DRSP：蛋白质单残基替换结构数据库

蛋白质残基替换是基因突变的产物之一,它可能改变蛋白质三维结构,对其生物学功能产生重大影响,因此研究蛋白质残基替换与结构改变的关系具有重要意义．随着实验解析蛋白质结构的数量迅猛增长,越来越多的野生型-突变体被应用于结构生物学的比较研究中．本研究从蛋白质三维结构数据库(PDB)出发,收集和计算了大量结构特征数据,构建了一个目前已知最大的野生型-突变体(单残基差异)的结构对数据库DRSP,展示出氨基酸类型和主链偏好性对结构保守性的相关性．DRSP的开放使用可为高精度的蛋白质结构分析预测提供有用信息,它的数据库网址是http://www.labshare.cn/drsp/index.php．     

改造α乳清蛋白的定点突变研究

蛋白质结构与功能之间关系的研究一直是生命科学领域的焦点 .采用定点诱变技术在克隆 c DNA的预定位点导入突变 ,然后在适当的宿主细胞 -载体系统中表达已改变的基因 ,通过比较突变体蛋白与野生型蛋白的性质 ,往往可能鉴别出对蛋白质的结构完整性和生物学功能至关重要的结构域或氨基酸残基 [1,2 ] .α乳清蛋白是哺乳动物乳汁中的主要蛋白质 ,它和半乳糖苷转移酶一起形成复合物 ,称为乳糖合成酶 .C型溶菌酶的功能是催化裂解细菌细胞壁肽聚糖组分 NAM- NAG的 β- 1 ,4糖苷键 .早期的研究发现 ,虽然它们是两种功能截然不同的蛋白质 ,它们自…     

基于体外分子进化技术提高弯曲芽孢杆菌CCTCC 2015368 β-淀粉酶的热稳定性

运用体外分子进化技术易错PCR方法,高通量筛选热稳定性提高的弯曲芽孢杆菌Bacillus flexus CCTCC2015368β-淀粉酶突变体。利用LB琼脂淀粉板显色、96-孔板DNS法测酶活和酶标仪检测等,最终筛选到了一株热稳定性显著提高的突变体D476N。野生型和突变体D476N分别纯化后,酶学性质测定表明:突变体D476N的最适pH为6.5,与野生型相比降低了0.5。突变体D476N和野生型的最适温度均为55℃,突变体D476N在55℃下的半衰期为35 min,比野生型提高了95%。突变体D476N的T_(50)值比野生型提高4℃。突变体D476N的K_m值为97.98μmol/L,是野生型(85.86μmol/L)1.14倍;突变体稳定性提高的同时,催化活力相对于野生型有略微下降。通过SWISS-MODEL同源模拟野生型和突变体D476N的三维结构,并通过PyMol软件分析,发现突变后的氨基酸残基Asn476位于蛋白质表面的loop环上,通过MOE软件计算,D476N的分子自由能(ΔG)为106.01kcal/mol,比野生酶降低10.3%,这一结果与蛋白质分子自由能和热稳定性呈负相关的理论相符。     

p53蛋白质Gly249和Ser249替换型三维结构的分子动力学研究

利用p53蛋白质核心区晶体结构作分子动力学发现,除了生化方面的稳定性之外,该区还具有分子力学上的高度稳定性.在此基础上作的R249残基替换分子动力学研究显示,p53蛋白质核心区249位点精氨酸被其他残基替换后能引起p53蛋白质核心区L2、L3结构域间的密切联系趋于松散,正常的空间构象发生改变并使整个核心区结构稳定性受到破坏.这一研究从三维结构变化上,直观地解释了R249残基替换造成的p53蛋白质免疫和生化特性改变的结构机制.     

鲍曼不动杆菌核苷二磷酸激酶的结构和功能研究（英文）

近年来,鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)在医院里越来越受到人们的关注,尤其是在重症监护病房(ICUs).它以强大的多重耐药性(multiresistance)而闻名.核苷二磷酸激酶(nucleoside diphosphate kinase,NDK)是一种进化上非常保守的酶,它能催化核苷之间磷酸基团的转移.我们解析了鲍曼不动杆菌NDK野生型和C端氨基酸残基Arg141-Thr142-Arg143(RTR)截短突变体的结构.通过和黄色黏菌(Myxococcus xanthus)NDK的三维结构进行比较,推断鲍曼不动杆菌NDK的催化机制和黄色黏菌类似.通过激酶活性实验和圆二色谱实验,发现鲍曼不动杆菌NDK E28A突变体二级结构发生了改变,从而导致蛋白催化活性降低,说明Glu28是鲍曼不动杆菌NDK结构中非常关键的氨基酸残基.鲍曼不动杆菌NDK C端RTR截短突变体显示出催化活性极大的降低,这可能与C端RTR残基介导的二体间相互作用有关.虽然RTR截短突变体中的Lys33伸向了和野生型中不同的方向,和Val15产生相互作用弥补了一部分因为RTR截短丢失的相互作用,维持了RTR截短突变体和野生型类似的结构.但是,Lys33产生的相互作用依然太弱,不足以维持蛋白在催化的动态过程中整体结构的高效转换.我们解析的鲍曼不动杆菌NDK晶体高分辨率结构将有助于科学家设计针对鲍曼不动杆菌的药物.     

Structural and Functional Characterization of Acinetobacter baumannii Nucleoside Diphosphate Kinase

近年来,鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)在医院里越来越受到人们的关注,尤其是在重症监护病房(ICUs)．它以强大的多重耐药性(multiresistance)而闻名．核苷二磷酸激酶(nucleoside diphosphate kinase,NDK)是一种进化上非常保守的酶,它能催化核苷之间磷酸基团的转移．我们解析了鲍曼不动杆菌NDK野生型和C端氨基酸残基Arg141-Thr142-Arg143(RTR)截短突变体的结构．通过和黄色黏菌(Myxococcus xanthus)NDK的三维结构进行比较,推断鲍曼不动杆菌NDK的催化机制和黄色黏菌类似．通过激酶活性实验和圆二色谱实验,发现鲍曼不动杆菌NDK E28A突变体二级结构发生了改变,从而导致蛋白催化活性降低,说明Glu28是鲍曼不动杆菌NDK结构中非常关键的氨基酸残基．鲍曼不动杆菌NDK C端RTR截短突变体显示出催化活性极大的降低,这可能与C端RTR残基介导的二体间相互作用有关．虽然RTR截短突变体中的Lys33伸向了和野生型中不同的方向,和Val15产生相互作用弥补了一部分因为RTR截短丢失的相互作用,维持了RTR截短突变体和野生型类似的结构．但是,Lys33产生的相互作用依然太弱,不足以维持蛋白在催化的动态过程中整体结构的高效转换．我们解析的鲍曼不动杆菌NDK晶体高分辨率结构将有助于科学家设计针对鲍曼不动杆菌的药物．     

苏云金芽孢杆菌Cry1Aa蛋白α4螺旋形成跨膜离子通道的昆虫毒性试验与模型预测

研究野生型苏云金芽孢杆菌Cry1Aa和Cry1C的毒性变化发现, 不同的pH不但影响这些蛋白质的毒性, 而且影响它们在跨膜过程中形成孔洞的能力. 将Cry1Aa α4螺旋中的15个氨基酸突变后与BBMV结合, 进行光散射分析, 与野生型Cry1Aa相比较, 发现有3个突变体几乎完全失去毒性, 7个突变体毒性明显降低, 5个突变体保持野生型毒性. 采用计算机模拟方法研究了苏云金芽孢杆菌Cry1Aa毒蛋白α4螺旋的三维空间结构, 通过观察15个不同残基定点突变对其功能的影响, 解释了突变体毒性变化的原因, 说明了参与膜孔洞形成氨基酸残基对Cry1Aa昆虫毒杀性的重要作用.     

P53蛋白质R175残基替换的分子动力学研究

利用Ｐ５３蛋白核心区晶体结构作分子动力学研究发现,除了生经方面的稳定性之外,该区还具有分子动力学上的高度稳定性。在此基础上作的Ｒ１７５残基替换分子动力学研究显示,Ｐ５３蛋白质核心区１７５位点精氨酸被其他残基替换后能引起Ｐ５３蛋白质核心区Ｌ２、Ｌ３结构域间的密切联系趋于松散,下沉遥空间构象发生改变并使整个核心区结构稳定性受到破坏。这一研究从三维结构变化上,直观地解释了Ｒ１７５钱基替换造成的５３蛋白质     

α-葡萄糖苷酶三维结构的同源模建与分子设计

目的:该文预测了来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)ATCC 12016编码α-葡萄糖苷酶序列的三维结构,设计突变位点,构建突变体模型,并对预测三维结构与突变体进行了评估与分析.方法:分析了α-葡萄糖苷酶的核酸序列与蛋白序列,确定了α-葡萄糖苷酶蛋白序列的同源性与保守区特征;利用来源于蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)ATCC 7064寡聚-1,6-葡萄糖苷酶三维蛋白结构作为模板,同时基于同源模建方法对α-葡萄糖苷酶序列的三维结构与突变突变体模型进行了结构预测.结果:对预测的三维结构与突变体进行评估与分析,表明预测与设计的结构达到合理化标准.结论:基于以上研究结果,构建α-葡萄糖苷酶的三维结构模型是合理的,为蛋白质工程应用建立了理论研究平台.     

人白细胞介素18突变体的构建及其功能

为研究人白细胞介素 18(hIL 18)结构与功能的关系 ,用PCR定点突变技术分别构建了N末端、C末端缺失突变体(ΔNC)和IL 1特征样序列突变体S154A/Y156F/E157P/C163 T (S)。将突变体cDNA与原核表达载体 pJW 2重组并转化大肠杆菌DH5α ,经热诱导表达蛋白质 ,SDS PAGE证实表达的目的蛋白质以包涵体形式存在。菌体经超声破碎后 ,包涵体以 2mol/L尿素洗涤 ,8mol/L尿素溶解 ,并经SephadexG 75柱纯化 ,纯度可达 95 %以上。突变体蛋白质经逐步稀释复性后 ,以诱导人外周血单个核细胞 (PBMC)产生干扰素 γ(IFN γ)及对核因子 κB(NF κB)的激活能力为指标 ,检测突变体的生物学活性。结果显示ΔNC、S这 2个突变体对IFN γ的诱生能力显著低于野生型hIL 18,分别为野生型hIL 18的 13%和 4 8%。同时 ,ΔNC、S对NF κB的激活能力也低于野生型hIL 18,分别为野生型hIL 18的 6 9.7%和 89.8%。这些结果表明缺失的片段或突变的位点对hIL 18的功能有重要的作用。     

NDPK-A C4/109/145 S突变体降低磷酸转移酶活性但增加DNase活性

核苷二磷酸激酶A( nucleoside diphosphate kinase A, NDPK-A）有广泛的生物学活性,在肿瘤转移和调控中起重要作用.单独抑制NDPK-A中任何1个Cys所形成的二硫键,不会降低NDPK-A的磷酸转移酶活性和DNase活性.本实验通过构建C4/109/145S突变体并研究其生物学效应,为NDPK A结构与功能的研究提供参考.用定点突变法将NDPK-A 的4位、109位和145位Cys突变为Ser,构建pBV220-NDPK-A C4/109/145S和pEGFP-NDPK-A C4/109/145S两种重组质粒.在大肠杆菌中高效表达NDPK-A C4/109/145S突变体,纯化后可获得均一的重组NDPK-A C4/109/145S突变体蛋白.HPLC法和DNA消化法测定发现,C4/109/145S突变体磷酸转移酶活性低于野生型NDPK-A,而DNase活性高于野生型NDPK-A.以A549细胞作为模式细胞的流式细胞仪周期检测表明,C4/109/145S突变体与野生型NDPK-A一致,均可将细胞周期延滞在S期和G2/M期.这些结果证实,NDPK A结构异构与其磷酸转移酶活性密切相关,其酶活性至少需要1个Cys残基存在,NDPK-A结构中的二硫键也可能是其DNase活性的负调控机制之一,胞内NDPK-A的氧化还原异构可能对细胞周期无显著影响.     

PTC下游翻译重启导致NMD途径的逃逸

无义突变介导的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)途径是真核生物体内一种重要的mRNA监督质控机制,它降解含有由无义突变、错误剪接、移码突变等产生的提前终止翻译密码子(premature translation termination codon,PTC)的mRNA,从而防止这种mRNA翻译产生的截短型蛋白质对机体造成的伤害.研究发现,一些含有PTC的mRNA发生了NMD途径逃逸,但具体机制仍不清楚.本研究将成视网膜细胞瘤基因1(retinoblastoma gene 1,RB1)作为NMD途径的靶基因,构建mini-RB1基因,包括外显子1~14(c DNA)、内含子14-外显子15-内含子15和外显子16~27(c DNA)的三部分序列,将其构建到真核表达载体pc DNA 3.1(-)中.根据人类基因组突变数据库选择3个突变位点W99X、G310X和R467X,构建相应无义突变体.分别将mini-RB1基因野生型和无义突变体转入He La细胞进行表达.用qRT-PCR检测发现,W99X无义突变体与野生型相比mRNA的水平无显著差异.为了进一步证实mini-RB1(W99X)发生了NMD逃逸,利用NMD途径抑制剂放线菌酮和转录抑制剂放线菌素D,分别处理转入野生型的mini-RB1基因及其无义突变体mini-RB1(W99X)的哺乳动物细胞,发现mini-RB1基因无义突变体的mRNA水平与野生型无明显差异,说明含有W99X无义突变的mini-RB1基因的mRNA发生了NMD逃逸.Western印迹检测mini-RB1基因的蛋白质表达发现,在无义突变位点W99X下游重新起始了蛋白质的翻译,因此,PTC下游蛋白质翻译的重新起始可能是导致无义mRNA逃逸NMD途径监控的主要原因.     

人朊病毒蛋白及其突变体的溶剂可及性和模拟分析

朊病毒是一种全新类型的致病因子,以一种全新的致病机制造成许多神经退化性疾病.它的致病性主要由于PrPC向PrPSc构象转变而造成.为了探讨PrPC向PrPSc转变过程中PrP分子构象变化的机制, 我们计算分析了人天然PrP分子及不同的单残基突变体(如M166V,S170N,E200K和R220K)的氨基酸残基溶剂可及性, 并对天然PrP分子及其突变体进行了结构重叠模拟和RMS偏量分析.结果表明由于166位等单个残基的突变, 造成PrP突变体与天然蛋白的局部结构出现较大差别, 使得部分残基的溶剂可及表面积发生了较大变化, 并且部分残基改变了它们的位置, 同时也影响蛋白质表面的电荷分布, 这些改变是为了更好地适应次级相互作用的局部环境.分析表明PrP与一般球蛋白在性质上有一定的差异, 说明PrP分子并不是一种稳定的球蛋白结构, 只是一种折叠中间物.     

耐热碱性磷酸酶(FD-TAP)的结构模型研究

 以大肠杆菌碱性磷酸酶 (BAP)为主要结构模板 ,用计算机同源结构模拟方法构建了耐热碱性磷酸酶 (FD TAP)的三维结构 ,对它们的结构特征进行了分析比较 ,并用Profile 3D和Ramachand ran图等方法分析了结构的合理性 .在此基础上 ,又构建了FD TAP 3个突变体的结构 ,用CHARMM能量计算法研究了FD TAP及其 3个突变体的能量与酶蛋白热稳定性之间的关系 ,得到了与实验完全一致的结果 .结果说明 ,如果氨基酸残基置换使蛋白质分子的总能量降低 ,疏水性增高和柔韧性减小 ,往往使蛋白质的耐热性增加     

提高源自Bacillus circulans 251的β-CGTase对麦芽糖亲和性及其在生产海藻糖中的应用

将B. circulans 251β-CGTase应用于海藻糖制备,海藻糖转化率从50. 4%提高至71. 9%。为进一步提高底物的转化率,运用易错PCR-高通量筛选技术筛选对以麦芽糖为歧化反应受体的亲和性提高的B. circulans 251β-CGTase突变体。利用低底物浓度的96孔板4,6-亚乙基-对硝基苯-α-D-麦芽七糖苷(EPS)显色法,最终筛选得到了一株对麦芽糖亲和性提高的突变体M234I。将野生型β-CGTase和突变体酶M234I进行蛋白质纯化,测定其酶学性质。结果表明,突变体的比活为345. 25U/mg,野生型则为357. 63U/mg;突变体M234I对麦芽糖的K_m为0. 258 2mmol/L,仅为野生型(0. 474 9mmol/L)的54. 4%,对麦芽糖的亲和性显著提高;突变体的最适温度、最适p H较野生型未发生较大变化。以麦芽糊精(DE值16)为底物,将突变体M234I用于多酶复配体系生产海藻糖,酶反应结果表明海藻糖的转化率最高达74. 9%,较野生型β-CGTase提高约3%。     

Asp^126、Asp^130、Asp^134对人白介素18功能的影响

为研究人白细胞介素18(hIL-18)中一些氨基酸残基对IL－18功能的影响,用重叠延伸PCR定点诱变技术构建hIL-18突变体hIL-18D^126N、hIL-18D^130K、hIL-18D^134K。将突变体cDNA与原核表达载体pJW2重组并转化大肠杆菌DH5α。经热诱导表达,3个突变体占菌体总蛋白质的15％－31％以上。SDS－PAGE证实,表达的蛋白质以包含体形式存在。包含体经超声破坏,2mol/L尿素洗涤,8mol/L尿素溶解,Sephadex G-75柱纯化后,纯度均可达95％以上。Western印迹表明3个突变体与野生型hIL-8具有相同的免疫原性。纯化的突变体蛋白质经复性后,以诱导人外周血单个核细胞（PBMC）产生于干扰素（IFN－γ）的能力为指标检测其活性,结果显示3个突变体的生物学活性分别为野生型IL－18的32％、8％、10％,表明hIL-18中126、130、134位的天冬氨酸（Asp)对其功能是必需的。     

亚位点+1处突变提高软化类芽胞杆菌环糊精糖基转移酶底物麦芽糊精特异性

通过改造来源于软化类芽胞杆菌Paenibacillus macerans的环糊精糖基转移酶(Cyclodextrin glycosyltransferase,CGT酶)的+1亚位点提高其对麦芽糊精的底物特异性,并进一步提高以麦芽糊精为糖基供体催化合成2-O-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)的效率。首先对+1亚位点附近的3个氨基酸残基Leu194、Ala230和His233分别进行定点饱和突变,得到3个优势突变体L194N(亮氨酸→天冬酰胺),A230D(丙氨酸→天冬氨酸),H233E(组氨酸→谷氨酸),然后以这3个优势突变体为模板进一步进行两点和三点复合突变,获得7个复合突变体。研究结果表明,突变体L194N/A230D/H233E以麦芽糊精为底物合成AA-2G的产量最高,达到1.95 g/L,比野生型CGT酶提高了62.5%。对获得的突变体进行动力学分析,发现高浓度的底物L-AA对突变型CGT酶催化的酶促反应具有抑制作用。确定了突变体酶促反应的最适温度、pH和反应时间。模拟突变体的三维结构并进行分析,突变体底物特异性的改善可能与CGT酶第194位、230位和233位的氨基酸残基的亲水性及与底物分子间的作用力的改变有关。     

色氨酸残基在碳-碳水解酶催化中的关键作用

碳-碳水解酶（C-C水解酶）作为α/β水解酶超家族中的一员,负责催化环裂产物C-C键的断裂,该反应是细菌降解芳香族化合物途径中的关键步骤. 为了解水解酶的催化特性,本文对该酶部分氨基酸进行了定点突变,并对突变体的动力学参数,化学修饰剂对突变体活性的影响以及突变体的二级结构进行了测定.各突变体的动力学参数特征为：突变体S110A,H265A和D237A的催化效率为野生型的1/104~1/103;突变体W85A和W219A催化效率分别为野生型的5/18和1/3,而同为色氨酸的突变体,W266A的催化效率只有野生型的1/104. 化学修饰剂对突变体S110A,H265A,D237A和W266A的酶活性几乎没有影响;而对突变体W85A和W219A却有较大的影响,修饰后,其相对活性仅为对照的10%~30%. 突变体的圆二色谱（CD谱）分析表明,与野生型相比,突变体的二级结构没有发生改变. 证明了Ser110,Asp237,His265是2-羟基-6-氧-6-苯基己-2,4-二烯酸水解酶（HOPDA hydrolase, HOPDA水解酶）催化反应所必需的氨基酸,并提出了Trp266在催化反应中也同样起到了非常关键的作用.     

提高源自Bacillus circulans 251的β-CGTase对麦芽糖亲和性及其在生产海藻糖中的应用 *

将B. circulans 251 β-CGTase应用于海藻糖制备,海藻糖转化率从50.4%提高至71.9%。为进一步提高底物的转化率,运用易错PCR-高通量筛选技术筛选对以麦芽糖为歧化反应受体的亲和性提高的B. circulans 251 β-CGTase突变体。利用低底物浓度的96孔板4,6-亚乙基-对硝基苯-α-D-麦芽七糖苷(EPS)显色法,最终筛选得到了一株对麦芽糖亲和性提高的突变体M234I。将野生型β-CGTase和突变体酶M234I进行蛋白质纯化,测定其酶学性质。结果表明,突变体的比活为345.25U/mg,野生型则为357.63U/mg;突变体M234I对麦芽糖的K_m为0.258 2mmol/L,仅为野生型(0.474 9mmol/L)的54.4%,对麦芽糖的亲和性显著提高;突变体的最适温度、最适pH较野生型未发生较大变化。以麦芽糊精(DE值16)为底物,将突变体M234I用于多酶复配体系生产海藻糖,酶反应结果表明海藻糖的转化率最高达74.9%,较野生型β-CGTase提高约3%。