高质量抗体揭示Rad1蛋白在细胞中新的潜在活动机理

一组在进化上(从酵母到人)保守的基因Rad9、Rad1和Hus1在细胞周期监控点调控和DNA损伤修复中发挥重要作用．这三个蛋白可以形成环形异源三聚体,即9-1-1蛋白复合体．9-1-1复合体被认为是Rad9、Rad1和Hus1行使功能的主要形式．到目前为止,没有一个好的抗Rad1的抗体,严重阻碍了对Rad1和9-1-1复合体的研究．在本研究中,我们成功地制备了一株小鼠抗Rad1蛋白的单克隆抗体．这个抗体能够有效地检测小鼠和人的内源Rad1蛋白,可以用于酶联免疫吸附、蛋白质免疫印迹、免疫共沉淀和免疫荧光等实验．利用该抗体,我们发现在DNA损伤剂羟基脲(HU)的诱导下,小鼠Rad1蛋白在Rad9^+/+小鼠胚胎干细胞中表达明显增加,而在Rad9^-/-的小鼠胚胎干细胞中没有观察到该现象,这表明Rad9对Rad1的蛋白表达有调控作用．此外,内源的Rad1蛋白主要分布在细胞质中,在HU处理后并没有迁移进入细胞核的现象,这与先前广泛被人们所接受的在DNA损伤压力下Rad1和Hus1能够迁移进入细胞核并与Rad9形成9-1-1蛋白复合体的说法相矛盾．综合看来,Rad1和9-1-1蛋白复合体的分子作用机制比预期的要复杂,我们成功制备的Rad1单克隆抗体将成为研究Rad1以及9-1-1蛋白复合体的强有力的工具．     

细胞周期监控点蛋白Rad9与非同源末端连接修复蛋白Ku70的相互作用研究（英文）

Rad9是一种重要的细胞周期监控点调控蛋白.越来越多的证据显示,Rad9也可与多种DNA损伤修复通路中的蛋白质相互作用,并调节其功能,在DNA损伤修复中发挥重要作用.非同源末端连接修复是DNA双链断裂的一条重要修复途径.Ku70、Ku80和DNA依赖的蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)共同组成DNA依赖的蛋白激酶复合物(DNA-PK),在非同源末端修复连接中起重要作用.本研究中,检测到Rad9与Ku70有直接的物理相互作用和功能相互作用.我们在不同的细胞模型中发现,Rad9基因敲除、Rad9蛋白去除或Rad9表达降低会导致非同源末端连接效率明显下降.已有的研究表明,DNA损伤可导致细胞中Ku70与染色质结合增加及DNA-PKcs激酶活性增强.我们的结果显示,与野生小鼠细胞相比,Rad9基因敲除的小鼠细胞中, DNA损伤诱导的上述效应均减弱.综上所述,我们的研究首次报道了Rad9与非同源末端连接修复蛋白Ku70间有相互作用,并提示Rad9可通过调节Ku70/Ku80/DNA-PKcs复合物功能参与非同源末端连接修复.     

细胞周期监控点蛋白Rad9与非同源末端连接修复蛋白Ku70的相互作用研究

Rad9是一种重要的细胞周期监控点调控蛋白．越来越多的证据显示,Rad9也可与多种DNA损伤修复通路中的蛋白质相互作用,并调节其功能,在DNA损伤修复中发挥重要作用．非同源末端连接修复是DNA双链断裂的一条重要修复途径．Ku70、Ku80和DNA依赖的蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)共同组成DNA依赖的蛋白激酶复合物(DNA-PK),在非同源末端修复连接中起重要作用．本研究中,检测到Rad9与Ku70有直接的物理相互作用和功能相互作用．我们在不同的细胞模型中发现,Rad9基因敲除、Rad9蛋白去除或Rad9表达降低会导致非同源末端连接效率明显下降．已有的研究表明,DNA损伤可导致细胞中Ku70与染色质结合增加及DNA-PKcs激酶活性增强．我们的结果显示,与野生小鼠细胞相比,Rad9基因敲除的小鼠细胞中, DNA损伤诱导的上述效应均减弱．综上所述,我们的研究首次报道了Rad9与非同源末端连接修复蛋白Ku70间有相互作用,并提示Rad9可通过调节Ku70/Ku80/DNA-PKcs复合物功能参与非同源末端连接修复．     

Hus1(Hus1f)基因可溶性表达、蛋白纯化及抗体制备

为进一步了解Hus1蛋白在细胞周期检查点信号传导通路中的功能 ,用RT PCR技术从NIH3T3细胞的总RNA中扩增出Hus1基因片段Hus1f(6 0 6～ 84 6bp) ,使其在大肠杆菌中呈可溶性表达 .用镍离子螯合柱 (Ni NTA)纯化Hus1f蛋白 ,获得纯度较高的蛋白 .用纯蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体 .ELISA结果显示效价达到 1∶6 40 0 .Western印迹结果表明 ,该抗体可以与Hus1蛋白特异结合 .通过免疫共沉淀实验发现 ,Hus1蛋白与Chk1蛋白之间存在相互作用 ,为进行信号转导通路的研究奠定了基础 .     

检控蛋白Rad17在小鼠睾丸精子发生过程中的表达及其磷酸化变化

Rad17是细胞周期检控点信号转导过程中的一个关键检控蛋白,在DNA损伤检控和DNA复制检控中具有重要功能。但Rad17在细胞减数分裂中的检控作用还不是很清楚。因细胞减数分裂在睾丸组织中非常活跃,应用Western印迹检测Rad17在不同发育时期的小鼠睾丸组织中的表达及其磷酸化水平,并应用免疫组化的方法检测小鼠睾丸组织不同时期生殖细胞内Rad17的表达变化。结果显示Rad17在小鼠睾丸组织内高表达,而在肝、肾等组织中表达水平较低;Rad17在不同周龄的小鼠睾丸组织中均高水平表达,但在4周龄以后的小鼠睾丸组织中其磷酸化水平明显升高;免疫组化结果显示Rad17在精原细胞、精母细胞的细胞核中高表达,但在成熟精子细胞中消失。这些结果提示Rad17在小鼠睾丸生殖细胞减数分裂过程中也起重要检控作用。     

泛素载体蛋白Rad6在基因表达调控及DNA损伤修复中的作用

泛素化修饰是蛋白质的一种重要的翻译后水平修饰,而且有着多种不同的生物学功能,对蛋白质的结构与功能、基因表达调控以及蛋白质-蛋白质/其它分子相互作用等多个方面有着重要的调控作用。Rad6即是酵母中的一种重要的泛素载体蛋白。Rad6通过泛素化修饰多种靶蛋白在DNA的损伤修复中发挥着重要作用。文章重点讨论了Rad6在DNA损伤修复方面的功能以及在正常情况下对染色质结构和基因表达调控的影响。     

人胚胎干细胞自我更新特性维持的表观–代谢调控新机制

染色质地貌和细胞代谢对细胞命运决定有着重要的作用,但人们对它们之间的互相作用却了解甚少。我们运用基因组范围的si RNA筛选,发现PHB对于维持人胚胎干细胞的自我更新具有重要的作用。其具体机制如下:PHB可以和H3.3的伴侣蛋白HIRA形成蛋白复合体;与PHB相似的是,HIRA对人胚胎干细胞特性的维持也起着重要的作用;特别是PHB和HIRA对异柠檬酸脱氢酶启动子区域染色质结构的调节,调控着对胚胎干细胞命运有着重要作用的代谢产物—α-酮戊二酸的产生。我们的研究揭示了在人胚胎干细胞的细胞核中,PHB通过与HIRA复合体相互作用参与维持正常染色质的结构和重要代谢产物的生成,进而使人胚胎干细胞处于自我更新状态。     

重组恶性疟原虫DNA质粒免疫小鼠制备单克隆抗体

用恶性疟原虫MSP131基因片段的重组质粒DNA直接免疫BALB/c小鼠,诱导产生体液,免疫后取脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞在PEG1450作用下进行融合,获得了2株能分泌抗恶性疟原虫MSP131单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株9H9和8A2。用酶联免疫吸附试验检测,小鼠腹水抗体滴度最高为1∶10 000。经免疫球蛋白类型和亚类鉴定,2株杂交瘤细胞株均为IgG\-1\.蛋白免疫印迹试验表明,此单克隆抗体与MSP1\|31蛋白抗原有特异免疫反应,证明通过质粒DNA直接免疫小鼠可制备特异性单克隆抗体。     

Rad9在DNA损伤修复及细胞周期检测点调控中的作用

细胞时刻面临着细胞内部因素或周围环境因素对基因组DNA的攻击,从而导致DNA损伤。DNA损伤可触发生物的DNA损伤修复系统来管理和修复各种DNA损伤,以维持基因组稳定性。当细胞受到损伤后,Rad9在细胞周期检测点中发挥作用,阻滞细胞周期的运行,使细胞有时间修复损伤DNA,来维持基因组的稳定。本文重点介绍Rad9在DNA损伤修复及细胞周期检测点调控中的作用及研究进展。     

基于CRISPR/Cas9系统和增强ssODN重组建立tau-V337M小鼠模型

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立tau-V337M突变的阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)小鼠模型。通过设计和体外合成单向导RNAs(single guide RNAs,sgRNA)及单链寡核苷酸(single-stranded oligonucleotides,ssODN),将sgRNA、Cas9蛋白、ssODN注射到小鼠受精卵内,利用DNA切割和重组产生突变。为了提高重组效率,又在注射时添加Rad51蛋白。使用自然交配的雌鼠作为受体,将2细胞期的编辑胚胎进行单侧输卵管移植。研究发现通过添加Rad51蛋白可以获得较高的突变效率,在F0小鼠中获得了tau-V337M小鼠并进行扩繁,F0代tau-V337M小鼠可以将突变遗传给F1代。综上所述,本研究利用Cas9、ssODN和Rad51成功建立了首个tau-V337M基因位点突变的小鼠模型,为AD的研究和点突变模型制作提供了模型和方法基础。     

胚胎干细胞周期调控的研究进展

胚胎干细胞（embryonic stem cells,Escs）具有自我复制和多潜能分化的特性。相对于体细胞,胚胎干细胞的细胞周期调控非常特别。比如,G1期较短;P53、RB等调控细胞周期“检验点”的蛋白分子功能“异常”等。胚胎干细胞细胞周期调控的研究对于研究胚胎干细胞的自我复制和多潜能性,都具有重要指导意义。该文将重点比较体细胞和胚胎干细胞在细胞周期调控方面的差异,并对近年来有关小鼠和人胚胎干细胞的细胞周期调控的研究进展进行介绍。     

Rad21基因位点的遗传修饰抑制骨骼肌干细胞分化

细胞谱系分化受到遗传、表观遗传、三维基因组结构的复杂调控。在真核细胞三维基因组结构中,黏连蛋白(cohesin)复合物介导染色质成环和拓扑相关结构域的形成。为了探讨Cohesin复合物介导的染色质高级结构是否调控成体干细胞分化及其相关基因表达,该研究选择了Cohesin复合物的一个亚基RAD21,制备了可诱导型RAD21蛋白降解的基因敲入小鼠模型(auxininducible degron,AID)。当auxin存在时,泛素连接酶Os TIR1降解含有AID标签的RAD21蛋白。小鼠制备策略是:在Rad21基因3′端引入了Loxp-Stop-Loxp-AID-EGFP-P2A-Os TIR1元件(Rad21^Aid/+),与骨骼肌成体干细胞特异的Cre工具鼠(Pax7-Cre)配繁,通过auxin诱导,在骨骼肌成体干细胞中特异降解RAD21蛋白,从而探究RAD21蛋白缺失对骨骼肌成体干细胞分化及相关基因表达的影响。该研究取得意外的结果:Rad21基因敲入的纯合子小鼠(Rad21^Aid/Aid,Hom)比野生型小鼠(WT)出生率显著降低;出生的H...     

肿瘤转移抑制因子基因MRP-1/CD9对小鼠胚胎着床影响的研究

目的研究外源性MRP-1/CD9抗体对小鼠胚胎着床的影响。方法1.将8-细胞小鼠胚胎培养于含不同浓度MRP-1/CD9抗体的培养液中,观察囊胚形成及囊胚脱透明带的情况。2.妊娠D4小鼠子宫角注射MRP-1/CD9抗体,于妊娠D8观察小鼠胚胎植入数量。结果1.体外培养时,MRP-1/CD9抗体显著抑制胚胎的囊胚形成率(1:400,P<0.05)和脱带率(1∶800,P<0.05)。2.宫角注射MRP-1/CD9抗体可以显著提高小鼠胚胎的着床数(8.33±0.15vs4.57±0.21)。结论MRP-1/CD9参入小鼠胚胎的发育及植入。     

抑制MTM1表达促进胚胎干细胞分化

应用随机RNAi文库,筛选了与胚胎干细胞自我更新和分化调控相关基因,发现了多个阳性候选基因,对其中的1个阳性候选基因肌管素1（myotubularin, MTM1）基因进行了深入研究．MTM1是属于蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPase）蛋白家族的蛋白,其基因突变导致肌管性肌病．MTM1在胚胎干细胞中的功能到目前为止还不清楚．研究证实,MTM1在小鼠胚胎干细胞系CCE和R1均有表达．应用RNA干扰及集落形成实验证明,MTM1表达抑制后,处于自我更新状况胚胎干细胞集落的比例显著增加,提示MTM1在胚胎干细胞自我更新和分化的调控中起了重要的作用．     

DNA聚合酶δ结合蛋白38是microRNA-291a-5p的一个靶基因

DNA聚合酶δ结合蛋白38 (DNA Polymerase delta-interacting protein 38,PDIP38) 是2003年新鉴定的一个基因,目前认为其可能在DNA修复、有丝分裂以及血管平滑肌细胞迁移中起重要作用。根据本实验室前期在胚胎干细胞中对该基因的研究,认为microRNA可能在PDIP38的调控过程中发挥了重要作用。为证实这种推论,运用生物信息学方法预测发现在胚胎干细胞中高表达的microRNA——microRNA-291a-5p (miR-291a-5p) 与PDIP38的开放阅读框 (ORF) 有一个配对非常理想的靶位点,通过构建该靶位点的报告基因载体以及ORF表达载体,分别进行荧光素酶报告基因分析以及细胞转染和Western blotting方法。结果证明miR-291a-5p能够直接调节PDIP38的蛋白表达。进一步运用real-time PCR和Western blotting分析证明了在胚胎干细胞中miR-291a-5p能够调节内源PDIP38的蛋白表达而对其mRNA表达无影响,这些都证明PDIP38确实是miR-291a-5p的一个靶基因。     

小鼠KCTD10特异性抗体制备及其在小鼠背神经上皮和背根神经节中的表达

KCTD10蛋白是一个TNF-α诱导表达的蛋白,能与DNA聚合酶δ的小亚基和PCNA相互作用。但其具体功能尚不清楚。为了研究KCTD10的功能,用小鼠KCTD10融合蛋白免疫新西兰大白兔获得兔抗鼠KCTD10多克隆抗体。由于小鼠KCTD10蛋白与小鼠PDIP1蛋白和TNFAIP1蛋白有较高的蛋白序列相似性,KCTD10抗体同PDIP1蛋白、TNFAIP1蛋白有抗体交叉反应。将同源蛋白PDIP1和TNFAIP1的部分降解片段与抗KCTD10血清在4℃下孵育3h从而消除非特异性抗体,成功地消除了KCTD10多克隆抗体对PDIP1蛋白和TNFAIP1蛋白的交叉反应。用此抗体做小鼠胚胎及胚胎切片的免疫组化,发现KCTD10蛋白在E12.5d的小鼠胚胎背根神经节以及神经管神经上皮中有明显的表达。该结果提示KCTD10可能在小鼠的神经管神经上皮和背根神经节发育中发挥作用。     

酿酒酵母S期检查点通路上web2基因与rad53基因的位置关系

为探讨酿酒酵母(S.cerevisiae)S期检查点通路上,web2(wants E1A badly2,web2)基因与rad53基因的上下游位置及相互作用关系,利用羟基脲(hydroxyurea,HU)分别阻断web2突变株和野生株细胞的DNA合成.采用pHA- rad53质粒救助实验测定质粒源性Rad53蛋白是否能救助web2突变株对羟基脲的敏感性;Western印迹及免疫共沉淀反应检测Rad53蛋白表达及磷酸化.结果显示,pHA-rad53质粒可以救助web2突变株的存活;Western印迹检测到web2突变株内质粒源性Rad53蛋白表达增强而且至少Rad53部分蛋白为磷酸化蛋白.说明在HU作用下,过表达并磷酸化的质粒源性Rad53蛋白可以救助web2突变株的S期检查点功能缺陷,在酿酒酵母S期检查点通路上web2基因位于rad53基因上游,可能直接参与将检查点信号传递至Rad53蛋白.     

小鼠KCTD10特异性抗体制备及其在小鼠背神经上皮和背根神经节中的表达

KCTD10蛋白是一个TNF-α诱导表达的蛋白,能与DNA聚合酶δ的小亚基和PCNA相互作用。但其具体功能尚不清楚。为了研究KCTD10的功能,用小鼠KCTD10融合蛋白免疫新西兰大白兔获得兔抗鼠KCTD10多克隆抗体。由于小鼠KCTD10蛋白与小鼠PDIP1蛋白和TNFAIP1蛋白有较高的蛋白序列相似性,KCTD10抗体同PDIP1蛋白、TNFAIP1蛋白有抗体交叉反应。将同源蛋白PDIP1和TNFAIP1的部分降解片段与抗KCTD10血清在4℃下孵育3 h从而消除非特异性抗体,成功地消除了KCTD10多克隆抗体对PDIP1蛋白和TNFAIP1蛋白的交叉反应。用此抗体做小鼠胚胎及胚胎切片的免疫组化,发现KCTD10蛋白在E12.5d的小鼠胚胎背根神经节以及神经管神经上皮中有明显的表达。该结果提示KCTD10可能在小鼠的神经管神经上皮和背根神经节发育中发挥作用。     

小鼠成纤维细胞凋亡与bcl-2结合蛋白

为检测细胞凋亡过程中bcl-2基因的结合蛋白,用PCR技术扩增小鼠bcl-2基因(mbcl-2)调控区,经亚克隆后的序列分析证实其准确性.用5-氟尿嘧啶(5-Fu)诱导小鼠成纤维细胞(C3H 10 T1/2 Cl 8)凋亡,以此PCR产物作探针,对上述细胞的核蛋白质粗提物进行迁移位移法(EMSA)与DNA-蛋白质印迹分析.结果表明,细胞核内一分子质量为53 ku的结合蛋白与mbcl-2调控区的结合信号在5-Fu刺激12 h后明显增强,而一种100 ku的DNA结合蛋白与该区的结合信号在5-Fu刺激12 h后明显减弱.因而,p53蛋白有可能是bcl-2的负转录因子,100 ku的DNA结合蛋白有可能是bcl-2的正转录因子.     

科研快讯

<正>自然—免疫学:Sox2可检测细菌DNA并触发相关免疫反应据《自然—免疫学》刊登的一项研究结果显示,Sox2蛋白可以检测细菌DNA的存在并触发小鼠和人体内部特定白细胞——中性粒细胞的免疫反应。Sox2蛋白在胚胎发育中起着关键作用,其能将成体细胞转化为诱导多功能干细胞。在胚胎干细胞中,Sox2蛋白存在于细胞核中,通过与DNA的作用控制发育过程中所需基因的表达。Zusen Fan等人发现,对于中性粒细胞这种在哺乳动物体内充当抵御入侵病原体的"先头部队"而