鉴别差异表达基因的新方法—抑制消减染交法（SSH）

抑制消减杂交法是最近报道的能有效鉴别两个不同细胞群差异表达基因的新方法。该方法是以抑制ＰＣＲ和消减杂交法为基础,在一轮反应中实现ｍＲＮＡ的均等化和消减步骤。本文对ＳＳＨ法的原理,优缺点作了介绍,并与其它检测差异表达基因的方法,如ｍＲＮＡ差别显示江,代表性序列差异分析比较,认为ＳＳＨ方法具有高效快速,高敏感性和假阳性低等优点。     

基因克隆的方法进展

基因克隆一般分为定位克隆和表型克隆。表型克隆进展较快,主要有消减杂交、代表性差异分析法、mRNA差异显示、DNA转染法及抑制消减杂交法。抑制消减杂交法是1996年报道的一种表型克隆的新方法,是目前寻找差异表达基因的较有效方法,较过去的方法有许多先进之外。本文对此方法的原理及应用作一详细介绍,并与其他方法作简单比较。     

抑制消减杂交及其应用

抑制消减杂交(Suppressionsubtractivehybridization,SSH)是以消减杂交为基础结合抑制PCR方法发展起来的分离克隆差异表达基因的一种策略。该方法具有简便易行、特异性高、背景低、重复性好、能分离出丰度较低的特异性片段等特点。主要介绍其原理、方法及其应用,并对方法的优缺点和应用前景作分析。     

弓形虫ZS2和RH株基因差异表达的研究

从RH和ZS2株弓形虫抽提纯化mRNA,经反转录后获得的双链cDNA分别作为driver和tester,采用抑制消减杂交技术(suppression substraction hybridization,SSH)技术扩增ZS2株中差异表达的基因。电泳图谱显示消减的cDNA与未消减的cDNA PCR扩增产物存在明显的差异,说明ZS2和RH株弓形虫转录水平存在着差异。     

单眼视网膜摘除后鸽左右前脑基因的差异表达

利用消减抑制杂交（SSH）技术分析左眼视网膜摘除后成鸽左右前脑基因差异表达情况,对14个重线子经反Northern杂交去除假阳性,最终获得4个阳性重组子,对阳性重组子进行克隆和测序,其中PFB／SSH－8片段长226bp,它的138bp与人CaM I基因外显子有85％的同泊性,PFB／SSH－15片段长252bp,与nexin I alpha非表达序列有低的同源性,另外2个片段未发现有同源物。     

抑制性消减杂交在生物基因克隆中的应用

抑制性消减杂交(SSH)是抑制PCR与消减杂交技术相结合,能对未知序列差异表达基因克隆的一种方法。该方法具有速度快、效率高、假阳性率低、目的序列富集程度高、实验结果复杂程度低等特点。本主要介绍其基本原理、操作过程、优缺点、在生物基因克隆中的应用,并对其应用前景进行了分析。     

水稻穗瘟防卫反应相关基因的分离和鉴定

以遗传背景相近、对叶瘟抗性相同但对穗瘟抗性不同的两个水稻株系为材料,利用抑制消减杂交（SSH）技术构建穗瘟抗／感消减cDNA文库,经差异筛选及序列分析,共获得90个独立的差异表达cDNA克隆,根据与它们刚源的基因功能推测,这些克隆可能参与了对病原菌的防卫反应、信号传导和转录等一些重要的生物学过程。利ⅢRT-PCR分析了26个所筛选到的cDNA克隆在抗／感植株接种后的表达,17个基因的表达差异得到验证。对这螳差异表达基因在抗感株系接种后不同时间点的表达谱也进行了RT-PCR的分析。文章首次报道了什关水稻对穗瘟抗性在mRNA水平进行研究,为深入研究水稻对穗瘟抗性的遗传机理打下了基础。     

血管紧张素Ⅱ诱导心肌成纤维细胞表达上调基因的分离和鉴定

为了对成年大鼠心肌成纤维细胞（cardiac fibroblasts,CF）受血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ,AngⅡ）刺激后上调基因表达谱进行筛选及分析,以受AngⅡ刺激CF为实验方,未刺激CF为驱动方,进行抑制消减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH）,建立消减cDNA文库。经斑点杂交筛选文库后将表达变化显著的部分阳性克隆测序及同源性分析,共获得19个上调表达的基因,分别与细胞外基质、细胞周期、胞内信号转导、细胞骨架及细胞代谢等功能相关,并克隆到7个新的基因表达序列标签（expressed sequence tags,EST）。我们的数据证实了SSH可以有效地克隆成年大鼠CF受AngⅡ刺激后上调表达基因,对这些基因的研究将有助于阐明心肌重塑的分子机制。     

玉米耐铝毒基因的分离

以抑制消减杂交（SSH）为手段,以玉米对铝敏感的自交系Mo17和耐铝的自交系TL94B为材料,分别构建它们的正向和反向消减文库,分别筛选获得了124、47、103和64个阳性克隆。对文库的鉴定表明,插入片段分布在0.25-1．0kb之间,阳性克隆率在18％左右。对338个阳性克隆进行测序,得到232种表达序列标签（EST）,其中70．2％的EST可推测其功能。结果表明,玉米的铝离子胁迫反应涉及胁迫因子的信号传导、响应基因的转录表达与调控、物质的合成与运输、细胞结构和功能的改变等。     

应用抑制性消减杂交技术研究大鼠肝脏热应激过程中基因的差异表达

目的：应用抑制性消减杂交技术,分离热应激过程中出现的差异表达基因,筛选与热应激相关的功能基因片断,探索热应激的分子机理。方法：实验分两组：热应激组和常温对照组,分别提取肝组织mRNA后反转录cDNA。内切酶酶切、接头连接后,以热应激组cDNA为tester,对照组cDNA为driver进行SSH。产物克隆T／A载体构建重组质粒转化感受态细胞后进行分离筛选。结果：mRNA质优量足,反转录cDNA并成功酶切为500bp左右片断。连接效率满意。高效杂交后成功构建消减文库,并初步从中分离获得180个片段。结论：应用SSH技术构建热应激差异表达基因消减文库为筛选热应激相关基因奠定了基础,对探索支配热应激反应的功能基因有积极意义。     

条锈菌诱导的小麦抗病与感病近等基因系SSH文库构建及分析

为分析条锈菌诱导下的小麦抗病与感病近等基因系之间差异表达的基因,以接种小麦条锈菌CY26小种的抗病近等基因系Yr4/6×Taichung 29幼苗叶片cDNA作为实验方,接种CY26的感病亲本Taichung 29幼苗叶片cDNA为驱动方,利用抑制消减杂交(SSH)技术构建了一个包含1 300余克隆的消减文库。对文库中600个克隆进行了反向Northern点杂交筛选,对获得的阳性克隆进一步进行了Northern杂交验证,获得显著差异的克隆12个。经测序和BlastX分析,其中6个差异表达序列的推测产物分别为亮氨酸重复序列蛋白、过氧化氢酶、硫氧还蛋白、RNA结合蛋白、抗坏血酸过氧化物酶和热激蛋白。除亮氨酸重复序列为信号传导类蛋白外、其他几个均为抗病防御类蛋白。     

DADS诱导HL-60 G2/M期阻滞消减文库的构建与初步筛选

目的:构建DADS诱导HL60-细胞G2/M期阻滞的差异表达文库,初步筛选相关基因.方法:分别提取无DADS和有DADS处理HL-60细胞的总RNA和mRNA,构建消减cDNA文库.随即挑选正向SSH的阳性克隆,PCR检测插入片段,将含插入片段的克隆测序.Blastn分析差异cDNA片段的同源性.结果:构建了DADS诱导人白血病HL-60细胞G2/M期阻滞差异表达文库,其中包含120个正向SSH的克隆和100个反向SSH的克隆.50个随机正向SSH的克隆测序、比较同源性,发现5个新EST片段,已经在GenBank中登录.结论:所构建的DADS诱导人白血病HL-60细胞G2/M期阻滞消减文库为进一步筛选白血病HL-60细胞G2/M期阻滞相关基因奠定了基础.     

小鼠生精细胞凋亡相关基因的分子克隆

利用手术隐睾的方法建立小鼠生精细胞凋亡模型,通过光镜、电镜以及原位末端标记法（TUNEL）证实手术隐睾可成功诱导小鼠生精细胞凋亡;在此基础上应用抑制消减杂交法（suppression subtractive hybridization,SSH)对隐睾和对侧睾丸组织的基因表达进行研究,在隐睾组织中分离得到24个高表达cDNA片段,经克隆、PCR和酶切鉴定、测序及匹配分析,证实24个cDNA片段均为新的ESTs,已被GenBank接受并给予新序列编号。任选其中3个cDNA片段作为探针进行Northern印迹杂交,证实它们在隐睾和对侧睾丸组织有差异表达。上述结果提示手术隐睾是研究生精功能降低和睾丸组织凋亡过程中基因表达的适合实验模型,所分离的差异表达cDNA序列可能与生精细胞凋亡密切相关。     

抑制消减杂交（SSH）技术及在克隆基因方面的最新进展

基因表达的变化是调控细胞生命活动的核心机制,分离并克隆差异表达基因已成为现代分子生物学研究的热点,亦是功能基因组学研究的重要内容之一。抑制消减杂交技术以其低假阳性率、高灵敏度等优点,被广泛应用于生物及医学领域中差异表达基因的克隆。     

大鼠心肌缺血预适应诱导表达上调基因的筛选和鉴定

采用反复短时间结扎及松解左冠状动脉前降支构建大鼠心肌缺血预适应动物模型,运用抑制消减杂交技术建立大鼠心肌缺血预适应诱导表达上调基因的消减cDNA文库,通过反向RNA点杂交对部分文库基因进行差异表达初筛,选取表达差异最明显的85个基因进行测序,获得了31个核编码基因和18个新基因（EST）,核编码基因中有相当一部分与细胞保护或信号转导有关,新基因已被GenBank收录.从已测序基因中任选5个进行RT-PCR检测,并任选2个进行RNA印迹检测,均证实在缺血预适应时表达增高.上述结果为进一步深入研究缺血预适应心肌保护作用的分子机制和克隆新的缺血预适应相关基因提供了重要信息.     

抑制消减杂交和辐射小鼠血虚模型筛选"四物汤"诱导表达的基因

应用抑制性消减杂交技术构建受辐射小鼠血虚模型在中药四物汤诱导前后消减cDNA库,并从中克隆鉴定出与四物汤药效相关基因。从受辐射小鼠四物汤诱导前后骨髓细胞中提取mRNA并合成cDNA,分别作为tester和driver进行消减杂交及抑制性PCR,将PCR产物与载体连接构建cDNA库,高效电转化大肠杆菌进行库扩增,随机挑取其中的克隆进行酶切、测序分析。成功构建了具有高消减效率的受辐射小鼠四物汤诱导前后的消减cDNA库。库挑选得到512个阳性克隆。随机挑取30个插入片段测序,生物信息学分析结果显示大部分与红细胞分化、骨髓组织修复、结构重建有密切关系,其中8个为新基因片段。应用抑制性消减杂交技术所构建的受辐射小鼠四物汤诱导前后cDNA消减库为大批量筛选、克隆四物汤药效特异性相关基因奠定了基础。并从分子水平上发现四物汤对抑制凋亡、促进骨髓组织修复和结构重建、诱导红细胞分化的基因具有调节作用,可能和四物汤补血作用有关。     

筛选代表小鼠植入前胚胎紧密化相关基因的EST

分别收集181及241枚昆明白小鼠8细胞早期胚胎及8细胞紧密化胚胎,采用SMART PCR方法直接合成胚胎双链cDNA.进而运用抑制消减杂交技术(SSH)对8细胞早期胚胎及8细胞紧密化胚胎的基因表达进行研究,并将所获得的差异表达产物按片段大小分段分离纯化后克隆入pUCm-T载体中,经PCR鉴定后挑选阳性克隆进行测序,筛选出27个代表8细胞早期胚胎和紧密化8细胞胚胎差别表达基因的cDNA片段;经与GenBank中收录的序列进行同源性匹配分析,证实其中17个eDNA片段为新的EST,提交GenBank后被接受并给予了新序列编号.这1 7个片段均可能为与紧密化密切相关的新基因的表达片段,为今后进一步克隆新的紧密化相关基因的全长cDNA及后续新基因的结构和功能研究打下基础.通过采用不同长度大小片段分别克隆的方法,可获得较长片段的EST,避免差异表达大片段的丢失.     

受褐飞虱取食的水稻幼苗的抑制消减cDNA文库的构建及筛选

采用抑制消减杂交方法,以褐飞虱取食32h的水稻幼苗及未受褐飞虱取食的水稻幼苗为作为对比材料构建了消减cDNA文库,以分离水稻幼苗中褐飞虱应答基因。随机从消减cDNA文库中挑选16个白色菌落提取质粒,进行PCR扩增,发现插入片段的长度位于100～900bp之间。以在受褐飞虱取食的水稻幼苗中特异表达的基因(BpHi008A)为探针,通过斑点印迹分析发现在抑制消减后的cDNA池中,目的基因得到有效富集。利用反向总RNA斑点印迹分析和Northern杂交验证,从消减cDNA文库中筛选到了25个基因受褐飞虱取食的诱导。其中有17个克隆与编码已知功能蛋白的基因有显著的同源性,它们分别参与蛋白质的折叠与降解、蛋白质与蛋白质的相互作用及信号传递、脂类代谢、胁迫反应、物质运输和细胞生长等。总体上,参与胁迫反应和衰老的基因在褐飞虱取食后表达增强。     

抑制消减杂交法筛选原发性肝细胞癌中差异表达的基因及其生物学意义

为了筛选原发性肝细胞癌 (hepatocellularcarcinoma ,HCC)中差异表达的基因 ,以了解HCC发生发展的分子基础 ,选取了一例早期高分化肝癌标本作为材料 ,采用抑制消减杂交 (suppressionsubtractivehybridization ,SSH)技术 ,进行了前向及反向消减杂交 ,结合反向Northern印迹筛选 ,得到多个差异表达的基因 .对有意义的基因用半定量RT PCR检测了肝癌中的表达 .结果显示 ,PON2、hSRP1alpha、H4 1在大部分肝癌中表达升高 ,IGFBP1、ITIH1在早期癌症中 ,大部分癌的表达升高 ,在晚期癌症中则表达下降 .EGR1在大部分肝癌中表达降低 .研究表明 ,不同分化程度、不同临床分期的肝癌 ,有共同的或不同的基因表达发生改变 ,明确这些差异表达的基因谱 ,对于肝癌发生发展机理的阐明及肝癌的预防、诊断、治疗都有重要意义 .