蓝莓磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因cDNA克隆及表达分析

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPCase,EC4.1.1.31)在植物代谢过程中发挥重要作用。本研究从蓝莓果实中克隆到磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因VcPEPC。该基因开放阅读框全长为2 907 bp,可编码968个氨基酸,分子量为110.59 kD。由于该蛋白具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶结构特征,认为VcPEPC属于PEPcase家族(pfam00311)。二级结构预测表明,VcPEPC蛋白序列含有双螺旋(54.44%)、扩展链(11.67%)、β转角(6.71%)以及无规则卷曲(27.17%)。进化树分析发现VcPEPC与瓜、蓖麻和葡萄遗传距离较近。反转录PCR分析表明,VcPEPC基因在蓝莓根、茎、叶、花、果实中均有表达。在奥尼尔叶片中的表达量高于蓝丰、布里吉塔和夏普兰,在夏普兰绿色大果中表达量较高,成熟后基因表达下调。     

油菜转抗草甘膦、抗虫基因获得双抗植株

以草甘膦为筛选剂,用农杆菌介导法将编码5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）的aroA—M12基因和编码苏云金杆菌毒蛋白的Btslm基因导入到甘蓝型油菜优良品种湘油15号中。在用草甘膦对转化体进行筛选的基础上．对转基因再生植株进行了PCR检测、Southern blot和Western blot分析．结果证明外源基因确已导入到该油菜品种中,而且表达了相应的蛋白。对转基因植株进行抗草甘膦、抗虫性鉴定的结果表明．转基因植株具有抗草甘膦、抗虫的双重特性。研究结果还表明抗草甘膦的aroA—M12基因在植物基因转化中,既可以用作抗除草剂基因,又可以代替常用的抗生素标记,用作植物筛选标记基因。     

木薯磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因全长cDNA克隆及表达分析

应用巢式PCR从木薯栽培种(Manihot esculenta)Arg7和野生种W14(M.esculenta subsp.flabellifolia)叶片中克隆到磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因pepc全长cDNA,GenBank序列号为JN387052和JN387053。cDNA全长2945 bp,含1个2895 bp的开放阅读框,预测编码的蛋白含964个氨基酸,具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶保守结构域。木薯PEPC与麻疯树和蓖麻的PEPC氨基酸序列具有高度同源性。表达分析表明pepc在W14和Arg7叶中的表达量最高,其次是须根和块根,茎中最低。单日表达量动态分析表明,Arg7叶中pepc总体表达量高于W14,但是16∶00后W14高于Arg7,推测两种木薯pepc调控区域存在差异。     

人源多巴脱羧酶的表达、纯化以及高通量抑制剂筛选模型的建立

帕金森病是一种常见的神经系统退行性疾病。多巴脱羧酶（DDC）是帕金森病研究的靶点蛋白之一,但是目前没有高通量的测活模型。因此,需要构建一种高通量多巴脱羧酶抑制剂的筛选模型,用于发现新型抑制剂。采用克隆表达纯化得到多巴脱羧酶和用于酶偶联反应的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）。基于一系列酶联反应将CO2固定,检测其含量,从而测定多巴脱羧酶的活性。结果得到人源多巴脱羧酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的体外纯酶,建立了一种高通量筛选模型,并且从70个天然化合物中,筛选得到2个多巴脱羧酶的抑制剂。成功构建了一种基于体外纯酶高通量多巴脱羧酶抑制剂的筛选模型。     

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的敲除对北京棒杆菌PD-67的生理代谢的影响

【目的】为了优化L-色氨酸合成的前体供应,构建北京棒杆菌PD-67(Corynebacterium pekinense PD-67)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(EC:4.1.1.31,phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPCx)基因ppc敲除的菌株,并研究ppc基因敲除对菌株生理特性的影响。【方法】运用PCR技术扩增ppc基因的上游和下游序列,构建带有目标基因内部缺失的基因整合载体。通过同源重组技术将C.pekinense PD-67的ppc基因敲除,构建ppc基因缺陷突变株C.pekinense PD-67-Δppc。通过摇瓶发酵研究突变株的生理特性,并测定突变株丙酮酸激酶和丙酮酸羧化酶的活性。【结果】PCR验证和PEPCx活性分析结果表明,筛选到ppc缺陷的突变株。摇瓶发酵结果表明,与出发菌株相比,突变株的生长速率下降,生物量降低20%,L-色氨酸积累降低62%,丙酮酸激酶活力提高,而丙酮酸羧化酶活力下降。【结论】C.pekinense PD-67的ppc基因敲除以后,对菌株的代谢影响较大。仅通过阻断PEPCx催化的回补途径,减少磷酸烯醇式丙酮酸的分支代谢,不能提高该菌株L-色氨酸的积累。     

应用反义PEP基因表达技术提高稻米脂肪含量

以成熟种子为来源的胚性愈伤组织为受体材料,采用根癌农杆菌介导方法将反义磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvatecarboxylase,PEPCase)基因导入粳稻品种秀水11,获得一批转基因植株,并通过GUS组织化学染色、PCR检测和Southern杂交分析等方法进行了验证。对T1代的检测结果表明,所转基因已遗传给后代,且大多数株系的分离比符合3:1。T2代测定结果显示,转基因水稻株系的稻米脂肪含量比对照高出0.37±0.12个百分点,其差异大部分达到极显著水平。     

过表达海洋微生物宏基因组MbCSP提高转基因拟南芥的抗旱和耐寒性

干旱和低温是影响农作物生长发育的重要因素,培育转基因作物是解决此问题的有效途径。冷激蛋白（Cold Shock Proteins,CSPs）是一类高度保守的核酸结合蛋白,参与非生物胁迫应答等细胞生理活动,转CSP基因可增强作物抗逆能力。以海洋微生物宏基因组DNA为模板,采用锚定PCR的方法克隆得到了MbCSP基因,其ORF为216 bp,编码一个由71个氨基酸构成的蛋白;对其进行同源性分析,显示该氨基酸序列与EcCSPG、EcCSPA（大肠杆菌 Escherichia coli）,BsCspB（枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis）和BcCspA（蜡样芽孢杆菌 Bacillus cereus）等冷休克蛋白氨基酸序列同源性在60%~90%;对该氨基酸序列进行多重序列比对和系统发育树分析,结果发现MbCSP蛋白包含RNP1（KGFGFI）和RNP2（VFVHF）等CSP蛋白经典的保守结构域,其与EcCspG（大肠杆菌）和CmCspG、CmCspB（堆肥宏基因组）等生物的冷休克蛋白亲缘关系较近。为进一步探讨冷休克蛋白MbCSP的功能,构建了植物表达载体pTF101-MbCSP,采用花序浸染法转化拟南芥,经过除草剂筛选和PCR检测,获得转基因植株。进行半定量RT-PCR分析,选择表达量最高的阳性株系进行后续的生理检测。结果表明：在干旱胁迫及低温胁迫下,转基因拟南芥的生长状况明显优于野生型,其生物量显著高于野生型植株;转基因拟南芥的叶片相对含水量、叶绿素含量和超氧化物歧化酶活性均高于野生型拟南芥,而丙二醛含量则低于野生型拟南芥。上述结果表明,过表达海洋微生物宏基因组MbCSP能够提高转基因拟南芥的抗旱和耐寒能力,为培育转基因作物新品种奠定了基础。     

Floral-dip转化法将PEPC基因ihpRNA干扰表达载体导入甘蓝型油菜

根据磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)基因控制油菜籽中蛋白质与脂肪酸合成的原理,构建了PEPC基因片段ihpRNA干扰表达载体,该载体包含了一个PEPC基因片段正反向序列的回文结构．表达RNA干扰的载体结构（ihpRNA）,在大肠杆菌体内进行克隆的过程中易被大肠杆菌自身携带的某种酶剪切,剪切位点不确定,可能是一种随机性的剪切．通过反复实验,最终获得了一个与我们设计一致的PEPC基因片段正反向序列结构, RNA干扰表达载体构建获得成功．利用花序浸渍法(floral-dip)转基因将构建的PEPC基因ihpRNA干扰表达载体转移到甘蓝型油菜中,并通过抗性筛选、PCR特异扩增、PCR-Southern杂交和克隆测序,对获得的转基因植株进行了鉴定,转化率达到了069%,说明floral-dip方法有效地实现了ihpRNA干扰表达载体的遗传转化     

丙酮酸磷酸双激酶及其基因结构

丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）在植物C4光合途径中催化CO2原初受体磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的形成。本文介绍PPDK的类型、分布、生理功能、活性调节、基因结构和C4植物的PPDK基因转化C3植物及其与转基因植株光合作用之间关系的研究进展。     

Epsps基因为筛选标记的多基因抗虫表达载体构建

目的:为了获得水稻的广谱抗虫性,同时也避免由潮霉素抗性基因引起的安全性问题.构建以抗除草剂基因(Epsps 基因)为筛选标记的多基因抗虫植物表达载体 pCTSK.方法:以双元载体pCAMBIA1300为基础,将潮霉素抗性基因hpt替换成携带烟草叶绿体转运肽序列TSP的草甘膦抗性突变基因aroAM12(编码细菌5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶Epsps)作为筛选标记基因,获得中间表达载体pCISM1300.然后再连接上3个抗虫基因(马铃薯蛋白酶抑制剂基因Pin-Ⅱ、苏云金杆菌毒蛋白基因Bt cryI(A)及雪花莲外源凝集素基因 CNA)的完整表达片段(包含各自的启动子和终止子).结果:通过PCR方法和酶切方法鉴定已成功地构建了该表达载体;通过不同实验方案的数据分析,得出在载体构建的大分子连接中优化的一次连接法连接效率高于二次连接法的结论.     

Overproduction of Arabidopsis thaliana FeSOD confers oxidative stress tolerance to transgenic maize.

Transgenic maize (Zea mays L.) plants have been generated by particle gun bombardment that overproduce an Arabidopsis thaliana iron superoxide dismutase (FeSOD). To target this enzyme into chloroplasts, the mature Fesod coding sequence was fused to a chloroplast transit peptide from a pea ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase gene. Expression of the chimeric gene was driven by the CaMV 35S promoter. Growth characteristics and in vitro oxidative stress tolerance of transgenic lines grown in control and chilling temperatures were evaluated. The transgenic line with the highest transgenic FeSOD activities had enhanced tolerance toward methyl viologen and had increased growth rates.     

过量表达AtNHXS1新基因提高烟草耐盐性的研究

拟南芥液泡膜上的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白是由 AtNHX1 基因编码的一种重要的植物耐盐性因子。 AtNHXS1 是利用DNA改组(DNA shuffling)技术对 AtNHX1 基因进行定向分子进化获得的新基因。利用农杆菌介导的叶盘法将该基因转入烟草中,经过潮霉素和PCR鉴定,得到了10个独立的转基因株系。对其中两个PCR阳性株系进行Southern blot 鉴定,确定 AtNHXS1 以单拷贝的形式成功地插入到烟草的基因组中。荧光定量PCR分析表明, AtNHXS1 基因可以利用烟草的转录体系正确转录。在盐处理下,随着盐浓度的提高,植株不同组织部位 AtNHXS1 基因的表达均有不同程度的提高,其中叶片上调趋势最明显。耐盐性试验结果表明,盐处理下,转基因烟草的长势明显优于野生型。400 mmol/L NaCl 处理下,野生型烟草完全死亡,转基因烟草生长受到抑制,但是仍然能够正常生长。研究结果表明, AtNHXS1 新基因能够显著提高烟草的耐盐性。     

pFGC5941的改造及拟南芥NAC1和SIP1双基因反义表达载体的构建和遗传转化

拟南芥中的SIP1基因编码的蛋白与拟南芥盐胁迫应答中的关键蛋白SOS2存在互作关系,而NAC1为拟南芥中介导生长素信号促进其侧根发生的蛋白。本研究中我们将SIP1基因和NAC1正义基因以及SIP1基因和NAC1反义基因分别整合到一个经改造的具有2个35S启动子的可用于双基因表达的载体pFGC5941S中,构建了两个双基因表达载体pFGC5941S SIP1 NAC1 sense和pFGC5941S SIP1 NAC1 anti。并将这两个载体通过农杆菌介导的方法转化到野生型拟南芥中,共获得15株转基因植株。对这些转基因植株进行盐胁迫实验发现,在含75mmol·L-1 NaCl的MS培养基上,相比于野生型,pFGC5941S SIP1 NAC1 sense转基因植株主根增长,侧根数量明显增多,而pFGC5941S SIP1 NAC1 anti转基因植株长势与野生型苗相似。由此我们推测可能只有当SIP1和NAC1同时过表达时,才会促进盐胁迫下拟南芥侧根的发育。     

Modification of pFGC5941 Construct and Transfer of Double Antisense Genes of NAC1 and SIP1 into Arabidopsis thaliana

SIP1 encodes the protein which show interact with SOS2, the protein involving in plant responding to saline stress while NAC1 encodes the protein which involves in auxin signal and promoting the development of lateral root of Arabidopsis thaliana. In present study SIP1 and NAC1-sense and NAC1-anti were inserted into pFGC5941S constructs, making the expression vectors pFGC5941S-SIP1-NAC1-sense and pFGC5941S-SIP1-NAC1-anti, respectively. Fifteen transgenic A.thaliana harboring these two constructs (pFGC5941S-SIP1-NAC1-sense and pFGC5941S-SIP1-NAC1-anti) were then generated via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. The phenotypes of homozygous transformants which were grown on MS medium with 75mmol·L-1 NaCl showed that compared with wild-type A.thaliana, pFGC5941S-SIP1-NAC1-sense transgenic plants exhibited longer main root and increasing amounts of lateral roots, while no obvious differences were observed in pFGC5941S-SIP1-NAC1-anti transgenic plants. These results indicated that the development of A.thaliana lateral roots under salt stress was specifically promoted by both overexpression of SIP1 gene and NAC1 gene.     

A soybean plastid-targeted NADH-malate dehydrogenase: cloning and expression analyses

A typical soybean (Glycine max) plant assimilates nitrogen rapidly both in active root nodules and in developing seeds and pods. Oxaloacetate and 2-ketoglutarate are major acceptors of ammonia during rapid nitrogen assimilation. Oxaloacetate can be derived from the tricarboxylic acid (TCA) cycle, and it also can be synthesized from phosphoenolpyruvate and carbon dioxide by phosphoenolpyruvate carboxylase. An active malate dehydrogenase is required to facilitate carbon flow from phosphoenolpyruvate to oxaloacetate. We report the cloning and sequence analyses of a complete and novel malate dehydrogenase gene in soybean. The derived amino acid sequence was highly similar to the nodule-enhanced malate dehydrogenases from Medicago sativa and Pisum sativum in terms of the transit peptide and the mature subunit (i.e., the functional enzyme). Furthermore, the mature subunit exhibited a very high homology to the plastid-localized NAD-dependent malate dehydrogenase from Arabidopsis thaliana, which has a completely different transit peptide. In addition, the soybean nodule-enhanced malate dehydrogenase was abundant in both immature soybean seeds and pods. Only trace amounts of the enzyme were found in leaves and nonnodulated roots. In vitro synthesized labeled precursor protein was imported into the stroma of spinach chloroplasts and processed to the mature subunit, which has a molecular mass of ～34 kDa. We propose that this new malate dehydrogenase facilitates rapid nitrogen assimilation both in soybean root nodules and in developing soybean seeds, which are rich in protein. In addition, the complete coding region of a geranylgeranyl hydrogenase gene, which is essential for chlorophyll synthesis, was found immediately upstream from the new malate dehydrogenase gene.     

pFGC5941的改造及拟南芥NAC1和SIP1双基因反义表达载体的构建和遗传转化

拟南芥中的SIP1基因编码的蛋白与拟南芥盐胁迫应答中的关键蛋白SOS2存在互作关系,而NACl为拟南芥中介导生长素信号促进其侧根发生的蛋白。本研究中我们将SIPl基因和NAC1正义基因以及SIP1基因和NAC1反义基因分别整合到一个经改造的具有2个35S启动子的可用于双基因表达的载体pF—GC5941S中,构建了两个双基因表达载体pFGC5941S-SIP1-NAC1-sense和pFGC5941S-SIP1-NACl-anti。并将这两个载体通过农杆菌介导的方法转化到野生型拟南芥中,共获得15株转基因植株。对这些转基因植株进行盐胁迫实验发现,在含75mnlol·L-1 NaCl的MS培养基上,相比于野生型,pFGC5941S-SIP1-NAC1-sense转基因植株主根增长,侧根数量明显增多,而pFGC5941S-SIP1-NAC1-anti转基因植株长势与野生型苗相似。由此我们推测可能只有当SIP1和NAC1同时过表达时,才会促进盐胁迫下拟南芥侧根的发育。     

油棕DGAT2基因启动子克隆及表达的组织特异性研究

以油棕(Elaeis guineensis Jacq.)叶片基因组DNA为模板,克隆获得长度为1035 bp的二酰甘油酰基转移酶基因(DGAT2)的启动子区序列。序列分析结果表明,DGAT2基因启动子含有大量光反应元件、激素响应元件及部分转录因子结合位点。本研究同时构建了DGAT2基因启动子和GUS基因植物融合表达载体,通过蘸花法侵染拟南芥(Arabidopsis thaliana L.),并对转基因拟南芥中GUS基因表达的特异性进行了分析。结果显示,GUS基因在拟南芥各组织中均有表达,但没有明显的组织特异性;荧光定量PCR分析结果表明DGAT2在油棕不同器官中的转录水平存在明显差异。     

甘蓝型油菜线粒体功能未知基因 ORF 117的载体构建与转化

本研究克隆了甘蓝型油菜线粒体功能未知基因 ORF 117,构建了带有线粒体转运信号肽序列（TP ）的植物过表达载体35S ∷TP-ORF117、35S ∷TP-EGFP 和35S ∷TP-ORF117-EGFP ,转化野生型拟南芥并进行抗除草剂筛选,共获得纯合的转基因拟南芥株系62个。qPCR 表明,ORF 117在转基因材料中得到高效过表达。用转35S ∷TP-EGFP 、35S ∷TP-ORF117-EGFP 拟南芥制备原生质体,经线粒体特异染料染色,在激光共聚焦显微镜下做线粒体、GFP 共定位检测,GFP 蛋白和 ORF117-EGFP 融合蛋白被准确定位到了线粒体。