幽门螺杆菌液体培养工艺的研究

Hp的液体培养尤其是大规模培养仍存在许多问题,通过单因子试验统计分析。优化筛选了适于幽门螺杆菌的液体培养基和摇瓶培养条件。结果表明,在适宜的摇瓶培养条件下,Hp能够在添加β-环糊精（β-Cyclodextrin,β-CD）的布氏肉汤中很好地生长,菌体收获量达到0.6g/mL。     

金针菇FV088菌株液体培养工艺的研究

通过单因子试验统计分析,优化筛选了适于金针菇（Flammulinavelutipes）FV088的适宜培养基和摇瓶培养条件,结果表明,其适宜的液体培养基组成为：5.0％玉米粉,2．0％鼓皮,0．L％KH₂PO₄,0．05％MgSO₄·7H₂O,10μgVB₁／100ml,50μgVB₂／100ml;适宜的摇瓶培养条件为：培养基的起始pH6．0～7．0,500ml     

透明颤菌血红蛋白的表达对酵母中麦角固醇合成的影响

构建了含透明颤菌（Vistreoscilla）血红蛋白基因vgb和酵母遗传霉素（G418）抗性基因的重组质粒pVgbkanMX4,转化至酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 1190中,经过分析,基因vgb在酵母细胞中得到表达。对重组菌和野生菌进行了摇瓶培养及5 L发酵罐培养的研究。在摇瓶实验中,重组菌的麦角固醇产量比野生菌有显著提高,在野生菌中的含量为0.573%、而在重组菌中的产量为1.07%。 经过30 h发酵罐培养的实验,野生菌中麦角固醇含量为0.9%,重组菌中其含量为1.38%,验证了摇瓶实验的结果。结果证明vgb基因有利于酵母中麦角固醇的合成。     

以摇瓶所得摄氧率为基准进行发酵放大

通过设计特殊摇瓶,用亚硫酸盐法测出摇瓶口纱布层氧通透率的基础上,在实际发酵情况下通过测定瓶内气、液相氧的变化得出其发酵过程中的摄氧率(OUR)及氧传递系数(K_La)。以特制摇瓶取得的菌体CUR为基准进行发酵过程和发酵罐的放大。通过质谱仪在线检测及采样分析,研究了3种不同供气流量及搅拌转速下的放大结果。摇瓶与发酵罐在菌体OUR、菌体产量方面吻合很好,而在整个放大过程中,发现摇瓶与发酵罐内的氧传递系数(K_La)、溶解氧(C_L)差异较大。     

培养幽门螺旋杆菌的发酵工艺研究

采用摇瓶微需氧培养技术,模拟发酵条件,探讨不同因素（pH、转速、种子菌接种量）对幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori,Hp）生长的影响,优化工艺参数,并级联放大到10L发酵罐发酵,经多次实验,建立了稳定的Hp发酵工艺,24h发酵细菌的最大吸光度A600达3.89,收获菌体湿重达5.2g／L。     

富硒姬松茸液体培养条件的研究

采用液体摇瓶培养法 ,对姬松茸 (Agaricusblazei)富硒培养条件进行初步研究 ,结果表明 :富硒姬松茸液体培养的最佳培养基配方为玉米粉 30 g/L ,葡萄糖 2 0g/L ,硫酸铵 2 g/L ,酵母膏 3g/L ,KH₂ PO₄ 2 g/L ,MgSO₄ ·7H₂ O 1 g/L ,维生素B11 0 0mg/L ;采用 1mg/L亚硒酸钠驯化菌种 ,2 5 0mL三角瓶装量 80mL ,p     

人三叶因子3在毕赤酵母中表达条件的研究

为提高人三叶因子 3 (HumanTrefoilfactor 3 ,hTFF3 )在毕赤酵母中的表达量 ,研究了转化子生长的培养条件 ,包括不同碳源对转化子生长的影响和接种量、甲醇浓度、pH值、摇瓶转速及不同诱导时间对人三叶因子 3表达的影响。结果表明转化子在生长阶段加入葡萄糖生长旺盛 ,培养 14h后OD₆₀₀ 就可达到 50。在 100mL生长培养基上的菌液以 1∶1接入诱导培养基时蛋白表达量最高 ;转化子在 1%的甲醇、pH60、摇瓶转速240r/min的条件下诱导4 8h ,菌体密度OD₆₀₀为 15 ,目的蛋白表达量达到 20mg L。用 5L发酵罐进行了高密度发酵 ,经2%甲醇32h诱导 ,最终菌体密度OD₆₀₀ 达到 120 ,每升发酵液中含目的蛋白100mg。     

摇瓶的体积氧传递系数和氧通透率的测定

通过设计特殊摇瓶,用亚硫酸钠法测出摇瓶的体积氧传递系数和氧透过纱布层的通透率。以氧电极测其内外氧的分压降后,可以算出摇瓶表观体积氧传递系数(k_La)app及真实体积氧传递系数k_La,并进一步求出氧通透率。由实验得出：氧分压降低6．1％,氧传递系数增加一倍;在37c、220r／min、500m1摇瓶(内盛液50m1)8层纱布的氧通透率Pm=43．7moI／m²·h·arm;并且关联出摇瓶容积V、装液量VL、转速n、摄氏温度t之间的模型式：(k_La)_app=1．84×10^-7[t]1.8479·[n]2.3906.(VLV]-0.6360(kLa)=2．02×10^-7[t]1.8525·[n]2.39441·[VLV]-0.6370     

β—N-乙酰氨基己糖苷酶产生菌的筛选与产酶条件

筛选了真菌、细菌和放线菌共1121株,其中有β-HexNAcasc活力的有237株,在所筛选菌中只要有β—GlcNAcase活力,也就有β-GalNAcase活力,但两酶比值(β-GlcNAcase／β—Gal-Nacase)不同。所筛选出的溜曲霉(ASP.tamarii)S215为由土壤中分离的,其产酶最适条件为5％麸皮液体培养基,28—30℃振荡培养5—6天,补充碳源如纤维二糖、葡萄糖胺、半乳糖胺或者补充氮源(NH4)2SO4及NH4NO3,可以稍稍提高酶活。在溜曲霉的培养液中除β-GlcNAcase及β-GalNAcase外,还有a-半乳糖苷酶、β一半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、β-岩藻糖苷酶及α-甘露糖苷酶。     

曲酸菌选育及发酵工艺研究

筛选获得产曲酸菌株米曲霉（Aspergillusoryzae）MSA进行⁶⁰Co诱变,并进行了发酵工艺条件研究,以葡萄糖为碳源、豆饼粉为氮源,在pH3.0、33℃摇瓶培养,可达到5d产酸5％以上水平。发酵液采用直接浓缩结晶工艺,脱色与重结晶后获得无色针状晶体,红外图谱检测确证为曲酸。     

青霉NXP25纤维素酶的产生及性质

青霉（Penicillium sp.）NXP25在5％玉米穗轴粉,3％（麦夫）,0.35％氮源10号和0.3％氯化钙组成的液体培养基（起始pH 5.0）中,10％接种量,29℃,280r/min振荡培养72h。在50℃温度下测定,发酵液内切-1,4-β-葡聚糖酶,外切-1,4-β-葡聚糖酶,β-葡糖苷酶和滤纸酶活力分别为841u/mL,13u/mL,24u/mL和46u/mL。各类型酶最适作用条件分别为pH4.8和60℃、pH5.0和50℃、pH4.     

紫外线诱变选育高产PHB解聚酶的菌株*

以降解聚-β羟基丁酸酯(PHB)的青霉(Penicilliumsp.)DS9713a为出发菌株,通过紫外线(UV)诱变分生孢子,采用透明圈初筛和摇瓶复筛,获得酶活高于原始菌株的突变株5株,其中DS9713a-CS01突变株的PHB解聚酶活力高于对照97.42%,并对其酶学性质进行了初步研究。     

海枣曲霉产生的糖苷酶类

以木聚糖酶、β-D-岩藻糖苷酶活力较高的海枣曲霉作为试验菌株。该菌株的粗酶液含有多种糖苷酶,活力较高的有木聚糖酶、地衣多糖酶、β-木糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、β-D-岩藻糖苷酶及β-半乳糖苷酶等。其β-D-岩藻糖苷酶活力还高于β-半乳糖苷酶。将海枣曲霉培养不同时间后测活力,表明木聚糖酶在培养的第2天即大量产生,第3天达到高峰。Β-D-岩藻糖苷酶在第4天开     

溶氧反馈分批补料高密度培养人骨形成蛋白-2工程菌

对表达人骨形成蛋白2成熟肽的基因工程大肠杆菌E.coli DH5α/pDH-B²m在500mL摇瓶中进行了培养条件的摸索实验,并在此基础上扩大至NBS Bioflo IV 20L发酵罐,利用溶氧反馈-分批补料培养技术：在培养过程中保持适当的溶解氧（40%）,以溶氧值在线反馈控制搅拌速度及流加补料培养基,使细菌保持适当的比生长率,成功地进行了工程菌的高密度培养,最终菌体密度达OD₆₀₀=57,每升干菌量22.8 g,目的蛋白的表达量占细菌总蛋白的30%,人骨形成蛋白2成熟肽的理论产率达到3.59 g/L。      

热带假丝酵母细胞内pH的测定及其与生长代谢活性的关系

应用荧光探针5(6)-双醋酸羧基荧光素 (Carboxyfluorescein diacetate) 测定了产长链二元酸热带假丝酵母 (Candida tropicalis) 细胞内pH (pHi) 值,确定了该探针载入C. tropicalis细胞的适宜条件。用摇瓶培养C. tropicalis细胞,考察了细胞外pH和生长碳源对pH_I的影响,实验结果表明：细胞外pH对pH_I略有影响,而生长碳源对pH_I的影响略为明显。利用5L发酵罐进一步研究了细胞生长代谢活性与pHi的关系,结果表明：细胞比生长速率、CO₂比生产速率和葡萄糖比消耗速率与pHi变化密切相关,pH_I的增加伴随着细胞生长活力的增加,反之亦然。在pH6.0条件下用葡萄糖和醋酸钠共作碳源培养C. tropicalis细胞时,测得的pH_I值维持在5.72～6.15范围内。     

透明颤菌血红蛋白基因vgb和腈水解酶基因bxn在毕赤酵母中的表达研究

为获得高效表达外源蛋白的Pichiapastoris菌株而设计了重组质粒pPIC9K-vgbbxn ,其中透明颤菌血红蛋白基因vgb胞内表达以提高菌体的发酵密度 ,腈水解酶基因bxn分泌表达。转化GS115菌株后 ,通过PCR、SDS-PAGE检测证实两基因已经整合进酵母基因组且能高效表达 ,以及用准确的蛋白活性测定方法成功地检测到二者所表达的产物均具有正常的活性。摇瓶发酵实验证明 ,血红蛋白在贫氧条件下可明显促进酵母菌体生长和bxn基因分泌表达.     

球孢白僵菌高壳聚糖酶突变株的筛选*

以球孢白僵菌 (Beauveriabassiana) 1 31 6为出发菌株 ,通过紫外线和高能电子束分别诱变分生孢子 ,采用平板透明圈法初筛和摇瓶培养复筛的方法 ,经 3轮诱变 ,筛选到 5株高产突变株。其中一株最高产的定名为Beauveriabassiana 131 6-V1 ,其壳聚糖酶活力是原始菌株的 1 6倍 ;而且经传代培养 ,其高产特性能够稳定遗传。     

SARS冠状病毒核衣壳蛋白在酵母中的表达与活性检测

用PCR扩增SARS冠状病毒N蛋白全长cDNA,克隆到酵母表达载体pPIC3.5K,构建pPIC3.5K-SCoVN酵母表达质粒。表达质粒线性化后电转化到毕赤酵母GS115中,经G418-RDB, MM/MD平板与PCR扩增筛选获得His⁺ Mut⁺ 重组菌株。比较研究了不同的培养基、溶解氧以及甲醇浓度对菌株生长与重组蛋白表达的影响。结果表明：FBS培养基最适宜重组菌的生长与表达,溶氧对菌体的生长与表达有显著的影响,甲醇诱导最佳终浓度为1％（V/V）,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达量,发现重组N 蛋白表达量占细胞总蛋白的6％,每升培养基可以生产410mg重组N蛋白,生物量达45OD600。Western　blotting结果表明,重组N 蛋白对鼠源单克隆抗体以及SARS病人恢复期血清具有较强的特异性反应。对摇瓶培养条件进行了发酵罐放大实验,结果生物量达到348OD600,表达量达到 2.5g/L,分别为摇瓶表达的7.7倍和6.1倍,为SARS早期血清学诊断研究以及为N蛋白在病毒复制以及致病机理的研究奠定了一定的基础。     

重组嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila 4AK4中3-羟基丁酸3-羟基己酸共聚酯PHBHHx的发酵生产

3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚酯（PHBHHx）是一种性能优良的新型生物可降解材料,其机械和加工性能与3-羟基己酸（3HHx）在共聚物中的含量密切相关。在嗜水气单孢菌Aeromonas hydrophila 4AK4中引入了编码β酮基硫解酶 (β-ketothiolase)的phbA基因和编码乙酰乙酰辅酶A还原酶(AcetoacetylCoA reductase)的phbB基因,使重组菌增加了一条利用乙酰辅酶A合成3羟基丁酸-CoA的代谢途径,这使得利用非相关性碳源调控PHBHHx的单体组成比例成为可能。利用葡萄糖酸钠和月桂酸作为碳源,对重组Aeromonas hydrophila 4AK4进行了摇瓶培养及5 L发酵罐培养的研究。在摇瓶实验中,通过改变碳源中两种组分的比例,可以使A. hydrophila 4AK4合成的PHBHHx中的3HHx摩尔含量由原来的15%左右降低到3%～12 %,成功地实现了对PHBHHx单体组成的调控;当以月桂酸为唯一碳源时,在5 L发酵罐中,经过56 h的培养,获得了51.5 g/L的细胞干重（CDW）,其中62 %为PHBHHx,3HHx在PHBHHx中的摩尔含量为9.7 %;当以1:1的葡萄糖酸钠和月桂酸为碳源时,48 h的5 L发酵罐培养获得了32.8 g/L的CDW和52 %的PHBHHx含量,其中3HHx在PHBHHx中的摩尔含量为6.7 %。结果证明了该重组菌在大规模生产单体组成可控PHBHHx方面具有很大的应用潜力。     

芽孢杆菌M_(50)产生β甘露聚糖酶的条件研究

从土壤中分离到９ 株产生β甘露聚糖酶的芽孢杆菌（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ ．） 。Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ ． Ｍ５０２５０ｍ Ｌ三角瓶摇瓶培养试验,以４ ％ 的魔芋粉为碳源,１－０ ％ （ ＮＨ４）２ＳＯ４ 为氮源,０－３５ ％Ｎａ２ＣＯ３ ,３０ ～３４ ℃培养６０ｈ 产酶达到高峰。酶活力为１８０ ～２００ｕ／ｍ Ｌ。１００Ｌ 罐发酵,在３０ ～３２ ℃,１∶０ ．７５ｖｖｍ 通气量,２００ｒ／ｍｉｎ 条件下,发酵液酶活力高达３３０ｕ／ｍ Ｌ。酶的最适反应温度和ｐＨ 分别为５０ ℃和６－０ ,低于５０ ℃,ｐＨ５ ．０ ～７ ．０ 酶稳定。Ｆｅ^３＋ 、Ａｌ^３＋ 、ＥＤＴＡ、Ｈｇ^２＋ 对酶有抑制作用,而Ｂａ^２＋ 、Ｍｎ^２＋ 对酶有激活作用。发酵粗酶液对苎麻精干麻精练,显示对精干麻的半纤维素残胶具有降解作用。