了溶血卵磷脂 (lysophosphatidylcholine,lyso PC)对大豆 (Glycinemax (L .)Merr.)下胚轴质膜H _ATPaseATP和对_硝基苯磷酸 (ρ_nitrophenylphosphate ,PNPP)水解的影响。结果显示 ,lyso_PC可以刺激ATP水解活力 ,当lyso_PC浓度在 0～ 0 .0 3%范围时 ,ATP水解活力明显提高 ,lyso_PC浓度高于 0 .0 3%后增加缓慢 ;当lyso_PC浓度为0 .0 3%时 ,ATP水解活力提高 80 .5 %。动力学分析表明 ,lyso_PC处理可以使ATP水解的Vmax从 0 .46 μmolPi·mg-1protein·min-1升高到 0 .87μmolPi·mg-1protein·min-1;使Km 从 0 .88mmol/L升高到 1.15mmol/L。最适pH也从 6 .5变为 7.0。实验还发现lyso_PC可以促进羟胺对ATP水解的抑制作用 ,lyso_PC处理后ATP水解被羟胺 (2 0 0mmol/L)抑制 84.4% ,而未经lyso_PC处理的对照组则仅被抑制 74.4%。然而 ,lyso_PC处理不影响PNPP水解活力和钒酸钠抑制效应。以上结果表明 ,质膜H _ATPase的激酶结构域可能是其C末端自抑制结构域的作用位点或调节区域     

线粒体ATP合酶抑制因子1在线粒体稳态中的调节作用

线粒体作为细胞的重要能量来源,其数量、质量及功能的稳定对维持细胞的正常活动至关重要,且其稳态的调节依赖于线粒体质量控制系统(包括线粒体自噬、线粒体融合/分裂及线粒体生物合成等)。线粒体蛋白ATP合酶抑制因子1(ATP synthase inhibitor 1, IF1)是线粒体基质中抑制F1FoATP酶/合酶活性的天然小分子蛋白质。在细胞缺氧缺血等特殊生理情况下, IF1通过改变自身的聚合状态,抑制F1FoATP酶水解ATP的活性,从而抑制细胞内的ATP被过度水解。最近的研究证实, IF1的抑制作用是双向的,其即可抑制F1FoATP酶活性,又可抑制F1FoATP合酶活性。因此, IF1可通过靶向F1FoATP酶/合酶活性及相关信号通路,参与调节线粒体质量,维持线粒体稳态。该文综述IF1在线粒体质量控制中的相关调节机制,包括IF1维持线粒体氧化还原平衡、IF1介导线粒体自噬、IF1促进线粒体融合/分裂三条通路,以及三者之间相互作用的关系,为探索IF1在相关疾病的发生、发展及治疗中的作用提供理论参考。     

棉酚对几种动物精子ATP酶抑制作用的比较研究

本文比较了棉酚对几种动物精子ATP酶的抑制作用。实验所测为精子细胞的总ATP酶活力;采用的棉酚浓度为10μM至80μM。20μM时精子酶的相对活力为海胆7604％,大鼠74％,家兔51.6％;40μM时酶的相对活力百分数下降至海胆52.5,大鼠35和家兔29.7;达80μM时酶的相对活力进一步下降至海胆26.7,而大鼠及家兔仅余13.2。结果表明(1)棉酚对精于ATP酶的抑制作用是依赖浓度的变化;(2)各种动物精子ATP酶活力的下降情况显示,大鼠及家兔(哺乳动物)精子ATP酶对棉酚的敏感性比海胆(无脊椎动物)要高些。这种差异性可能对棉酚在临床上的应用具有一定的参考价值。     

颗粒状固定化青霉素酰化酶的研究

将巨大芽孢杆菌 (Bacillusmegaterium)胞外青霉素酰化酶通过共价键结合到聚合物载体EupergitC颗粒环氧基团上 ,制成的颗粒状固定化青霉素酰化酶表现活力达 1 40 0 μ/g左右。固定化酶水解青霉素的最适 pH8 0 ,最适温度为 55℃。在pH6 0～ 8 5、温度低于 40℃时固定化酶活力稳定。在 pH8 0、温度 37℃时 ,固定化酶对青霉素的表现米氏常数Ka为 2×1 0 - 2 mol/L ;苯乙酸为竞争性抑制剂 ,抑制常数Kip为 2 8× 1 0 - 2 mol/L ;6 APA为非竞争性抑制剂 ,抑制常数Kia为 0 1 2 5mol/L。固定化酶水解青霉素 ,投料浓度为 8% ,在使用 2 0 0批后 ,保留活力 80 %左右 ,6 APA收率平均达 89 48%。     

“非双层脂结构形成的倾向性”对猪心线粒体H~+-ATP酶活性的影响

1、PC+PE重组的线粒体H~+-ATP酶,ATP水解活力及其对寡酶素的敏感性,ATP诱导电位随非双层脂PE含量增加显著增大,当PE含量为60%-80%时ATP诱导电位达最高值.2、用PC+DOPE和PC+DEPE重组的脂酶体,前者的ATP诱导电位显著高于后者,但是两种脂酶体的ATP水解活性和寡霉素敏感性没有明显差别.3、降低PH可以促进PA形式非双层结构,PC+20%PA或大豆磷脂重组的脂酶体H~+-ATP酶活性随pH降低显著增高.4、PC+20%PA和大豆磷脂重组的脂酶体膜表层流动性随透析液PH降低而降低,5、综合上述结果.我们认为“非双层脂结构形成的倾向性”的加强,可能导致一种不稳定的或柔性的膜结构的出现,使得H~+-ATP酶呈现发挥其活性的最适构象.     

新型β-葡萄糖苷酶BglD2异源表达及水解虎杖苷能力

从海洋细菌Bacillus sp.D1中克隆、重组表达β-葡萄糖苷酶BglD2,研究其酶学性质,并对其水解虎杖苷制备白藜芦醇的能力进行分析。BglD2的最适催化温度和pH分别为45℃和6.5,在30℃和pH 6.5条件下的半衰期约为20 h。BglD2能够水解含β(1→3)、β(1→4)、β(1→6)等键型的多种底物。BglD2具有良好的糖促活特性,100 mmol/L葡萄糖和150 mmol/L木糖分别将酶活力提升2.0倍和2.3倍。BglD2具有较好的乙醇促活及耐受特性,30℃时,10%乙醇使酶活力提升1.2倍,25%乙醇存在时其仍保留60%的酶活力。BglD2具有水解虎杖苷制备白藜芦醇的能力,35℃条件下反应2 h水解率为86%。具有乙醇耐受及抗产物抑制等特性的β-葡萄糖苷酶BglD2在酶法水解虎杖苷制备白藜芦醇方面有应用潜力。     

不同细胞来源的F_1-腺三磷酶的进化比较

由于F_1-ATP酶广泛分布于真核细胞的线粒体膜、叶绿体膜以及原核细胞的质膜上,我们用免疫学方法将猪心F_1-ATP 酶与牛心、鼠肝、酵母、玉米以及支原体的F_1或似F_1-ATP 酶作了进化比较,为此,我们以提纯的猪心F_1为抗原制备了抗猪心F_1的免疫抗血清,用Ouchterlony 双向免疫扩散以及免疫电泳鉴定了其效价及均一性,此抗血清能抑制猪心F_1-ATP 酶和猪心亚线粒体的H~ -ATP 酶活力达90%左右,此抗血清对不同真核细胞来源如牛心、鼠肝、酵母的F_1-ATP 酶或亚线粒体H~ -ATP酶呈现不同的抑制程度,即牛心>鼠肝>酵母,而对植物界的玉米线粒体膜以及支原体质膜上的ATP 酶活性不但不抑制反而提高。从这结果可看出F_1-ATP 酶活力被抑制的程度愈大,其亲缘关系愈近,也就是F_1分子结构愈相似,一般看来真核细胞与原核细胞间F_1-ATP 酶的分歧程度比不同真核细胞间的分歧程度要大得多。并且动植物间的分歧也很大。     

钒酸钠对叶绿体ATP酶和光合功能的影响

钒酸钠是一种对红色链胞霉(nurospora)质膜—ATP酶有抑制作用的药物。Bowman近来发现氧化态五价钒离子对有产电质子泵(Electrogenic proton pump)作用的质膜—H~ -ATP酶也有专一的抑制效应,但它不影响线粒体的ATP酶活力。至于它对叶