大豆疫霉和苜蓿疫霉rDNA ITS序列分析

采用真菌核糖体基因转录间隔区(ITS)通用引物,PCR分别扩增了Phytophthora sojae的5个菌株(Pg1、Pg2、Pg3、CN1和S317)和1个P. medicaginis (菌株44390)的ITS1与ITS2,并对PCR产物进行了序列测定。根据Bioedit软件中的neighbour-joining methods分析法将上述序列和Genbank中已登录的P. sojae、P. medicaginis、P. megasperma和P.trifolii等4个形态学种10个登录菌株的ITS1与ITS2碱基序列进行聚类分析。结果是聚类组与形态学种有一定差别,4个种16个菌株分成7个聚类组。结果表明,分别属于同一形态学种且可聚为一组的不同个体之间的ITS碱基序列遗传相似性最高,但是也具有一定的多样性;形态学上属于不同种的个体的ITS可以聚为一组。上述结果提示L41385可能不属于P. sojae, L41380可能属于是P. trifolii,P. megasperma仍是一个复合种。同时提示ITS DNA碱基序列可以区分形态学种。     

大豆疫霉和苜蓿疫霉rDNA ITS序列分析*

采用真菌核糖体基因转录间隔区(ITS)通用引物,PCR分别扩增了Phytophthora sojae的5个菌株(Pg1、Pg2、Pg3、CN1和S317)和1个P. medicaginis (菌株44390)的ITS1与ITS2,并对PCR产物进行了序列测定。根据Bioedit软件中的neighbour-joining methods分析法将上述序列和Genbank中已登录的P. sojae、P. medicaginis、P. megasperma和P.trifolii等4个形态学种10个登录菌株的ITS1与ITS2碱基序列进行聚类分析。结果是聚类组与形态学种有一定差别,4个种16个菌株分成7个聚类组。结果表明,分别属于同一形态学种且可聚为一组的不同个体之间的ITS碱基序列遗传相似性最高,但是也具有一定的多样性;形态学上属于不同种的个体的ITS可以聚为一组。上述结果提示L41385可能不属于P. sojae, L41380可能属于是P. trifolii,P. megasperma仍是一个复合种。同时提示ITS DNA碱基序列可以区分形态学种。     

核糖体基因ITS作为苎麻疫霉、恶疫霉分类辅助性状的研究

以2个雄器大多围生、少数侧生的苎麻疫霉菌株与1个雄器侧生、偶有围生的恶疫霉菌株为材料,采用真菌核糖体基因转录间隔区（ITS）通用引物,PCR扩增3个供试菌株核糖体基因的ITS1和ITS2,并对PCR产物进行了克隆和序列分析。结果是苎麻疫霉的ITS1和ITS2分别由206和453个碱基组成,而恶疫霉则分别由218和415个碱基组成。2个供试苎麻疫霉菌株的ITS1和ITS2的碱基序列同源性均分别为100%。苎麻疫霉和恶疫霉ITS1同源性为74.9%,其中中间区域40bp-164bp之间在两种间变异丰富,同源性只有59.4%,而1bp-39bp和165bp-239bp两区域的同源性分别为92.3%和92.1%;ITS2在两种疫霉菌间的同源性为71.0%。结果表明苎麻疫霉和恶疫霉ITS的碱基序列有明显差异。上述结果提示,ITS区域碱基序列可区分苎麻疫霉和恶疫霉。     

核糖体基因ITS作为苎麻疫霉、恶疫霉分类辅助性状的研究*

以2个雄器大多围生、少数侧生的苎麻疫霉菌株与1个雄器侧生、偶有围生的恶疫霉菌株为材料,采用真菌核糖体基因转录间隔区（ITS）通用引物,PCR扩增3个供试菌株核糖体基因的ITS1和ITS2,并对PCR产物进行了克隆和序列分析。结果是苎麻疫霉的ITS1和ITS2分别由206和453个碱基组成, 而恶疫霉则分别由218和415个碱基组成。2个供试苎麻疫霉菌株的ITS1和ITS2的碱基序列同源性均分别为100%。苎麻疫霉和恶疫霉ITS1同源性为74.9%,其中中间区域40bp-164bp之间在两种间变异丰富,同源性只有59.4%,而1bp-39bp和165bp-239bp两区域的同源性分别为92.3%和92.1%; ITS2在两种疫霉菌间的同源性为71.0%。结果表明苎麻疫霉和恶疫霉ITS的碱基序列有明显差异。上述结果提示,ITS区域碱基序列可区分苎麻疫霉和恶疫霉。     

大豆疫霉根腐病菌的rDNA ITS序列分析

采用真菌核糖体基因转录间隔区(ITS)通用引物,PCR扩增了大豆疫霉根腐病菌具有差异的17个菌株的ITSI与ITS2,经过与DL2000的标准分子量DNA进行比较,得到了大约800~1000bp左右的片段,并对PCR产物进行了序列测定。以USA为外类群利用最大简约法构建了大豆疫霉根腐病菌的系统发生树,并分析了菌株之间的遗传进化关系。结果表明:不同菌株ITS1和ITS2在碱基构成上有很大差异,17个菌株大致分为4个谱系中,且来自于同一地区的菌株大都分布在同一谱系中,显示出地理上的差异。     

基于β-微管蛋白基因部分序列探讨灵芝属菌株的亲缘关系

PCR分别扩增了38个灵芝属菌株的β-微管蛋白基因片段,并对PCR产物进行序列测定,得到419bp的一段核苷酸系列.根据MEGA 2.1软件中的neighbour-joining methods对上述序列进行聚类分析,结果所有供试菌株被分成9个聚类组.中国栽培灵芝菌株分布于6个聚类组,其中树舌亚属、紫芝组的菌株各自聚成一组,灵芝组的菌株分成四组,但大部分灵芝组菌株均聚于同一组, 这表明树舌亚属、紫芝组和灵芝组间的遗传差异较大,灵芝组内虽然存在着一定的遗传差异,但总体上亲缘关系比较近,遗传多样性并不丰富.同时,序列分析的结果显示,β-tubulin基因序列在第三位密码子和内含子部位有高的碱基替换率,这些变异提供了丰富的系统发育信息,提示β-tubulin基因适合于灵芝属菌株的亲缘关系研究.     

RAPD分析与ITS序列分析在拟茎点霉分类鉴定上的应用

采用随机扩增多态性DNA（RAPD）技术和核糖体RNA基因（rDNA)转录间隔区（ITS）序列分析对22种拟茎点霉共34个菌株进行了系统发育研究,RAPD分析构建的UPGMA聚类图所反映的种间,种内关系与形态学分类结果基本一致。可以清楚地将分自7科寄主植物上的不同的种分别区分开来,但分自同科或同属寄主植物上的不同的种并不具有相近的亲缘关系,ITS序列分析结果不支持将Phomopsis mangiferae Ahmad和P.cytosporella Penz.et Sacc.合并为同一个种的观点,同时还.mangiferae与P.sidii de Camara的亲缘关系非常近,可能是异名同物;而为害木棉叶的拟茎点霉与杨梅枝枯病菌,P.myricaeY.J.Huang et P.K.Chi之间的碱基差异亦属于种下不同菌株间的正常差别范围,很可能就是同一个种,对相同的供试菌株两技术所反映的亲缘关系趋势相同,表明两技术用于拟茎点霉的亲缘关系分析和种类鉴定均是可行的。     

RAPD分析与ITS序列分析在拟茎点霉分类鉴定上的应用

采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术和核糖体RNA基因(rDNA)转录间隔区(ITS)序列分析对22种拟茎点霉共34个菌株进行了系统发育研究。RAPD分析构建的UPGMA聚类图所反映的种间、种内关系与形态学分类结果基本一致,可以清楚地将分自7科寄主植物上的不同的种分别区分开来,但分自同科或同属寄主植物上的不同的种并不具有相近的亲缘关系。ITS序列分析结果不支持将Phomopsis mangiferae Ahmad和P. cytosporella Penz. et Sacc. 合并为同一个种的观点,同时还显示出P. mangiferae与P. psidii de Camara的亲缘关系非常近, 可能是异名同物;而为害木棉叶的拟茎点霉与杨梅枝枯病菌P. myricae Y.J.Huang et P.K.Chi之间的碱基差异亦属于种下不同菌株间的正常差别范围,很可能就是同一个种。对相同的供试菌株两技术所反映的亲缘关系趋势相同,表明两技术用于拟茎点霉的亲缘关系分析和种类鉴定均是可行的。     

白菜种传黑斑病菌rDNA ITS区序列分析

本文以来自国内外的20株白菜黑斑病菌及近源种为研究材料,进行了5.8SrDNA及其侧翼ITS区的克隆、测序、序列变异及遗传进化关系分析。黑斑病菌及其近源种真菌核糖体5.8SrDNA及其侧翼ITS区序列比对结果显示,不同种菌株ITS1比ITS2在碱基构成上有更大变异,而且ITS1的序列长度变异比ITS2的大;而种内虽然各菌株的寄主和地理来源不同,但ITS1和ITS2在长度上均没有变异,碱基构成上存在微小的变异。对该区序列的聚类分析表明,白菜黑斑病菌3个种芸薹链格孢Alternariabrassicae、甘蓝链格孢A.brassicicola和萝卜链格孢A.japonica虽然地理来源和寄主不同,但种内的不同菌株均在一个独立的聚类组中,种之间以及其和链格孢属内其它种在聚类关系上能明显分开,可基于该区进行黑斑病菌的分类鉴定。     

进境美国加州脐橙中丁香疫霉Phytophthora syringae的截获

从产自美国加利福尼亚州的新鲜脐橙样品中发现多个腐烂病果,通过分离培养得到3个疑似丁香疫霉Phytophthora syringae菌株,对3个菌株进行形态学研究、致病性测定和分子序列比对分析。结果表明病菌在V8A培养基上菌落稀疏、平铺,呈星状,菌丝紧贴培养基生长或埋于基质内生长;在PDA培养基上菌落呈菊花花瓣状,菌丝致密,乳白色;游动孢子囊和菌丝膨大体在无菌水和土壤浸出液中黑暗条件下48h后产生;菌株为同宗配合,卵孢子在带有新鲜脐橙果实组织或杜鹃叶片的V8A培养基中大量产生;创伤接种脐橙果实,7d后接种脐橙出现典型的褐腐症状;通用引物ITS1/ITS4扩增测序,Blastn分析表明序列与GenBank中P. syringae序列相似性为99%。依据上述研究结果,将分离获得的3株菌鉴定为丁香疫霉Phytophthora syringae,系国内首次截获的一种植物检疫性真菌病害。     

基于β-微管蛋白基因部分序列探讨灵芝属菌株的亲缘关系

PCR分别扩增了38个灵芝属菌株的β-微管蛋白基因片段,并对PCR产物进行序列测定,得到419bp的一段核苷酸系列。根据MEGA2.1软件中的neighbour-joiningmethods对上述序列进行聚类分析,结果所有供试菌株被分成9个聚类组。中国栽培灵芝菌株分布于6个聚类组,其中树舌亚属、紫芝组的菌株各自聚成一组,灵芝组的菌株分成四组,但大部分灵芝组菌株均聚于同一组,这表明树舌亚属、紫芝组和灵芝组间的遗传差异较大,灵芝组内虽然存在着一定的遗传差异,但总体上亲缘关系比较近,遗传多样性并不丰富。同时,序列分析的结果显示,β-tubulin基因序列在第三位密码子和内含子部位有高的碱基替换率,这些变异提供了丰富的系统发育信息,提示β-tubulin基因适合于灵芝属菌株的亲缘关系研究。     

RAPD分析与ITS序列分析在拟茎点霉分类鉴定上的应用*

采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术和核糖体RNA基因(rDNA)转录间隔区(ITS)序列分析对22种拟茎点霉共34个菌株进行了系统发育研究。RAPD分析构建的UPGMA聚类图所反映的种间、种内关系与形态学分类结果基本一致,可以清楚地将分自7科寄主植物上的不同的种分别区分开来,但分自同科或同属寄主植物上的不同的种并不具有相近的亲缘关系。ITS序列分析结果不支持将Phomopsis mangiferae Ahmad和P. cytosporella Penz. et Sacc. 合并为同一个种的观点,同时还显示出P. mangiferae与P. psidii de Camara的亲缘关系非常近, 可能是异名同物;而为害木棉叶的拟茎点霉与杨梅枝枯病菌P. myricae Y.J.Huang et P.K.Chi之间的碱基差异亦属于种下不同菌株间的正常差别范围,很可能就是同一个种。对相同的供试菌株两技术所反映的亲缘关系趋势相同,表明两技术用于拟茎点霉的亲缘关系分析和种类鉴定均是可行的。     

木霉属2中国新记录种

[目的]明确我国南部地区土壤中分离得到的2株木霉菌的分类地位.[方法]采用PDAm培养基分离木霉菌菌株,通过形态学鉴定和内转录间隔区(ITS)序列、翻译延长因子1-alpha (Tef1-α)部分序列相似性分析对菌株进行初步鉴定;选取MEGA 4.0软件用Bootstrap最大简约法、水平3、重复1 000次来构建ITS、Tef1-α序列系统进化树并分析其亲缘关系.[结果]菌株CM01的ITS序列与GenBank基因库中Trichoderma intricatum strain GJS 02-78 ITS序列同源性高达99％,在ITS序列系统进化树中与模式菌株T.intricatum GJS 02-78、Trichoderma atroviride DAOM 179514亲缘关系最近;其Tef1-α序列与GenBank基因库中Hypocrea intricate strain GJS 02-78 Tef1-α序列同源性高达99％,在Tef1-α序列系统进化树中与模式菌株H.intricata GJS 02-78亲缘关系最近;其形态描述和模式菌株一致.菌株SCGA5003的ITS序列与GenBank基因库中Trichoderma stromaticum strain GJS 97-181 ITS序列同源性高达99％,在ITS序列系统进化树中与模式菌株T.stromaticum GJS 97-179、GJS 97-180、GJS 97-181、GJS 97-182、GJS 97-183亲缘关系最近;其Tef1-α序列与GenBank基因库中T.stromatieum strain GJS 97-183 Tef1-α序列同源性高达94％,在Tef1-α序列系统进化树中与模式菌株T.stromaticum CQSQ1032、GXNN7006亲缘关系最近;其形态描述和模式菌株一致.[结论]结合形态学特征与分子鉴定结果,判定菌株CM01为交织木霉(Trichoderma intricatum Samuels&Dodd/Hypocrea intricata Samuels et Dodd)、SCGA5003 为子座木霉(Trichoderma stromaticum Samuels & Pardo-Schulth/Hypocrea stromatica Bezerra,Costa & Bastos),即发现木霉属2个中国新记录种.     

大豆疫霉菌ITS分子检测程序的建立及其应用

依据GenBank中登录的大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)、近缘种及相似种rDNA的ITS区序列差异,进行多重比较后设计合成一对大豆疫霉菌特异引物,并在PCR反应体系和扩增条件优化的基础上,对包括大豆疫霉菌在内的共140个菌株进行PCR检测。结果表明,电泳后只有大豆疫霉菌扩增出一条288bp的特异性条带。运用设计的大豆疫霉菌专用引物(专利申请号200610089105.4)及建立的检测程序对大豆疫霉菌纯培养游动孢子、接种于土壤中的游动孢子和卵孢子以及接种发病的大豆染病组织进行了检测应用,结果显示该检测程序对接种于土壤中的大豆疫霉菌游动孢子和卵孢子的检测理论精度分别达0.3和0.06个孢子,对染病组织检测也表现出了较高的灵敏度。     

散斑壳属两近似种的表型性状和ITS序列分析比较研究

对针叶树散斑壳Lophodermium conigenum与其近似种南方散斑壳L.australe的形态学特征及生态习性等进行了比较研究,同时对这两个种8个菌株的rDNA-ITS区进行了PCR扩增和序列测定,结合GenBank中16个相关ITS序列构建了系统发育树。结果表明,L.conigenum与L.australe有着非常密切的关系。L.conigenum除子囊果形状、子座基部层、线纹和寄生性外,其余特征与L.australe基本相同。L.conigenum的ITS序列的G+C含量(51.0%)小于L.australe的G+C含量(54.0%)。在系统发育树中,此二种形成两个明显独立的分支,支持了依据形态学等表型性状的分类。二者种间及种内的遗传差异与寄主有较大的相关性,而与产地无明显关联。通过表型性状和ITS序列的分析与比较,可准确地将L.conigenum与L.australe鉴别开来。     

珍珠菜rDNA ITS序列扩增及分析

以贵州境内珍珠菜属植物为材料,对其rDNA转录间隔区(ITS)序列进行PCR扩增和序列测定。实验共得到7个种的ITS序列,它们分别是:过路黄(Lysi machia christinae,GenBank登录号FJ362382),矮桃(L.cle-throides,GenBank登录号FJ362383),叶头过路黄(L.phyllocephala,GenBank登录号FJ362386),临时救(L.con-gestiflora,GenBank登录号FJ362387),显苞过路黄(L.rubiginosa,GenBank登录号FJ362388),茂汶过路黄(L.stellarioides,GenBank登录号FJ362384),腺药珍珠菜(L.stenosepala,GenBank登录号FJ362385),其中后2个种是国际上首次得到的。采用Blast方法将测序结果进行同源搜索,采用邻接法构建与其相关植物的ITS序列系统发育树。结果表明,珍珠菜属7种植物ITS序列总长度为613~620 bp;ITS1区序列长度为234~239 bp,5.8SrDNA区序列长度163 bp,ITS2区序列长度216~219 bp,7种植物的ITS序列差异主要集中在ITS1与ITS2区。聚类分析将茂汶过路黄聚为一支,其它6种植物聚为一支,表明茂汶过路黄与其它6种植物的碱基差异较大,从分子水平上支持据形态特征把花辐射生长的茂汶过路黄另立一类。     

特比萘芬治愈儿童鼻翼孢子丝菌病1例

目的报道1例发生在4岁儿童鼻翼的孢子丝菌病。方法刮取病变组织接种到沙堡弱培养基培养,并对培养出的病原菌进行形态学鉴定和ITS区序列分析。结果病变组织在沙堡弱培养基25℃培养长出黑褐色菌落,25℃小培养后光镜及扫描电镜下见菌丝细长,分枝分隔,合轴式产孢形成的成簇和沿菌丝两侧排列,分生孢子卵圆形。提取真菌总DNA用PCR方法扩增ITS序列,测序后登录GeneBank进行比对,该菌与申克孢子丝菌菌株KMU3360ITS区碱基序列一致性达99%,鉴定为申克孢子丝菌。内服联合局部应用特比萘芬治疗6个月后皮损完全消退。结论确诊1例儿童鼻翼的孢子丝菌病,内服联合局部应用特比萘芬治疗儿童孢子丝菌病疗效良好。     

锦绣杜鹃菌根真菌rDNA ITS序列分析及接种效应研究

利用rDNA ITS序列对锦绣杜鹃菌根真菌的16个菌株进行了分类分析。根据菌株ITS序列全长计算各菌株间序列相似度和遗传距离,并与GenBank中最相似菌株序列构建系统发育树。结果表明：16个菌株在系统树上聚为3个大分支。其中7个菌株在支持率为100%的基础上与树粉孢属真菌Oidiodendron sp.聚为一类;2个菌株与未鉴定的杜鹃花科植物根系真菌unidentified root associated fungi聚为一类,支持率为100%;其他7个菌株在98%的支持率上与几种未命名的欧石楠类菌根真菌     

大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)无毒基因Avr1a、Avr1k及Avr3a的分子鉴定

【目的】为大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)无毒基因Avr1a、Avr1k和Avr3a快速分子检测提供方法,也为P.sojae其它无毒基因的快速分子检测研究提供依据。【方法】依据GenBank中公布的P.sojae无毒基因Avr1a、Avr1k和Avr3a的序列设计引物,分别筛选出特异性引物,在PCR反应体系和扩增条件优化基础上,对已经接种鉴定过无毒基因Avr1a、Avr1k和Avr3a的86株P.sojae进行PCR检测,建立一套P.sojae无毒基因Avr1a、Avr1k和Avr3a的特异性检测体系。将分子鉴定和接种鉴定结果进行比对,将扩增出的真阳性条带和假阳性条带分别进行胶回收和克隆测序,测序结果分别与3个无毒基因的原序列比对,判定分子标记方法是否适于Avr1a、Avr1k和Avr3a的快速检测。【结果】筛选出的特异性引物均能从含有对应无毒基因的菌株中扩增出约550 bp的条带。Avr1a、Avr1k和Avr3a的分子鉴定及接种鉴定结果符合率依次为45.3%、84.9%和97.7%。3个无毒基因的真阳性条带序列与原序列一致性均达97%以上,Avr1a的假阳性条带与原序列一致性在80%左右,其余2个基因的都在30%以下。【结论】利用Avr1a、Avr1k和Avr3a基因序列分别设计引物建立的检测体系可以用于Avr3a的快速检测,不适于Avr1a的快速检测,是否适合Avr1k的快速检测尚不清楚。     

基于ITS序列分析对我国主要栽培的侧耳品种的鉴定及评价

利用PCR产物克隆测序测定了20个我国主要栽培的侧耳品种的ITS序列,另外从GenBank获得侧耳属15个种25条ITS序列及亚侧耳属2个种的ITS序列。以Hohenbueheliagrisea和H.tremula为外群,运用PAUP软件中的简约分析法(parsimonyanalysis)构建的系统发育树表明:侧耳属Pleurotus是单起源的,20个主要栽培的侧耳品种分别聚在三个组,即Ostreatus-eryngii-populinus复合组、Pulmonarius组、Citrinopileatus-cornucopiae组。Ostreatus-eryngii-populinus组含刺芹侧耳Pleurotuseryngii、白灵侧耳P.nebrodensis、香侧耳Pleurotussp.、阿魏侧耳P.eryngiivar.ferulae、平963-1Pleurotussp.及糙皮侧耳P.ostreatus、日本秀珍Pleurotussp.、平802Pleurotussp.、姬菇Pleurotussp.、灰白侧耳P.spodoleucus、缘刺侧耳Pleurotussp.、凤尾菇P.sajor-caju;Pulmonarius组含肺形侧耳P.pulmonarius、小白平菇Pleurotussp.、平8804Pleurotussp.、平侧5Pleurotussp.、美味侧耳P.sapidus;Citrinopileatus-cornucopiae组含黄白侧耳P.cornucopiae、金顶侧耳P.citrinopileatus、鸡汁菌Pleurotussp.。系统树还显示黄白侧耳与金顶侧耳、白灵侧耳与刺芹侧耳亲缘关系密切,而凤尾菇与肺形侧耳分属于不同的组,属于两个不同的种。基于ITS序列分析,本文还针对目前我国栽培的主要侧耳品种在名称使用上的混淆和混乱进行了初步的评价和讨论。