血竭对背根神经节细胞河豚毒素不敏感型钠电流的调制及其药效物质的确定

为了阐明血竭对背根神经节细胞河豚毒素不敏感型钠通道电流的调制作用并探求其相应的药效物质, 应用全细胞膜片钳技术在急性分离的大鼠背根神经节细胞上观察血竭, 和其化学成分剑叶龙血素A, 剑叶龙血素B, 龙血素B以及它们的组合对河豚毒素不敏感型钠通道电流的影响; 根据所建立的中药药效物质的操作型定义, 判别血竭调制背根神经节细胞河豚毒素不敏感型钠通道电流的药效物质; 应用Greco等人建立的模型分析化学成分间的相互作用. 结果表明, 血竭对河豚毒素不敏感型钠通道电流峰值有浓度依赖的抑制作用, 并影响通道电流的激活过程; 剑叶龙血素A, 剑叶龙血素B和龙血素B的组合能产生类似于血竭的对河豚毒素不敏感型钠通道电流的调制作用; 3种化学成分单独作用也能调制河豚毒素不敏感型钠通道电流, 但在所产生的对电流峰值的抑制率相等时, 3种化学成分单独作用时各自所需的浓度高于组合作用时各自所需的浓度; 剑叶龙血素A, 剑叶龙血素B和龙血素B在调制河豚毒素不敏感型钠通道电流时具有协同作用. 上述结果说明血竭调制背根神经节细胞河豚毒素不敏感型钠通道电流, 干预痛觉信息传入, 也是血竭产生镇痛作用的原因, 其药效物质是剑叶龙血素A, 剑叶龙血素B和龙血素B这3种化学成分的分子有效组合.     

分析药物相互作用的方法在中药研究中的应用

目的研究血竭中的成分剑叶龙血素A和剑叶龙血素B联合应用于大鼠背根神经节细胞膜河豚毒素不敏感型电压门控性钠通道时所产生的相互作用,并对用来研究药物相互作用的两种方法进行比较.方法用Loewe Additivity模型和Creco等人提出的universal response surface approach（URSA）来分析剑叶龙血素A和剑叶龙血素B抑制上述通道电流时所产生的相互作用.结果反映药物相互作用强度的参数在Loewe Additivity模型中CI以及URSA中的d在本文中CI=1.35（95%置信区间：1.29～1.42）、a=-1.08（95%置信区间：-1.16～-0.98）.结论剑叶龙血素A与剑叶龙血素B在抑制上述通道电流时存在拮抗作用;URSA比Loewe Additivity模型能更客观的反映药物相互作用的程度,且URSA可描述联合药物的量效关系.     

龙血竭提取物有效成分剑叶龙血素A小鼠药动学研究

目的:选取中药广西龙血竭提取物(EDB)中有效成分之一的剑叶龙血素A(2,6-三甲氧基-4'-羟基二氢查耳酮)作为考察对象,研究其药动学规律,对龙血竭临床用药具有一定的指导意义.方法:建立实验小鼠血浆中剑叶龙血素A含量的高效液相色谱测定方法,测定给药后不同时间点血浆中剑叶龙血素A的浓度.通过药动学软件3P87进行数据处理,得出剑叶龙血素A的相关药动学参数.结果:剑叶龙血素A血药浓度高效液相色谱测定方法的线性范围为50-500ng/ml,高中低三种浓度回收率分别是114.80±2.86、103.60±4.38、101.80±2.12,最小检测浓度为10ng/ml,日内差为1.28%、日间差为2.26%、精密度(RSD)小于3%;剑叶龙血素A的药动学参数是:T(peak)为77.73min、C(max)为224.99ng/ml、T1/2Ke为72.91 min、T1/2Ka为40.94min、V/F(C)为1.019(mg/kg)/(ng/ml)、AUC为49553.47(ng/ml)*min.结论:建立了小鼠血浆中剑叶龙血素A高效液相色谱测定方法;EDB口服后剑叶龙血素A药动学为一室模型,有较大的吸收利用率,其消除半衰期为吸收半衰期的1.78倍,是吸收比消除快的药物.     

血竭及其成分龙血素B对背根神经节细胞河豚毒素敏感型钠通道电流的影响

应用全细胞膜片钳技术在急性分离的大鼠背根神经节细胞上观察血竭及其成分龙血素B对河豚毒素敏感型电压门控性钠通道电流的影响. 结果发现, 血竭和龙血素B对河豚毒素敏感型钠通道电流峰值均有浓度依赖的抑制作用, 高浓度的血竭(0.05%)和龙血素B(0.02 mmol/L)使河豚毒素敏感型钠通道电流峰值偏移, 并电压依赖性地影响通道的激活和失活过程. 以上结果表明, 血竭对河豚毒素敏感型钠通道电流的影响主要是其成分龙血素B作用的结果. 血竭的镇痛作用可能部分是通过其成分龙血素B直接干预初级感觉神经元电压门控性钠通道, 阻碍痛觉信息传入而产生的.     

广西龙血竭中几种化学成分对血小板聚集影响的初步研究

从广西龙血竭的氯仿提取部位中得到3种化合物,经IR、1H NMR 13C NMR、MS等现代波谱技术分别鉴定为3,4'-二羟基-5-甲氧基二苯乙烯、剑叶龙血素A、龙血素B,本研究还观察了上述化合物对健康志愿者血小板聚集的影响,发现均对体外ADP诱导的血小板聚集有一定的抑制作用.     

真菌诱导海南龙血树生产血竭

血竭是一种名贵的传统中药.影响血竭产生的主要原因是物理损伤和真菌诱导.本研究是以打孔接菌方法诱导生产血竭,并运用高效液相色谱方法检测诱导产生的血竭中主要成分龙血素A和龙血素B的含量,探讨不同处理方法对这两种成分含量的影响,以确定最佳的人工接菌方法.研究结果显示不同的处理方法得到的血竭中龙血素A的含量变化不大,而树体接人镰刀菌属真菌并将伤口暴露于空气得到的血竭中龙血素B的含量最高,诱导效果最好.指纹图谱比对结果显示诱导产生的血竭成分与血竭药品成分相似,进一步说明人工接菌诱导血竭生产具有可行性.     

龙血竭不同类型酚性成分的分离及紫外光谱特征

采用硅胶、反相硅胶、Toyopearl HW-40、Sephadex LH-20等柱层析以及高效液相色谱(HPLC)制备,从龙血竭的氯仿部分分离纯化得到22个化合物。经波谱分析鉴定为对羟基苯甲醛(1)、3,4,5-三甲氧基苯酚(2)、对羟基苯乙酮(3)、7,4’-二羟基黄烷(4)、(2S)-7,4’-二羟基8-甲基黄烷(5)、5,4’-二羟基7-甲氧基6-甲基黄烷(6)、(2S)-7,3’-二羟基4’-甲氧基黄烷(7)、7,4’-二羟基高异黄烷(8)、龙血素A(9)、龙血素B(10)、龙血素C(11)、2,4’-二羟基4-甲氧基二氢查耳酮(12)、4,4’-二羟基-2,6-二甲氧基二氢查耳酮(13)、6,4’-二羟基-2,4-二甲氧基二氢查耳酮(14)、剑叶龙血素D(15)、syringaresinol(16)、pinoresinol(17)、medioresinol(18)、(+)-lyoniresinol(19)、dihydrodehydrodiconifery alcohol(20)、3-methyl resveratrol(21)、紫檀芪(22)。其中化合物1~3、14、17~20为首次从云南龙血竭中得到。对其紫外特征光谱图分析发现:龙血竭中不同类型酚性成分紫外光谱特征有很大的差异,可用HPLC-DAD在线识别化合物的类型,指导酚性成分的分离纯化。     

发酵生产龙血竭中龙血素A和B的分析

以高效液相色谱法,检测血竭诱导菌在不同发酵时间下发酵龙血树干粉和龙血树愈伤组织的产物中龙血素A和龙血素B的含量。干粉发酵产物中,龙血素A的含量大于愈伤组织发酵产物中的含量,并且在第四周时达到最大值0.253 mg/g;龙血素B在第三周时达最大值0.519 mg/g。愈伤组织发酵产物也含有少量的龙血素A和龙血素B。虽然发酵产物中的龙血素B远远高于龙血树根、茎、叶中的含量,但还是低于0.4%的质量标准,因此不能应用于生产。     

赤霉属真菌诱导龙血竭形成的HPLC指纹图谱

龙血竭为百合科植物龙血树所产的树脂类药材,常常因树干部位受损伤后,经微生物侵染并分泌树脂,经提而成。本研究以活性菌株诱导所得龙血竭药材为研究对象,采用HPLC指纹图谱与对照药材相比较,为其质量控制提供评价及分析方法。采用ZORBAX SB-C18色谱柱（5μm,4.6mm×250mm）,流动相A为30%乙腈+0.3%乙酸,流动相B为100%乙腈,梯度洗脱,流速1.0mL/min,检测波长278nm与309nm,柱温25℃。结果发现,各龙血竭样品指纹图谱与对照样品相似度高,确定14个共有峰,并通过对照指认了7,4’-二羟基黄酮、龙血素A、龙血素B和白藜芦醇共4个特征性化学成分。本研究发现活性真菌菌株诱导产物可作为天然龙血竭的替代品,诱导药材质量佳,诱导效果好。     

大鼠脊髓背角神经元痛放电确定性行为的年龄相关变化

为阐明脊髓背角神经元痛放电的年龄相关的动力学变化,本研究采用非线性预报方法,对两组不同年龄大鼠(成年青龄鼠3～4月龄,老年鼠＞22月龄)组织损伤诱发的脊髓背角神经元痛放电峰峰间期序列进行了确定性行为的定量分析.结果显示,皮下注入蜜蜂毒,在两组大鼠均诱发脊髓背角广动力域神经元长时程放电,而老龄大鼠的痛放电峰峰间期序列表现出更高的可确定性.本研究表明,单个神经元的痛放电动力学在整个生命过程中并不是恒定不变的,伤害性神经元活动的年龄相关动力学变化可能是老年人群中多样化痛反应的内在机制之一.     

3种龙血树PAL基因克隆及分子鉴定

该研究以3种龙血树(剑叶龙血树、海南龙血树和岩棕)的DNA和总RNA为模板,采用同源克隆法克隆龙血竭3种基源植物的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase)基因PAL,利用DNAMAN、MEGA7等软件进行生物信息学分析,以探讨龙血竭3种基源植物的分子鉴定方法,为生产实际中对不同来源的龙血竭原料的鉴定提供理论依据。结果表明:(1)在龙血竭3种基源植物中分别获得长度为718 bp的PAL片段,序列分析发现,3种龙血树PAL片段高度一致(99.69%),仅存在5处碱基突变;系统进化分析表明,龙血树PAL片段与百合科植物PAL基因聚为一类。(2)RT-PCR分析发现,PAL基因在3种龙血树的根、茎、叶中均有表达,同种龙血树不同组织的表达量差异较小,且PAL基因在岩棕中的表达量较高,在剑叶龙血树和海南龙血树中表达量较低。(3)利用保守引物进行分子鉴定发现,同种龙血树PAL序列一致,3种龙血树PAL片段存在5处碱基突变,且这些碱基突变为稳定遗传,表明3种龙血树PAL基因高度保守。(4)根据突变位点建立了龙血竭3种基源植物的分子鉴定方法,进一步分子鉴定结果表明,剑叶龙血树的碱基位置为GCGGG,海南龙血树的碱基位置为CTGGC,岩棕的碱基位置为GTTTG。该研究结果为龙血竭原材料溯源和质量控制奠定了理论与技术基础。     

大鼠尾核微量注射γ—氨基丁酸对尾核痛反应神经元放电的影响

在５３只成年Ｗｉｓｔａｒ大鼠上,用玻璃微电极引导神经元放电,观察了尾核内注射γ－氨基丁酸后,尾核痛反应经元放电的变化和印防己毒素对ＧＡＢＡ作用的阻断效应。尾核内每２分钟分别注射ＧＡＢＡ２５,５０,１００μｇ／２μｌ,尾核痛兴奋神经元诱发放电频率减少,潜伏期延长;痛抑制神经元放诱发放电频率减少,潜伏期延长;痛抑制神经元放电抑制时程缩短,放电频率增加。ＰＥＮ和ＰＩＮ电活动反应与ＧＡＢＡ剂量间呈量效关系     

电刺激猫中脑导水管周围灰质和中缝大核对脊髓背角神经元伤害性感受反应的抑制

1.在氯醛糖麻醉的猫上,观察了电刺激中脑导水管周围灰质(PAG)和中缝大核(NRM)对脊髓腰段背角神经元传入活动的影响。2.按照对刺激的反应型式,在背角记录到非伤害性低阈值传入、广动力范围、伤害性热敏以及高阈值传入诱发的自发放电抑制等四类神经元。3.刺激 PAG和 NRM对记录到的多数背角神经元皮肤传入反应有明显抑制效应,而对自发放电抑制性神经元产生去抑制。4.比较刺激两脑区的抑制效应:NRM 作用较PAG 强;PAG 活动对背角伤害性反应抑制的选择性较 NRM强;阿片肽拮抗剂-纳洛酮拮抗NRM刺激的抑制。5.这些结果提示PAG和NRM对脊髓的下行抑制,可能有一部分是通过不同神经机制实现的。     

L-谷氨酸和卡巴胆碱对中脑腹侧被盖区多巴胺能神经元簇放电的影响

中脑腹侧被盖区(ventral tegmental area,VTA)多巴胺能神经元的簇放电会导致其突触末梢多巴胺释放量瞬时大量增加,已被公认是编码奖赏效应的功能相关信号,但诱发多巴胺能神经元产生簇放电的神经调节的具体机制尚不完全清楚。为深入理解诱发VTA多巴胺能神经元产生簇放电介导奖赏信号的递质机制和不同脑区间的协同作用,本实验利用大鼠离体脑片,研究了胆碱能受体激动剂卡巴胆碱单独灌流,兴奋性谷氨酸能受体激动剂L-谷氨酸单独脉冲式给药及二者同时作用时VTA多巴胺能神经元簇放电的产生。结果显示,在离体脑片,卡巴胆碱(10μmol/L)持续灌流或L-谷氨酸(3mmol/L)脉冲式给药均能够诱发多巴胺能神经元产生簇放电。在二者单独作用不能诱发簇放电的神经元,卡巴胆碱和谷氨酸联合用药则可以诱发出簇放电。这些结果提示,卡巴胆碱和L-谷氨酸在诱发多巴胺能神经元簇放电的过程中具有协同作用。     

林肯链霉菌谷氨酰胺合成酶的酶学性质

在分离纯化的基础上,报道了pH、温度和金属离子对林肯链霉菌(Streptomyceslincolnensis)Z-512谷氨酸胺合成酶(GS)活力的影响及GS底物专一性的研究结果.在动力学性质的研究中,发现林肯链霉菌GS在生物合成反应系统中,对底物NH_4CI的饱和曲线不遵守米氏方程.Hill作图呈两相曲线.在NH_4CI浓度低的情况下,Hill系数大于1,具有正协同效应;当NH_4CI浓度增加到一定程度时,Hill系数小于1,具有负协同效应.这说明NH_4CI不仅作为林肯链霉菌GS的底物,而且作为一种效应物调节GS的活性.林肯链霉菌GS对底物Glu及ATP的饱和曲线遵守米氏方程.在不同的激活离子存在下,GS对Glu、ATP的Km值也不同.     

血管紧张素Ⅱ在脊髓水平对吗啡作用的影响

本工作以玻璃微电极记录脊髓腰段（Ｌ２－３）背角神经元电活动,观察血管紧张素Ⅱ（ＡⅡ）对其伤害性诱发放电的影响,并探讨ＡⅡ与吗啡抑制效应的相互关系。结果表明,ＡⅡ５０－５００ｎｇ脊髓表面微量滴注对背角神经元伤害性诱发放电主要为抑制效应,而ＡⅡ２μｇ为易化效应;注射吗啡（５ｍｇ／ｋｇ,ｉｐ）后１０ｍｈ;ＡⅡ２５０ｎｇ脊髓表面微量滴注不能对抗吗啡的抑制作用,而ＡⅡ２一４μｇ则能部分或完全抵消吗啡对背角神经元伤害性诱发放电的抑制作用。本工作提示,ＡⅡ可调制脊髓背角神经元对外周传入的伤害性反应;较大剂量ＡⅡ可对抗吗啡对伤害性诱发放电的抑制作用。     

伤害性刺激和电针对大鼠中缝大核内缝-脊神经元的效应

用玻璃微电极细胞外记录大鼠中缝大核神经元放电,刺激脊髓胸段背外侧部诱发逆行动作电位,根据其潜伏期恒定性,能跟随高频刺激以及可与自发放电碰撞而消失等标准来鉴定缝-脊神经元。共记录45个缝-脊神经元,其传导速度多在15—60m/s 范围。对伤害性刺激发生兴奋性(增频)反应的31个,抑制性(减频)反应的6个。两个类型神经元的自发放电频率分别为5.74±0.96Hz 和12.03±2.68Hz。另有3个为兴奋抑制转化型,反应的转化与背景自发放电水平有关,即放电频率低时,对伤害性刺激为兴奋性反应,而当自发放电频率增高时,则转化为抑制性反应。此外还有5个神经元对伤害性刺激无明显反应。电针“足三里”对兴奋型的缝-脊神经元(n=13)能明显激活并抑制其伤害性反应,后者可能是由于下行抑制而产生的继发性效应。     

刺激大鼠杏仁外侧核对皮层A Ⅰ区ON-OFF神经元反应及调谐曲线的影响

在30只氨基甲酸乙酯麻醉的SD大鼠上记录神经元单位放电,观察短纯音诱发的皮层A Ⅰ区神经元ON-OFF反应的特性及电刺激杏仁外侧核(lateral amygdaloid nucleus,LA)对ON-OFF反应以及调谐曲线的影响.实验证实,A Ⅰ区神经元ON-OFF反应的模式与纯音刺激的强度、频率及作用时程有关;刺激LA可以抑制ON-OFF反应的放电频数,使反应的阈值升高,或使反应放电构型发生变化;此外,刺激LA能使ON-OFF神经元的调谐曲线变窄,Q10数值增大.研究结果不仅表明ON-OFF神经元能对纯音刺激的时程、强度和频率等多种信息进行编码,而且还证明杏仁外侧核可以在皮层水平参与听觉信息的调制,削弱或衰减某些听觉信息,导致整个调谐曲线上移变窄,从而提高A Ⅰ区ON-OFF神经元的频率选择性能,有利于检测外界嘈杂环境中特定的听觉信息.     

猫丘脑束旁核神经元对电刺激外周神经与动脉注射缓激肽的放电反应

为了确定丘脑束旁核神经元对外周神经伤害性刺激的各类反应是否都属于痛敏反应,在氯醛糖麻醉的36只猫上观察了束旁核神经元对强电流刺激外周神经与动脉注射缓激肽的放电反应。根据放电的潜伏期和持续时间,可将观察到的162个单位对强电流刺激外周神经的反应分成四种类型。1.短潜伏期反应,69个单位。2.长潜伏期反应,15个单位。3.短-长潜伏期反应,37个单位。4.自发放电抑制,41个单位。静脉注射芬太尼不能抑制短潜伏期反应,动脉注射缓激肽不能诱发这类神经元放电,说明这类反应不是痛敏反应。其它三种反应,都可为静脉注射芬太尼所抑制或减弱,又可为动脉注射缓激肽所诱发,说明这三类反应都属于痛敏反应。     

进口血竭与国内血竭的研究对比

血竭是我国传统名贵中药,在世界各地广泛使用.本文对进口血竭与国产血竭在植物基源及生物学特征进行了比较,我们又把国内血竭称为“龙血竭”,并对血竭真伪的鉴别提供了几种简单的方法.进口与国产的血竭虽然在化学成分上有很大不同,但是药理作用很相似,所以我国的龙血竭完全可以替代进口血竭在临床上使用,市场上出现了很多不同的血竭剂型.针对现在国内外血竭资源的处于濒危的状况,我们需要增强血竭资源保护意识,使血竭资源能可持续利用.