杆状病毒表达载体系统

杆状病毒表达载体系统是近年来发展起来的较高效的表达外源基因系统。由于多角体病毒中多角体蛋白基因的非必需性、高表达性、重组病毒的易鉴定等特性,以及多角体蛋白基因的强启动子使其特别适于基因工程中作为表达载体,借助于转移载体可将外源目的基因转移到野生型AcMNPV中,在一个被转移载体和野生型AcMNPV共转染的细胞内,可以通过同源重组完成目的基因的转移。应用不同的转移载体可表达出融合及非融合蛋白质。经该系统表达的重组蛋白质具有生物学活性,其中大部分进行翻译后剪接产生与天然蛋白质相似的重组蛋白质。这些产物的抗原性,免疫原性和功能都与天然蛋白质非常相似。目前,应用该系统已成功地表达了许多酶、生长因子、病毒抗原包括病毒的外壳蛋白等有生物活性的蛋白质。本文对如何最大限度表达外源基因及该表达系统的发展前景作了讨论。     

一种新颖的棉铃虫单粒包埋核多角体病毒表达系统

将含有低拷贝数的mini-F replicon、一个卡那霉素抗性基因和一个lacZα基因8.6kb的DNA片段经同源重组置换到棉铃虫核型多角体病毒基因组中的多角体蛋白基因内,构建了既能在E.coli内复制又可在昆虫细胞内复制形成完整的病毒粒子棉铃虫核型多角体病毒Bacmid(HaBacmid-HZ8).另外将HaSNPV的多角体蛋白基因和P10启动子序列取代pFastBacDual质粒上的AcMNPV的多角体启动子序列和P10启动子序列,构建插入HaSNPV多角体蛋白基因和 P10启动子序列的HapFastBacPhP10供体质粒.利用HapFastBacPhP10供体质粒将eGFP基因转位至HZ8的Tn7附着位点上,随后将含有eGFP基因的重组HaBacmid DNA转染至HZAm1细胞内.转染5d后,细胞核内能形成典型的多角体,在萤光显微镜下观察到细胞内显示出强烈的绿色萤光.结果证明我们构建的HaBac to Bcac 表达系统能有效的表达外源基因.     

一种新颖的棉铃虫单粒包埋核多角体病毒表达系统

将含有低拷贝数的mini Freplicon、一个卡那霉素抗性基因和一个lacZα基因 8.6kb的DNA片段经同源重组置换到棉铃虫核型多角体病毒基因组中的多角体蛋白基因内 ,构建了既能在E .coli内复制又可在昆虫细胞内复制形成完整的病毒粒子棉铃虫核型多角体病毒Bacmid(HaBacmid HZ8)。另外将HaSNPV的多角体蛋白基因和P10启动子序列取代 pFastBacDual质粒上的AcMNPV的多角体启动子序列和P10启动子序列 ,构建插入HaSNPV多角体蛋白基因和P10启动子序列的HapFastBacPhP10供体质粒。利用HapFastBacPhP10供体质粒将eGFP基因转位至HZ8的Tn7附着位点上 ,随后将含有eGFP基因的重组HaBacmidDNA转染至HZAm1细胞内。转染 5d后 ,细胞核内能形成典型的多角体 ,在萤光显微镜下观察到细胞内显示出强烈的绿色萤光。结果证明我们构建的HaBactoBcac表达系统能有效的表达外源基因     

马尾松毛虫质型多角体病毒多角体蛋白基因的表达与定位

为了表达马尾松毛虫质型多角体病毒(DpCPV)多角体蛋白基因(S10片段)并探讨多角体蛋白在真核细胞中的定位,从DpCPV中分离出S10,与pET-28a载体连接成重组表达质粒pET28-S10;将S10克隆到杆状病毒转座载体pFASTBACHTb中,依次筛选出重组转座质粒pFASTBACS10,重组穿梭质粒BacmidS10,重组杆状病毒AcS10。多角体蛋白基因表达后,用SDS-PAGE、Western-blot和免疫荧光技术对表达产物进行了检测。结果表明:S10原核表达质粒、重组杆状病毒成功获得;在昆虫细胞中表达的质型多角体蛋白主要定位于细胞质,同时有少量产物定位于细胞核。     

一种新颖的棉铃虫单闰包埋核多角体病毒表达系统

将含有低拷贝数的mini-F replicon,一个卡那霉素抗性基因和一个lacZα基因8.6kb的DNA片段经同源重组置换到棉铃虫核型多角体病毒基因组中的多角体蛋白基因内,构建了既能在E.coli内复制又可在昆虫细胞内复制形成完整的病毒粒子棉铃虫核型多角体病毒Bacmid(HaBacmid-HZ8)。另外将HaSNPV的多角体蛋白基因和P10启动子序列取代pFastBacDual质粒上的AcMNPV的多角体启动子序列和P10启动子序列,构建插入HaSNPV多角体蛋白基因和P10启动子序列的HapFastBacPhP10供体质粒。利用HapFast BacPhP10供体质粒将eGFP基因转位至HZ8的Tn7附着位点上。随后将含有eGFP基因的重组HZAml细胞内。转染5d后,细胞核内能形成典型的多角体,在萤光显微镜下观察到细胞内显示出强烈的绿色萤光。结果证明我们构建的HaBac to Bcac表达系统能有效的表达外源基因。     

含有昆虫杆状病毒多角体蛋白基因的转运质粒的构建

为了利用苜蓿尺蠖核多角体病毒作为表达外源基因的运载体,我们将含有该病毒多角体蛋白基因的EcoR I I片段克隆在大肠杆菌质粒pBR325中。并对这一片段进行改建,构建成两个可以将外源基因置于多角体蛋白基因启动子控制下的表达质粒。     

马尾松毛虫质型多角体病毒多角体蛋白基因的表达与定位

为了表达马尾松毛虫质型多角体病毒(DpCPV)多角体蛋白基因(S10片段)并探讨多角体蛋白在真核细胞中的定位,从DpCPV中分离出S10,与pET-28a载体连接成重组表达质粒pET28-S10;将S10克隆到杆状病毒转座载体pFASTBAC HTb中,依次筛选出重组转座质粒pFASTBAC S10,重组穿梭质粒Bacmid S10,重组杆状病毒Ac S10.多角体蛋白基因表达后,用SDS-PAGE、Western-blot和免疫荧光技术对表达产物进行了检测.结果表明S10原核表达质粒、重组杆状病毒成功获得;在昆虫细胞中表达的质型多角体蛋白主要定位于细胞质,同时有少量产物定位于细胞核.     

家蚕核型胸角体病毒酪氨酸蛋白磷酸酯酶基因的克隆及在大肠杆菌中表达

采用PCR方法克隆了家蚕核型多角体病毒中国镇江株（BmNPV-JZstrain）的酪氨酸蛋白磷酸酯酶基因（ptp),测定了该基因的核苷酸序列。比较了与相关病毒相应基因的同源性,并将该基因插入到原核表达质粒在大肠杆菌中进行了表达。该基因的编码部分由507个核苷酸组成,编码168个氨基酸残基的蛋白多肽,其中含有酪氨酸蛋白磷酸酶酯催化部位的“HC”基序。该基因与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV)ptp基因和BmNPV-T3株（日本）拟为ptp基因核苷酸序列的同源性分别为96．8％和98．2％,蛋白质氨基酸序列的同源性分别为97．0％和97．6％。将该基因插入到温度诱导型表达质粒pBV221的温控启动子PRPL之后,在大肠杆菌JM109中表达了具有催化活性的蛋白质,分子量约为19KD,表达产物能催化对硝基酚磷酸钠（PNPP）的脱磷酸反应,这种催化作用可被钒酸钠和ZnCl2抑制。     

表达乙型肝炎病毒表面抗原基因又形成多角体的杆状病毒

用形成包含体(OCC~+)并能利用人工合成启动序列和多角体XIV启动子表达外源基因的转移载体质粒pSXIVVI~+X3,将乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因和多角体基因同时插入无包含体的粉纹夜蛾核型多角体病毒TnNPV-SVI-G基因组中,得到表达HBsAg基因又形成包含体(多角体)的重组毒侏TnNPV-HBs85-OCC~+。与利用野生型多角体启动子表达HBsAg基因的无包含体毒株TnNPV-HBsD4不同,TnNPV-HBs85-OCC~+由于具包含体,能以口服方式大规模感染粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)幼虫,且HBsAg基因在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)离体细胞中的表达量要比前者高约37％,在虫体中的表达则更高。     

家蚕核型多角体病毒酪氨酸蛋白磷酸酯酶基因的克隆及在大肠杆菌中表达

采用PCR方法克隆了家蚕核型多角体病毒中国镇江株 (BmNPV ZJstrain)的酪氨酸蛋白磷酸酯酶基因(ptp) ,测定了该基因的核苷酸序列 ,比较了与相关病毒相应基因的同源性 ,并将该基因插入到原核表达质粒在大肠杆菌中进行了表达。该基因的编码部分由 5 0 7个核苷酸组成 ,编码 16 8个氨基酸残基的蛋白多肽 ,其中含有酪氨酸蛋白磷酸酶酯催化部位的“HC”基序。该基因与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒 (AcMNPV) ptp 基因和BmN PV -T3 株 (日本 )拟为的 ptp基因核苷酸序列的同源性分别为 96 8%和 98 2 % ,蛋白质氨基酸序列的同源性分别为 97 0 %和 97 6 %。将该基因插入到温度诱导型表达质粒pBV2 2 1的温控启动子PRPL 之后 ,在大肠杆菌JM10 9中表达了具有催化活性的蛋白质 ,分子量约为 19kD ,表达产物能催化对硝基酚磷酸钠 (PNPP)的脱磷酸反应 ,这种催化作用可被钒酸钠和ZnCl2 抑制     

以家蚕核型多角体病毒为载体高效表达天花粉蛋白基因

本文报道以家蚕核型多角体病毒为载体,在家蚕体内高效表达天花粉蛋白基因的结果。天花粉蛋白基因是用ＰＣＲ技术从栝楼基因组中分离的,该基因被插入到家蚕核型多角体病毒转移载体质粒ｐＢｍ-１的多角体蛋白基因启动子下游,构建成重组质粒ｐＢｍＴＣＳ。将重组质粒ＤＮＡ和野生型ＢｍＮＰＶＤＮＡ共转染家蚕培养细胞,通过在家蚕培养细胞中进行同源重组和筛选,获得了无多角体的重组病毒ＢｍＴＣＳ。采用ＰＣＲ技术对重组病毒进行了鉴定,证实重组病毒合天花粉蛋白基因。重组病毒对家蚕的感染性不及野生病毒,提示表达产物对病毒的增殖有抑制作用。对重组病毒感染的家蚕血淋巴进行了ＳＤＳ-ＰＡＧＥ和免疫印迹分析,结果显示在蚕体血淋巴中的表达产物天花粉蛋白占总蛋白的５％。本实验为利用基因工程方法大量生产天花粉蛋白提供了又一条新的途径。     

昆虫杆状病毒多角体基因在原核细胞中的表达

昆虫杆状病毒的多角体基因(ocu)主要用于构建转移载体。目前,已有许多利用此类载体表达外源基因的报道,但尚未见到ocu基因本身在原核细胞中表达的资料。 从大尺蠖核型多角体病毒(BsNPV)DNA获得含有ocu基因的BamH I—H片段(2.3kb),将其与表达载体pDR540重组,从被检的转化菌落中发现两个阳性重组体(pBS7d和pBS31d),它们能在大肠杆菌细胞中表达多角体蛋白。     

苜蓿尺蠖核多角体病毒(AcNPV)DNA的提纯及多角体蛋白基因片段的克隆

本文报道了从被AcNPV感染的大蜡螟中提纯到AcNPV DNA,以质粒pBR325作为载体,从AcNPV基因组DNA EeoRI片段克隆中得到含AcNPV多角体蛋白基因片段的重组质粒。经原位杂交,酶切鉴定,DNA顺序分析,并与Hooft Van Iddekinge等人测定的结果比较,证明筛选到的7.3kb EcoRI片段包含了AcNPV多角体蛋白结构基因及其启动基因。核多角体病毒多角体蛋白启动基因是迄今为止在真核细胞中所发现的最强启动基因之一,是理想的表达外源基因的启动子。     

异源多角体蛋白对家蚕核型多角体病毒粒子的包装

利用PCR方法从AcMNPV基因组DNA中分离出多角体蛋白基因 ,将该扩增片段克隆到转移载体pBacPAK8中 ,得到重组转移载体pOAc。将该质粒DNA与线性化的Bm BacPAK6病毒基因组DNA共传染BmN细胞 ,得到了能形成多角体且不产生蓝色空斑的重组病毒hp BmNPV。纯化该重组病毒的多角体颗粒 ,并对多角体蛋白、病毒核酸及多角体病毒颗粒进行分析 ,发现AcMNPV的多角体蛋白能在家蚕细胞中大量表达且能在细胞内识别家蚕核型多角体病毒并组装成多角体颗粒 ;病毒基因组DNA因部分交换 ,其酶切行为发生了相应的变化 ;电镜观察发现经AcMNPV多角体蛋白包装的家蚕核型多角体病毒的多角体颗粒大小为1 2 μm～ 2 9μm ,明显小于野生型家蚕核型多角体病毒的多角体颗粒     

家蚕BmNPV多角体蛋白与外源蛋白共包埋入多角体的研究

为了探索家蚕核型多角体病毒多角体的包装特性,构建了一种不形成多角体但能大量表达绿色荧光蛋白(EGFP)的重组病毒vBmBac(polh-)-5B-EGFP,将其与野生型BmNPV共同感染BmN细胞,于荧光显微镜下观察到EGFP与多角体可以在同一细胞中同时表达。从感染的BmN细胞中收集纯化多角体,观察到多角体能被激发出绿色荧光,进一步利用Western blot证实多角体中含有EGFP。上述结果表明,多角体可以将自身病毒粒子以外的其他病毒粒子的成分包装进入多角体,表明多角体的包装机制中存在非特异性识别机制。     

肌动蛋白抑制了杆状病毒多角体蛋白基因的转录与表达

为进一步研究肌动蛋白在杆状病毒感染晚期的作用,利用Bac-to-Bac系统构建了表达多角体基因、肌动蛋白与绿色荧光蛋白融合基因的重组病毒vAc-ph/70GA,同时构建对照病毒vAc-ph.实验发现,重组病毒vAc-ph/70GA感染Sf9细胞后能持续表达肌动蛋白,但不能形成多角体,vAc-ph则能形成多角体.sDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示,vAc-ph/70GA感染晚期,细胞内没有多角体蛋白的表达;RT-PCR的结果进一步表明多角体基因的转录被抑制.肌动蛋白的表达并没有影响vAc-ph/70GA对细胞的感染力.结果表明,晚期表达的外源肌动蛋白抑制了多角体基因的转录和表达,从而导致多角体不能正常产生.     

茶尺蠖核型多角体病毒多角体蛋白单克隆抗体的制备

为了建立一种基于免疫反应检测茶尺蠖核型多角体病毒的方法,以纯化后的茶尺蠖核型多角体病毒作为抗原,免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合,经间接ELISA筛选及克隆得到了一株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为7D3。同时克隆并在大肠杆菌中表达了EoNPV多角体蛋白基因,获得重组多角体蛋白。经Western blotting鉴定,该抗体可与EoNPV的多角体蛋白特异性结合。利用制备EoNPV多角体蛋白的单克隆抗体,建立了间接ELISA测定EoNPV的方法。     

利用优化改造的家蚕杆状病毒表达系统提高NS1表达产量

为优化家蚕杆状病毒表达系统,提高外源基因的表达产量。文中通过同源重组技术,用串联的氯霉素基因(Cm)表达盒和绿色荧光蛋白基因(egfp)表达盒将其替换,从而获得Chitinase和Cystein Protease两个基因缺失的家蚕杆状病毒载体。通过转座,将多角体启动子控制的家蚕二分浓核病毒(Bm BDV)ns1基因表达盒,定点插入到改造后的该分子载体中。将重组载体转染Bm N细胞,获得能表达家蚕二分浓核病毒(Bm BDV)NS1的缺失型重组病毒;另外,将多角体启动子控制的ns1基因转座到野生型Bm-bacmid中,获得能表达Bm BDV NS1的野生型重组病毒。将这两种病毒分别皮下注射家蚕,对感染后的家蚕血液中NS1表达水平进行比较,发现缺失Chitinase和Cystein Protease重组病毒感染的家蚕血液中,NS1的表达量是对照组的3倍,从而建立了一种高效表达可溶性NS1蛋白的方法,为靶蛋白的结构与功能研究奠定基础。     

昆虫病毒多角体蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

将含有大尺蠖核型多角体病毒(BsNPV)多角体蛋白基因(ocu)的BamHl一H片段克隆到表达载体pDR 540的BamiHl位点,得到能抗高浓度氨苄青霉素(200μg／ml)的两个阳性重组体,其胞外总蛋白比亲本质粒高1．1-1．4倍。在大肠杆菌细胞中,BsNPV ocu基因在原核杂合启动子tac驱动下能高水平的表达,表达量达到0．8和4．7mg／ml。免疫沉淀反应证明,表达蛋白为BsNPV的包涵体蛋白,凝胶过摅法测定的平均分子量为32.1×103道尔顿。     

以核多角体病毒为载体在家蚕中生产外源蛋白

以家蚕核多角体病毒(BmNPV)为载体,在家蚕幼虫或家蚕培养细胞系中表达的外源基因越来越多,其表达的产物已涉及到医用药物、医疗诊断、疫苗生产、生物防治等诸多领域,文章就BmNPV的特性及其基因组构造,多角体蛋白基因的特性,重组BmNPV的构建及其在家蚕幼虫体内和细胞系中的表达,BmNPV-家蚕表达系统的外源蛋白生产效率及其应用等各个方面作了全面、系统的综述.