多巴胺D5受体转基因小鼠的建立

目的建立人多巴胺D5受体突变基因F173 L（D5F173L）,S390G（D5S390G）及正常人D5基因（hD5 WT）的转基因小鼠,利用该转基因动物模型来研究D5受体在原发性高血压中的发病机制。方法利用显微注射的技术将插入CMV启动子下游的D5F173L,D5S390G及hD5 WT基因的转基因载体注射入C57BL/6小鼠体内,建立多巴胺D5F173L,D5S390G及hD5 WT的转基因小鼠。通过PCR鉴定转基因小鼠的基因型。利用Western Blotting方法鉴定该受体蛋白在肾脏的表达情况。使用智能无创血压测量仪测量转基因小鼠的血压值。结果分别建立了多巴胺D5F173L,D5S390G及hD5 WT转基因C57BL/6小鼠,Western Blotting方法鉴定结果显示,与非转基因C57BL/6小鼠比较,D5转基因小鼠D5受体在肾脏有较高的表达。3-6月龄D5 F173L转基因小鼠的收缩压、舒张压和平均动脉血压均明显高于多巴胺D5S390G及hD5 WT转基因小鼠（n=6-8,P〈0.05）。结论多巴胺D5受体在原发性高血压发病中具有重要作用,但作用机理还有待于进一步研究。     

WIF-1心脏特异表达转基因小鼠心脏功能分析

目的建立心脏特异表达WIF-1转基因小鼠,研究该基因在心脏中表达对小鼠心脏发育,形态和功能维持中的作用。方法RT-PCR法克隆人WIF-1基因,把WIF-1基因插入α-MHC启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立转WIF-1C57BL/6J小鼠。并利用特异引物PCR法鉴定转基因小鼠的基因表型,RT-PCR和Westernblot检测基因表达水平,超声检测不同月龄WIF-1转基因小鼠心脏结构及功能变化。结果建立了2个系的心脏特异表达WIF-1转基因小鼠。心脏超声检查证实,WIF-1转基因小鼠与对照小鼠比较,左心室重量减小,舒张期左室内径和容积变小,每搏输出量和心输出量减小。结论WIF-1基因是心脏功能的负调控因子。     

心脏特异表达Calponin 1转基因小鼠的心脏功能分析

目的建立心脏特异表达Calponin 1转基因小鼠,研究Calponin 1对心脏发育及心肌病的调节作用。方法利用心脏特异启动子α-MHC构建转基因表达载体,显微注射法建立Calponin 1转基因小鼠,PCR法鉴定转基因小鼠的基因型,Western Blot检测Calponin 1在心脏组织中的表达,心脏超声检测转基因小鼠的心脏结构和功能,HE染色和Masson染色检测转基因小鼠心脏的病理改变。结果 Calponin 1在野生型小鼠心脏中有表达,在扩张型心肌病小鼠的心脏组织表达降低。通过显微注射法,建立了2个心脏组织Calponin 1基因高表达的转基因小鼠系。与野生型小鼠相比,Calponin 1转基因小鼠收缩期左室内径（LVID,systolic）增加28%（P〈0.01,n=12）,舒张期左室内径（LVID,diastolic）增加16.2%（P〈0.01,n=12）,收缩期左室后壁厚度（LVPW,systolic）减小15.7%（P〈0.01,n=12）,舒张期左室后壁厚度（LVPW,diastolic）减小21%（P〈0.01,n=12）,射血分数（ejection fraction,EF）降低11.5%（P〈0.01,n=12）,短轴内径缩短率（fraction shortening,FS）降低14.6%（P〈0.05,n=12）。转基因小鼠心脏组织病理H＆E染色和Masson染色显示,转基因小鼠心室扩张,心肌细胞不均匀肥大,细胞间隙变大,心肌间质纤维增多。结论 Calponin 1在心脏特异过表达引起转基因小鼠心脏左室内径增加,收缩期容积和舒张期容积显著增大,心室壁变薄,射血分数及短轴缩短率降低等扩张性心肌病表型,推测Calponin 1是参与心肌病病理发生的基因之一。     

心脏特异表达肾素（原）受体转基因小鼠的建立

目的建立心脏特异表达（p）RR的转基因小鼠,研究（p）RR在心肌病发病过程中的调节作用。方法将（p）RR基因插入到心脏特异表达启动子α-MHC下游,构建转基因表达载体,通过显微注射的方法建立（p）RR转基因小鼠,PCR法鉴定转基因小鼠的基因型;Western blot和免疫组化的方法检测（p）RR在心脏组织中的表达;利用小动物超声仪检测转基因小鼠的心脏结构和功能;双色免疫荧光共聚焦进行（p）RR蛋白在转基因小鼠中的亚细胞定位,Western blot方法检测了钙泵（ATP2A2）、钠-钙交换体1（NCX 1）以及肌钙蛋白T（cTnT）在转基因小鼠心脏组织中表达量的变化情况。结果建立了心脏高表达（p）RR的转基因小鼠品系;内源性和转基因高表达的（p）RR蛋白均定位在细胞内高尔基体和内质网上;心脏特异高表达（p）RR蛋白使小鼠心脏收缩功能增强,主要表现在与同窝阴性对照小鼠相比,转基因小鼠收缩期左室内径（LVID,systolic）降低9%（P〈0.05,n=18）,收缩期容积（LVESV,systolic）减少了23%（P〈0.05,n=18）,射血分数EF（ejection fraction）升高14%（P〈0.01,n=18）,短轴缩短率FS（fraction shortening）升高20%（P〈0.01,n=18）;和心脏收缩功能和钙离子相关的ATP2A2和NCX 1表达均下调,而cTnT表达量上调。结论在心脏中过表达（p）RR能够引起心脏收缩功能明显增强,同时直接或间接调节ATP2A2、NCX 1和cTnT表达。提示（p）RR可能是调节心脏中的钙离子而参与影响心肌功能。     

心脏特异表达Dhcr24转基因小鼠的建立和表型分析

目的建立心脏特异表达小鼠24-脱氢胆固醇还原酶基因（Dhcr24）转基因小鼠,研究该基因在心脏中表达对小鼠心脏发育,形态和功能维持中的作用。方法RT-PCR法克隆小鼠24-脱氢胆固醇还原酶基因,把Dhcr24基因插入-αMHC启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立Dhcr24 C57BL/6J转基因小鼠。并利用特异引物PCR法鉴定转基因小鼠的基因型,RT-PCR和Western Blotting检测基因表达水平,光学显微镜和超声检测不同月龄Dhcr24转基因小鼠心脏的组织结构改变。结果建立了2个品系的心脏特异表达Dhcr24转基因小鼠。转入的Dhcr24基因在心脏组织的表达水平超过内源性Dhcr24的3倍。心脏组织学和超声检查证实：Dhcr24转基因小鼠的心室壁变厚,心腔变小,但心脏功能保持正常。结论成功建立了心脏特异表达Dhcr24转基因小鼠,Dhcr24基因在心脏组织的过度表达对小鼠心脏发育和功能维持中的作用需要进一步探讨。     

反义磷脂酶Dγ转基因片段的结构与功能分析及转基因产物预测

目的:从生物信息学角度,对反义磷脂酶Dγ转基因片段的结构、来源进行查找,并预测分析该片段的转录产物、翻译产物,进而推导该片段的最终产物和作用方式。方法:利用http://www.expasy.ch/、http://bioweb.pasteur.fr、http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www、http://www.ncbi.nlm.nih.gov等在线分析工具。结果:该片段来自拟南芥第4条染色体上磷脂酶Dγ2(NM_117252.4│GI:42566497),转录生成一段400bp、没有稳定二级结构的RNA,且不能翻译产生蛋白质;经查找,有许多转录物因子和micRNA(mRNA干扰互补RNA,反义RNA)查找。结论:该片段最终产物为micRNA,在RNA干扰(RNAi)水平上调控相关基因的表达。     

人心肌肌钙蛋白C两种突变转基因小鼠模型建立与对比分析

目的：为建立心肌组织特异性表达人cTnCD145E和cTnCG159D突变基因转基因小鼠,为对比分析两种不同心肌病的发生发展建立模型。方法利用定点突变技术分别制备人cTnC基因的cTnCD145E和cTnCG159D两个突变体,随后插入心肌特异性表达启动子α-MHC下游构建人cTnCD145E和cTnCG159D基因转基因载体。通过显微注射法建立转基因C57BL/6小鼠。利用心脏超声和病理观察对比分析不同年龄转基因小鼠心脏的结构与功能。结果建立了心肌组织高表达人cTnCD145E和cTnCG159D突变基因转基因小鼠,cTnCD145E和cTnCG159D转基因小鼠随年龄增加,有分别向HCM和DCM发展的趋势,12月龄时,cTnCD145E转基因小鼠收缩末期和舒张末期左室容积（ left ventricle end-diastolic volume and end-systolic volume,EDV and ESV）与同窝阴性小鼠相比下降,射血分数（ejection fraction, EF）和收缩末期左心室后壁厚度（left ventricle end-systolic posterior wall thickness ,ESPWT）增加,而cTnCG159D转基因小鼠EDV和ESV与同窝阴性小鼠相比上升,EF和ESPWT减少。结论心肌组织特异性表达人cTnCD145E突变基因转基因小鼠表现肥厚型心肌病病理表型,而心肌组织特异性表达人cTnCG159D突变基因转基因小鼠表现扩张型心肌病病理表型,二者可作为对比研究由不同发病机制导致的心肌病模型。     

肝组织特异表达人核受体nr5a2转基因小鼠的构建

人乙肝病毒增强子ⅡB1结合因子（hB1F）系Ftz—F1（NR5A）亚家族的新成员。经基因重组法将人hb1 fcDNA置于小鼠白蛋白增慢子／启动子序列下游构建成肝特异重组载体,通过原核显微注射将该载体导入小鼠受精卵原核,经注射且状态良好的卯回输至假孕母鼠输卯管。产下仔鼠经PCR和Southern blotting鉴定,同时RT—PCR和Western blotting分析转基因的表达。阳性Founder鼠与正常C57鼠交配以建立转基因纯系小鼠,F1代以PCR法鉴定。结果共获得4只PCR鉴定转基因阳性Founder鼠,其中一只同时经Southern blotting鉴定为阳性。RT—PCR和Western blotting结果显示,外源基因在转基因小鼠的肝组织成功表达。遗传学分析表明,转基因已整合入小鼠基因组并可稳定溃传。     

小鼠Lrp5基因启动子的克隆及功能分析

为分析小鼠LDL受体相关蛋白 5 (Lrp5 )基因启动子的结构与功能 ,采用DNA重组技术 ,构建了 7种含小鼠Lrp5基因启动子荧光素酶报告基因表达体系 ,分别为 :pGL3 10 3(- 10 3bp～ + 132bp) ,pGL3 30 3(- 30 3bp～ + 132bp) ,pGL3 4 99(- 499bp～ + 132bp) ,pGL3 70 8(- 70 8bp～ + 132bp) ,pGL3 90 9(- 90 9bp～ + 132bp) ,pGL3 10 34(- 10 34bp～ + 132bp ) ,pGL3 12 2 9(- 12 2 9bp～ + 132bp) .以pRL TK为内参照质粒 ,瞬时转染成骨细胞株 (U2OS )及非成骨细胞株 (COS 7) ,收集细胞测定荧光素酶相对表达活性 .7种荧光素酶表达质粒在 2种细胞中表达无显著差异 ,即在所分析的小鼠Lrp5基因的 136 1bp(- 12 2 9bp～ + 132bp)范围内 ,不存在成骨细胞特异的表达元件 ;而且 7种表达质粒在 2种细胞中呈现相似的变化趋势 ,pGL3 10 3表达活性最高 ,pGL3 12 2 9表达活性显著降低 .表明小鼠Lrp5基因转录所必需的基本启动子序列在 - 10 3bp～ + 1bp范围内 ,- 10 34bp～ - 12 2 9bp之间的 195bp片段内可能含有负调控元件 .     

人SR-AI转基因小鼠遗传与繁育的研究

目的探讨被转入的人SR-AI基因的整合与复制情况及其对小鼠繁育的影响.方法采用类似系祖建系的方法,对人SR-AI转基因小鼠的2、3534、3560、3638、3639五个系列进行了繁育.并用PCR和Southermblot的方法,检测五个系列小鼠尾组织的DNA样品.结果五个系列小鼠共产仔431只,PCR检出阳性小鼠178只,阳性率为41.2%.在3639系的F1、F2、F3代及纯合子转基因鼠中PCR阳性率分别为47.8%、71.3%、75%和100%.结论人SR-AI基因在子代鼠中能稳定遗传,且对生殖和发育无明显影响.