棉铃虫普通气味结合蛋白Ⅱ基因的表达及鉴定

通过PCR扩增的方法获得了棉铃虫普通气味结合蛋白Ⅱ(GOBP2-Harm)基因成熟蛋白阅读框序列,构建了GOBP2-Harm原核表达载体pGEX/GOBP2-Harm,并成功地在大肠杆菌中进行了表达。SDS-PAGE分析表明：大部分GOBP2-Harm重组蛋白形成不溶性的包涵体,超声波破碎大肠杆菌细胞后,在上清液中能检测到少量的可溶性GOBP2-Harm蛋白。为了获得大量纯化的可溶性目的蛋白,我们对包涵体进行了溶解和重折叠,并通过亲合层析法进行了纯化。纯化产物能与多音天蚕(Antheraea polyphemus) GOBP抗血清发生交叉反应,证实表达产物属于昆虫普通气味结合蛋白。     

绿盲蝽气味结合蛋白AlucOBP7的表达及气味结合特性

气味结合蛋白(odorant binding proteins, OBPs) 在昆虫嗅觉识别中起着重要的作用, 尤其是在运输外界脂溶性气味分子通过嗅觉感器淋巴液到达嗅觉受体(olfactory receptors, ORs)的过程中发挥关键作用。明确OBPs在昆虫同外界进行信息交流过程中的作用有利于阐明昆虫嗅觉识别的机制, 同时可为利用干扰昆虫嗅觉识别来进行害虫防治奠定理论基础。本研究克隆了一个绿盲蝽Apolygus lucorum (Meyer-Dür)气味结合蛋白AlucOBP7基因（GenBank登录号: JQ675724）, 并进行了原核表达, 以1-NPN为荧光探针采用荧光竞争结合实验研究了AlucOBP7蛋白和10种棉花挥发物及 6种性信息素类似物的结合能力。结果表明： 在10种棉花挥发物中, AlucOBP7能够和2 己酮及水杨酸甲酯有效结合, 结合常数分别为55.13 μmol/L和28.26 μmol/L。在6种盲蝽性信息素类似物中, 4-氧代-反-2-己烯醛和AlucOBP7 具有较强的结合能力, 结合常数为23.14 μmol/L。丁酸乙酯、 丁酸丁酯及己酸己酯也能够和AlucOBP7 有效结合, 但结合能力中等, 结合常数分别为30.58, 39.26和35.81 μmol/L。初步推测, AlucOBP7 可能是绿盲蝽性信息素结合蛋白(pheromone binding proteins, PBPs), 并在感受性信息素和植物挥发物的过程中发挥双重功能。     

枣食芽象甲化学感受蛋白PyasCSP4的基因克隆、表达及配体结合特征

【目的】本研究为明确枣树Zizyphus jujuba主要害虫枣食芽象甲Scythropus yasumatsui化学感受蛋白4(chemosensory protein 4, CSP4)的表达特点及配体结合特性。【方法】基于枣食芽象甲成虫触角转录组数据,利用RT-PCR方法克隆了枣食芽象甲PyasCSP4 cDNA序列,并进行生物信息学分析。通过RT-qPCR方法测定PyasCSP4在枣食芽象甲成虫不同组织(触角、去除触角的头、胸、腹、足和翅)中的表 达水平。通过原核表达系统和镍柱纯化获得PyasCSP4重组蛋白,采用荧光竞争结合实验测定重组蛋白PyasCSP4与35种枣树挥发物的结合特性。【结果】克隆获得枣食芽象甲PyasCSP4的cDNA序列(GenBank 登录号: OK322362),其开放阅读框全长为366 bp,编码121个氨基酸,N末端有18个氨基酸组成的信号肽序列, PyasCSP4成熟蛋白序列具有4个保守的半胱氨酸残基。RT-qPCR结果表明, PyasCSP4基因在成虫不同组织中均有表达,在触角和翅中的表达量显著高于在其他组织中的表达量。重组蛋白PyasCSP4与25种配体具有结合活性,尤其与α-蒎烯、α-水芹烯和罗勒烯等的结合能力最强,解离常数(Ki)值分别为6.29, 6.58和6.69 μmol/L。【结论】PyasCSP4能够与多种枣树挥发物结合,推测其可能在枣食芽象甲定位寄主植物的过程中发挥重要作用。本研究的结果对阐明枣食芽象甲嗅觉机制和开展绿色防控研究具有重要意义。     

小地老虎化学感受蛋白AipsCSP8的表达及配体结合特性分析

【目的】本研究旨在解析小地老虎Agrotis ipsilon化学感受蛋白AipsCSP8的表达谱及配体结合特征。【方法】利用qRT-PCR方法测定了AipsCSP8在小地老虎成虫头、胸、腹、足、翅、性腺(附腺)、触角、喙和下唇须以及雌雄虫羽化前后触角中的表达水平。体外重组表达AipsCSP8蛋白,通过荧光竞争结合实验测定重组蛋白AipsCSP8对24种性信息素、22种植物挥发物和10种化学农药的结合特性。【结果】qRT-PCR检测结果显示,AipsCSP8在小地老虎雄成虫的足和下唇须中表达量最高,在附腺和触角中的表达量次之;在雌成虫的触角中表达量最高,在足、性腺、下唇须中的表达量次之。另外,雄、雌虫触角中AipsCSP8表达量分别在成虫羽化前1 d和羽化当天达到顶峰。荧光竞争结合实验结果表明,重组蛋白AipsCSP8对植物挥发物邻苯二甲酸-丁酯(解离常数Ki=14.6 μmol/L)、苯乙醛(Ki=17.2 μmol/L)以及化学农药阿维菌素(Ki=12.9 μmol/L)均有较强的结合能力。【结论】化学感受蛋白AipsCSP8可能参与小地老虎嗅觉行为及味觉识别,并可能在小地老虎感受化学农药的过程中发挥作用。     

家蚕化学感受蛋白BmCSP4表达谱及结合特性分析

化学感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)是昆虫体内存在的一类主要识别和运载非挥发性的气味分子和化学刺激物的可溶性蛋白。本研究运用半定量RT-PCR方法分析了BmCSP4的时空及组织表达谱。结果表明： BmCSP4在家蚕Bombyx mori各发育阶段均表达, 但表达量从4龄到蛹期逐渐减少, 且在雌成虫头部、 胸部和腹部表达量较少。用1-NPN作为荧光探针, 测定了15种外源配基与BmCSP4蛋白的结合特性, 结果显示： 仅芳香醛类和芳香酮类化合物在浓度10 μmol/L能将1-NPN从BmCSP4中替换50%, 苯甲醛解离常数为3.20 μmol/L, 对甲氧基苯甲醛解离常数为2.24 μmol/L, 2-戊基-3-苯丙基-烯醛解离常数为2.88 μmol/L, 1-苯基-1-丁酮解离常数为2.04 μmol/L, 苯乙酮解离常数为2.52 μmol/L。据此推测, BmCSP4在不同的发育阶段执行不同的生理功能, 并可能参与对芳香醛、 芳香酮类气味识别过程。     

角倍蚜气味结合蛋白和化学感受蛋白基因的鉴定及表达谱

【目的】通过对角倍蚜Schlechtendalia chinensis气味结合蛋白(odorant-binding proteins, OBPs)和化学感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)基因进行鉴定和表达谱分析,为研究OBPs和CSPs在角倍蚜嗅觉感知中的功能提供理论依据。【方法】基于角倍蚜基因组和不同发育阶段转录组数据,通过生物信息学方法鉴定和筛选角倍蚜OBPs和CSPs的基因序列;利用邻接法对角倍蚜与其他半翅目昆虫OBPs和CSPs的氨基酸序列进行系统发育分析;根据角倍蚜OBP和CSP基因在不同发育阶段(干雌、干母、春迁蚜、秋迁蚜、越冬若蚜、雌性蚜和雄性蚜)转录组数据中的TPM(tags per million)值进行表达丰度分析,结合qRT-PCR方法检测角倍蚜OBP和CSP基因在不同发育阶段的相对表达量。【结果】从角倍蚜基因组和转录组数据中鉴定出12个OBP基因(SchiOBP2-10,SchiOBP13-15)和9个CSP基因(SchiCSP1-2,SchiCSP4-10);系统发育分析发现,角倍蚜OBPs和CSPs与其他蚜虫OBPs和CSPs...     

桔小实蝇气味结合蛋白BdorOBP2的cDNA克隆、组织表达及配基结合特性

为了研究桔小实蝇Bactrocera dorsalis气味结合蛋白(odorant-binding proteins, OBPs)参与其嗅觉识别过程中的功能及其与植物气味的结合特性, 本研究克隆了桔小实蝇的一个气味结合蛋白基因, 命名为BdorOBP2（GenBank登录号为KC773766）, 并对该基因进行了原核表达。BdorOBP2开放阅读框长447 bp, 编码148 个氨基酸, 具有典型的6个半胱氨酸位点。定量PCR结果显示, 桔小实蝇BdorOBP2在不同组织中均有表达, 其中头部中的表达量最高, 翅中表达量最低（为头部表达量的63%±6%）。构建了BdorOBP2原核表达载体, 诱导并获得了重组BdorOBP2并进行了亲和层析纯化。最后以N-苯基-1-萘胺（N-phenyl-1-naphthylamine, 1-NPN）为荧光探针, 利用荧光竞争结合实验测定了重组BdorOBP2与7种主要寄主水果气味物质的结合能力, 发现其对多数酯类和醛类化合物亲合力较强, 亲合力最强的气味物质为反-2-己烯醛和β-紫罗兰酮, 结合常数KD分别为9.96和15.37 μmol/L。本研究结果可为高效地开发和设计桔小实蝇的嗅觉引诱剂配方提供一定的理论依据和参考。     

疆夜蛾Plus-C气味结合蛋白PsauOBP7的组织表达谱及配体结合特性分析

【目的】明确疆夜蛾Peridroma saucia Plus-C气味结合蛋白PsauOBP7在不同化学感受器官中的表达谱,解析PsauOBP7重组蛋白的气味结合特异性。【方法】通过qRT-PCR检测PsauOBP7在疆夜蛾雌蛾和雄蛾的触角、口器、足和翅中的表达谱。原核表达并纯化PsauOBP7重组蛋白,利用Western blot检测PsauOBP7在疆夜蛾不同龄期幼虫头部及成虫不同组织中的表达情况;通过荧光竞争结合实验检测PsauOBP7重组蛋白对39种气味化合物的结合能力。【结果】成功表达并纯化PsauOBP7重组蛋白。qRT-PCR及Western blot检测显示PsauOBP7表达于4-6龄幼虫头部及雌雄成虫的触角、口器、足和翅中。荧光竞争结合实验显示PsauOBP7与反-2-己烯醛的结合能力最强,K_i=1.4μmol/L。此外,PsauOBP7与5种酯类化合物乙酸月桂酯、顺-3-己烯乙酸酯、乙酸苯乙酯、苯甲酸己酯和肉桂酸甲酯有一定的结合能力,K_i值分别为5.7, 6.5, 8.9, 9.5和10.2μmol/L。PsauOBP7与...     

疆夜蛾Plus-C气味结合蛋白PsauOBP7的组织表达谱及配体结合特性分析

【目的】明确疆夜蛾Peridroma saucia Plus-C气味结合蛋白PsauOBP7在不同化学感受器官中的表达谱,解析PsauOBP7重组蛋白的气味结合特异性。【方法】通过qRT-PCR检测PsauOBP7在疆夜蛾雌蛾和雄蛾的触角、口器、足和翅中的表达谱。原核表达并纯化PsauOBP7重组蛋白,利用Western blot检测PsauOBP7在疆夜蛾不同龄期幼虫头部及成虫不同组织中的表达情况;通过荧光竞争结合实验检测PsauOBP7重组蛋白对39种气味化合物的结合能力。【结果】成功表达并纯化PsauOBP7重组蛋白。qRT-PCR及Western blot检测显示PsauOBP7表达于4-6龄幼虫头部及雌雄成虫的触角、口器、足和翅中。荧光竞争结合实验显示PsauOBP7与反-2-己烯醛的结合能力最强,Ki=1.4 μmol/L。此外,PsauOBP7与5种酯类化合物乙酸月桂酯、顺-3-己烯乙酸酯、乙酸苯乙酯、苯甲酸己酯和肉桂酸甲酯有一定的结合能力,Ki值分别为5.7, 6.5, 8.9, 9.5和10.2 μmol/L。PsauOBP7与两种醇类化合物顺-3-己烯-1-醇和法尼醇也有较强的结合能力, Ki值分别为5.8和5.9 μmol/L。【结论】疆夜蛾Plus-C气味结合蛋白PsauOBP7表达于其幼虫和成虫的多种化学感受器官中,且能结合多种植物气味化合物,说明其在疆夜蛾寻找寄主植物过程中发挥重要作用。     

梨木虱化学感受蛋白CchiCSP8与梨树挥发物的结合特性分析

【目的】梨木虱Cacopsylla chinensis是我国重要的梨树害虫。本研究通过分析梨木虱化学感受蛋白8(chemosensory protein 8, CchiCSP8)与梨树挥发物的结合特性,综合研究CchiCSP8的嗅觉功能,为今后阐释梨木虱定位梨树的嗅觉机理提供前期基础。【方法】采用PCR方法克隆CchiCSP8的全长开放阅读框序列,并对推导的氨基酸序列与其他半翅目昆虫CSPs进行同源比对和进化分析;构建pET30a(+)-CchiCSP8的原核表达载体,通过大肠杆菌Escherichia coli体外表达、组氨酸标签蛋白镍磁珠纯化技术和荧光竞争性结合实验,共测定了重组蛋白CchiCSP8与41种梨树挥发物的结合能力。随后对CchiCSP8进行同源建模和分子对接分析。【结果】克隆获得了CchiCSP8全长序列,开放阅读框全长426 bp,编码141个氨基酸,N端有一个包含21个氨基酸的信号肽。成熟的CchiCSP8蛋白的预测分子量和等电点分别为15.02 kD和9.77;与其他半翅目昆虫CSPs的序列比对发现,CchiCSP8具有4个保守的半胱氨酸位点,并与柑橘木虱Diaphorina citri化学感受蛋白DcitCSP11的进化关系最近;pET30a(+)-CchiCSP8在IPTG诱导下在大肠杆菌中成功表达,并通过镍磁珠纯化获得纯净的CchiCSP8蛋白;采用荧光竞争性结合实验分析重组蛋白CchiCSP8的结合特性,结果显示CchiCSP8对18种梨树植物挥发物具有不同程度的结合能力(Ki=14~30 μmol/L),包括4种烯烃、6种醇类、4种醛类、1种酮、1种酯类和2种芳香类物质,CchiCSP8与配体的结合力表现出了随碳原子数不同而变化的特点;分子对接结果显示CchiCSP8和每个配体之间的结合能相差不大(-4.2~6.0 kJ/mol),这与上述荧光竞争结合实验的结果一致。在CchiCSP8与不同配体结合过程中,存在多个共有氨基酸残基,其中5个非极性残基(A38, A42, L93, L99和V100)以及2个极性残基(Q107和K46)的作用最为突出。【结论】CchiCSP8能够结合18种不同类型的梨树挥发物,推测其在梨木虱识别梨树挥发物的过程起到重要作用,本研究结果可为明晰梨木虱在定位梨树过程中的嗅觉机制提供理论基础,并为开发基于扰乱嗅觉行为的新型梨木虱行为调控技术提供新思路。     

棉铃虫叉头框蛋白A类似蛋白基因HarmFoxAl的克隆及表达谱分析

【目的】本研究旨在克隆并分析一种棉铃虫Helicoverpa armigera叉头框蛋白A (forkhead box protein A, FoxA)类似蛋白基因HarmFoxAl,探讨2-十三烷酮胁迫下棉铃虫中肠中HarmFoxAl的表达情况,为进一步明确棉铃虫FoxA的功能和参与棉铃虫生长发育的调控通路提供依据。【方法】从棉铃虫幼虫中肠中扩增得到HarmFoxAl的cDNA序列,并对其氨基酸序列和蛋白结构进行分析。将HarmFoxAl的ORF序列连接至pET32a载体并转化大肠杆菌Escherichia coli Transetta菌株,IPTG诱导后检测目的蛋白的表达形式,并利用镍柱亲和层析法纯化融合蛋白。通过qPCR检测棉铃虫不同发育阶段(1-6龄幼虫和预蛹),6龄幼虫不同组织(脂肪体、中肠、体壁和头部)以及10 mg/g 2-十三烷酮处理6龄幼虫不同时间后中肠中HarmFoxAl的表达谱。【结果】HarmFoxAl(GenBank登录号:XM021331806)的开放阅读框为669 bp,编码222个氨基酸,蛋白的相对分子质量和等电点分别为25.03 kD和6.34。氨基酸序列分析表明,HarmFoxAl单体蛋白无信号肽、跨膜区和二硫键,核心区域是由4个α螺旋和3个β折叠组成的球状结构。将重组的Transetta (pET32a-HarmFoxAl)菌株用0.5 mmol/L IPTG在25℃条件下诱导5 h,约45 kD的融合蛋白His-HarmFoxAl能以可溶的形式存在于重组菌中,这与预测的分子量(42.8 kD)相一致。发育阶段特异性表达谱表明,HarmFoxAl在棉铃虫1-3龄幼虫期、6龄幼虫期和预蛹期均有表达,且预蛹期的表达量最高。组织表达谱结果表明,该基因在6龄幼虫的脂肪体、中肠和体壁中表达,且脂肪体内的表达量最高,而在头部中不表达。10 mg/g 2-十三烷酮处理棉铃虫6龄幼虫后中肠中HarmFoxAl的表达量显著降低,但随着时间延长其表达量逐渐升高,处理48 h后表达量显著高于对照。【结论】棉铃虫HarmFoxAl在预蛹期和幼虫脂肪体中表达量最高,2-十三烷酮处理幼虫后HarmFoxAl的表达量急速降低后逐渐升高,推测其在棉铃虫变态发育和解毒代谢过程中发挥重要作用。     

Relationship between oviposition preference and offspring performance in Australian Helicoverpa armigera (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae)

Abstract We investigated the oviposition preference and larval performance of Helicoverpa armigera under laboratory conditions to determine if the oviposition preference of individual females on maize, cowpea and cotton correlates with offspring performance on the leaves of the same host plants. The host-plant preference hierarchy of females did not correlate with their offspring performance. Female moths chose host plants that contributed less to their offspring fitness. Plant effects accounted for the largest amount of variation in offspring performance, while the effects of female (family) was low. The offspring of most females (80%, n  = 10) were broadly similar, but 20% (two out of 10), showed marked difference in their offspring performance across the host-plant species. Similarly, there was no relation between larval feeding preference and performance. However, like most laboratory experiments, our experi-mental design does not allow the evaluation of ecological factors (for example, natural enemies, host abundance, etc.) that can play an important role in larval performance in the field. Overall, the results highlight the importance of carrying out preference performance analysis on the individual or family level, rather than pooling individuals to obtain average population data.     

棉铃虫激活增强子结合蛋白AP-4基因的原核表达、多克隆抗体制备、表达谱分析及功能鉴定

【目的】激活增强子结合蛋白4(activating enhancer binding protein 4, AP-4)是近年来备受关注的一类功能广泛的转录因子,参与Wnt/β-catenin信号通路的调控。本研究旨在研究棉铃虫Helicoverpa armigera HaAP-4基因的原核表达并制备多克隆抗体,明确HaAP-4基因的时空表达谱,初步探究HaAP-4对棉铃虫胆固醇载体蛋白2(sterol carrier protein-2, SCP-2)基因(HaSCP-2)表达的调控作用。【方法】通过PCR扩增棉铃虫HaAP-4基因片段,将其克隆至pET-28a原核表达载体,转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21,经IPTG诱导表达,采用镍柱纯化重组蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体。运用RT-qPCR检测HaAP-4基因在棉铃虫不同发育阶段(卵、幼虫、预蛹、蛹和成虫)以及5龄幼虫和预蛹不同组织(中肠、脂肪体、头和表皮)中的表达水平。设计并合成HaAP-4 siRNA,转染棉铃虫Ha细胞,通过RT-qPCR检测和分析使用HaAP-4 siRNA进行RNA干扰后Ha细胞中HaAP-4和HaSCP-2基因 mRNA的表达情况。【结果】成功构建pET-28a-HaAP-4重组表达质粒,在大肠杆菌细胞中获得高效表达的可溶性蛋白,目的蛋白大小约为55 kD,经纯化获得了纯度较高的重组蛋白,免疫新西兰兔成功制备了多克隆抗体,通过Western blotting检测显示抗体具有较好的特异性,ELISA分析表明抗体效价较高。发育阶段特异性表达结果显示,HaAP-4基因在棉铃虫不同发育阶段均有表达,其中在卵期、5龄幼虫期和预蛹期的表达量较高。组织表达结果表明,HaAP-4基因在5龄幼虫和预蛹不同组织中均有表达,且在中肠和头部具有高表达,而在表皮和脂肪体中表达量较低。RNA干扰实验发现,HaAP-4基因的敲降对HaSCP-2基因转录有显著影响,HaSCP-2基因mRNA表达水平下降了约55%。【结论】利用pET-28a原核表达系统能有效地在体外表达可溶性的HaAP-4,并制备了较好的多克隆抗体。RNAi实验结果提示,在中肠内高表达的HaAP-4基因能促进HaSCP-2基因的转录表达,在棉铃虫脂质生理代谢过程中发挥作用。本研究为进一步深入阐明棉铃虫HaAP-4的潜在功能打下了基础。     

棉铃虫围食膜肠粘蛋白基因HM72的克隆、表达及其蛋白组织定位

围食膜是昆虫中肠上皮细胞分泌形成一层特有的非细胞性半透膜, 肠粘蛋白是其重要的组成成分。本研究利用棉铃虫Helicoverpa armigera围食膜蛋白多克隆抗体免疫筛选棉铃虫中肠cDNA表达文库,共获得385个阳性克隆, 经DNA测序和序列对比, 确认其中之一为编码棉铃虫中肠围食膜肠粘蛋白的cDNA克隆HM72。序列分析显示,该cDNA全长为2 888 bp (GenBank登录号： HM017910), 其中ORF长2 469 bp, 编码823个氨基酸, 包含起始密码子ATG和终止密码子TAA,在poly A 末端上游19 bp处有一个多聚腺苷酸信号序列AATTAA。氨基酸序列分析表明, 其N-端含有16个氨基酸的信号肽, 预测分子量为84.2 kDa,等电点3.63,为酸性蛋白质。结构域分析表明,该蛋白具有5个几丁质结合功能域,一个粘蛋白结构域和两个甘氨酸-天冬氨酸富集区,该基因成功表达100 kDa的目的蛋白。Western blot分析表明,HM72蛋白存在于棉铃虫中肠、围食膜、粪便及蜕中,并由整个中肠分泌,而在棉铃虫脂肪体、体壁、马氏管、唾腺、消化液、血淋巴中没有检测到HM72蛋白。本研究为棉铃虫生物防治相关功能基因的深入研究以及完善昆虫围食膜理论等提供了依据。     

Pattern of cross-resistance in pyrethroid-selected populations of Helicoverpa armigera Hübner (Lep., Noctuidae) from India

Abstract:  In Helicoverpa armigera , withdrawal of selection pressure resulted in a two- to fourfold increase in susceptibility to synthetic pyrethroids and continuous selection enhanced the resistance level by four- to fivefold to the respective pyrethroids at the end of the 14th generation. Populations selected for resistance to one pyrethroid showed positive cross-resistance to all other pyrethroids, but no cross-resistance to endosulfan and thiodicarb. There was a significant increase in mixed-function oxidase activity with advancing generation suggesting its possible role in the positive cross-resistance among the pyrethroids. The induction of carboxyl esterases in pyrethroid-selected populations may have resulted in the activation of indoxacarb, thereby accounting for the observed negative cross-resistance.