哺乳动物体细胞克隆技术的研究进展

尽管与已有十几年发展史的哺乳动物胚胎细胞克隆技术相比,其体细胞克隆技术的研究仅有不到三年的时间;然而,鉴于哺乳动物体细胞克隆技术在供核效率等方面所具备的明显优势,其应用价值远高于胚胎细胞克隆技术。随着对哺乳动物体细胞克隆技术基本机理的进一步广泛深入的研究,它将在大量克隆优良种畜、扩大同基因型实验动物种群、培育转基因动物和保护濒危野生动物遗传资源等方面发挥巨大作用。     

哺乳动物体细胞克隆技术的研究进展

尽管与已有十几年发展史的哺乳动物胚胎细胞克隆技术相比,其体细胞克隆技术的研究仅有不到三年的时间;然而,鉴于哺乳动物体细胞克隆技术在供核效率等方面所具备的明显优势,其应用价值远高于胚胎细胞克隆技术。随着对哺乳动物体细胞克隆技术基本机理的进一步广泛深入的研究,它将在大量克隆优良种畜、扩大同基因型实验动物种群、培育转基因动物和保护濒危野生动物遗传资源等方面发挥巨大作用。     

动物基因敲除研究的现状与展望

基因打靶技术是建立在胚胎干细胞和同源重组技术之上,可对基因组进行定位修饰的实验方法,尤其可以在转基因动物的遗传性状修饰中起到巨大的作用。本文简述了转基因、体细胞克隆和基因打靶的研究历史,以及这些技术对转基因动物制备的影响和展望。     

体细胞克隆猪的研究进展

哺乳动物克隆不仅可以保护濒危动物 ,而且与干细胞工程技术相结合能应用于克隆性治疗 ,是目前生物技术领域研究的热点之一 ,具有重大的科学意义和应用价值。由于体细胞克隆猪在人类器官移植方面具有巨大的应用潜力 ,已成为当今体细胞克隆研究的热点。从 2 0 0 0年开始 ,在不同国家相继诞生了体细胞克隆猪及转基因猪 ,但是其成功效率很低 ( 1 %～ 2 % )。主要综述了影响体细胞克隆猪的几个因素 ,涉及胞质受体、供核细胞、显微操作、激活以及重组胚移植     

供体细胞与哺乳动物体细胞核移植

哺乳动物体细胞核移植(克隆)技术在转基因动物生产、珍稀动物资源复原与保护、生物学基础研究等方面业已显示出重要的应用价值,而目前该技术还与诱导多能干细胞技术一同被认为是创制患者特异性多能干细胞,为再生医学临床"细胞治疗"提供素材的最佳手段。但是,体细胞克隆的效率仍不理想,关键机制还不清楚,严重制约了该技术的推广。因此,如何提高克隆效率已成为人们普遍关心的首要问题。在体细胞克隆技术所涉及的各环节中,供体细胞是影响克隆效率的最关键因素之一。该文从供体细胞的生物学因素和技术因素两方面进行了回顾,旨在为进一步探寻建立物种或供体细胞个性化准备方案,为提高动物克隆效率提供参考。     

哺乳动物克隆的研究进展与应用前景

显微注射技术本身固有的缺点在很大程度上限制了转基因动物的研究及应用。近年来,体细胞基因打靶和体细胞克隆的最新研究进展表明,这两种技术相结合将成为制备大型转基因动物的有效途径。     

克隆猪技术及其在转基因猪研究中的应用

哺乳动物核移植技术是一种可以获得基因组遗传信息完全相同的后代的生物技术。猪体细胞核移植技术包括以下几个环节：卵母细胞的体外成熟、供体细胞的分离和处理、体细胞的核转移、重构胚胎的人工激活、胚胎体外培养和胚胎移植。由于该技术在最近几年的迅速发展,很多实验室已通过该技术成功获得了克隆猪后代。核移植克隆猪技术的出现为生产转基因猪提供了一种有效的方法,并且是目前生产基因打靶猪的惟一方法。至今利用克隆猪技术已经成功获得了一系列的转基因猪和基因敲除猪。以核移植技术产生基因修饰猪目前正处于从基础研究走向应用的过渡阶段。尽管猪体细胞核移植克隆的效率（出生克隆猪数占所用卵数的比例）还不高,但是由于通过该技术能够对猪基因组进行特定的修饰,确保生产的克隆动物100％为转基因动物,从而大大提高了转基因猪的制作效率,可以预料猪核移植技术将会对医药业和农业产生重大的影响。     

我国体细胞克隆牛的研究进展

近年来,由于体细胞克隆技术在畜牧业生产、疾病治疗、生物学基础理论研究及濒危动物保护等诸多领域所蕴藏的巨大应用价值,克隆效率成为科学界研究的热点问题。本文对克隆技术的相关影响因素进行了综述,研究表明,不同细胞系影响到体细胞克隆牛效率,胎儿细胞和颗粒细胞重构胚的囊胚发育率、犊牛成活率比成年成纤维细胞高。关于卵母细胞和克隆胚胎冷冻保存的研究表明,玻璃化冷冻法可以用于克隆胚胎以及卵母细胞的冷冻保存。在此基础上,讨论了国际上哺乳动物体细胞克隆研究新进展和体细胞克隆的效率,指出体细胞克隆中亟待解决的问题。     

哺乳动物体细胞核移植表观遗传重编程研究进展

体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer, SCNT)是唯一能赋予体细胞基因组全能性的生殖工程技术,对动物种质资源保存、畜牧业发展和生物医学研究等具有重大意义。尽管该技术已经取得了许多研究进展,但哺乳动物克隆胚胎的发育效率依然很低,严重限制其在畜牧业和生物医学上的应用。导致克隆胚胎发育效率低的主要原因是体细胞重编程错误或重编程不完全,主要表现为:印记基因Xist表达异常、DNA甲基化异常,组蛋白修饰异常等。本文简要介绍了体细胞核移植技术,系统总结了哺乳动物克隆胚胎发育效率低的主要影响因素,以期为提升体细胞克隆效率相关研究与实践提供理论参考。     

哺乳动物体细胞克隆遗传物质的检测

随着哺乳动物克隆研究的开展以及体细胞克隆动物的相继诞生 ,克隆动物及其早期胚胎的遗传物质检测研究也越来越显得重要。从染色体分析、核DNA分析、线粒体DNA分析和端粒DNA分析四个方面简要介绍了哺乳动物体细胞克隆遗传物质检测研究的进展。     

哺乳动物卵母细胞及早期胚胎蛋白质组学研究进展

雌性生殖细胞发育是动物繁殖的基石,哺乳动物卵母细胞和早期胚胎在其生长发育过程中有许多独特的现象和规律,涉及一系列蛋白质合成/降解和磷酸化等状态的动态改变。对卵母细胞分裂、成熟调控机理以及植入前胚胎发育规律的研究是发育生物学领域的一项重要课题。蛋白质组学是以细胞或组织内全部的蛋白质为研究对象,系统鉴定、定量蛋白质并研究这些蛋白质功能的科学。随着蛋白质分离、鉴定技术的快速发展,蛋白质组学为卵母细胞发生、分化、成熟以及质量控制等相关研究提供了新的方法和内容,如在蛋白质定量、修饰、定位和相互作用等方面提供其他组学技术不可获得的重要信息。这些信息将有助于揭示哺乳动物卵母细胞成熟和早期胚胎发育的分子机制,对于进一步完善卵母细胞的体外成熟培养体系,提高胚胎体外生产、体细胞克隆和转基因动物生产效率具有重要意义。     

转基因动物在生物制药工业中的应用

简要论述了转基因动物的概念、制作方法及应用领域,回顾了转基因动物技术的发展及现状,分析了转基因动物与克隆动物的区别.就转基因动物在制药工业和生物医药领域中的国内外研究与开发应用情况进行了阐述,同时展望了转基因动物制药的发展前景及对社会的影响.     

Pear transformed with a lytic peptide gene for disease control affects nontarget organism,pear psylla (Homoptera: Psyllidae)

The biology and behavior of pear psylla, Cacopsylla pyricola Foerster, on a transgenic clone of 'Bartlett' pear, Pyrus communis L., containing a synthetic antimicrobial gene, D5C1, was compared with that of a nontransgenic parental clone to determine whether there were any nontarget effects. The gene construct also contained the marker gene nptII (aminoglycoside 3'-phosphotransferase II) that encodes for antibiotic resistance to identify transformed plants. The purpose of the original transformation was to enhance pear resistance to the bacterial disease fireblight caused by Erwinia amylovora (Burr.) Winslow et al. The biology and behavior of pear psylla on a transgenic clone were compared with a nontransgenic parental pear clone in short- (< or = 7-d) and long-term (32-d) studies. Short-term studies indicated pear psylla adults preferred to settle and oviposit, and nymphs fed more and developed slightly faster, on transgenic pear compared with nontransgenic pear. In contrast, a long-term study on psylla colony development showed considerably fewer eggs, nymphs, and adults were produced on transgenic pear. Although adults reared on transgenic pear did not have weight affected, females produced fewer eggs and nymphal hatch was significantly reduced on the transgenic pear clone. Our results suggest that pear psylla biology and behavior are initially enhanced on this transgenic pear clone. However, chronic exposure of psylla populations to transformed pear plants that express the nptII marker and lytic peptide genes had detrimental effects on pear psylla reproductive biology. Field studies would be required to determine the specific effects of each gene on pear psylla biology and behavior and whether these effects would be expressed under natural conditions. The four-fold reduction in psylla population levels that resulted on this disease resistant transgenic pear line would be an added benefit to a pear integrated pest management (IPM) program. Overall, this study demonstrates that genetically altering plants to control one particular organism can have unintentional yet beneficial effects against other nontarget pest organisms in agricultural crops.     

Enhanced CHO Clone Screening: Application of Targeted Locus Amplification and Next‐Generation Sequencing Technologies for Cell Line Development

Early analytical clone screening is important during Chinese hamster ovary (CHO) cell line development of biotherapeutic proteins to select a clonally derived cell line with most favorable stability and product quality. Sensitive sequence confirmation methods using mass spectrometry have limitations in throughput and turnaround time. Next‐generation sequencing (NGS) technologies emerged as alternatives for CHO clone analytics. We report an efficient NGS workflow applying the targeted locus amplification (TLA) strategy for genomic screening of antibody expressing CHO clones. In contrast to previously reported RNA sequencing approaches, TLA allows for targeted sequencing of genomic integrated transgenic DNA without prior locus information, robust detection of single‐nucleotide variants (SNVs) and transgenic rearrangements. During clone selection, TLA/NGS revealed CHO clones with high‐level SNVs within the antibody gene and we report in another case the utility of TLA/NGS to identify rearrangements at transgenic DNA level. We also determined detection limits for SNVs calling and the potential to identify clone contaminations by TLA/NGS. TLA/NGS also allows to identify genetically identical clones. In summary, we demonstrate that TLA/NGS is a robust screening method useful for routine clone analytics during cell line development with the potential to process up to 24 CHO clones in less than 7 workdays.     

利用雄性生殖细胞建立转基因动物的研究进展

随着科学研究的不断深入及临床治疗的需要,人们对转基因动物的需求越来越大;但是传统的转基因动物技术大多操作复杂、成本高、效率低,从而限制了转基因技术的广泛应用。利用雄性生殖细胞作为载体介导外源基因导入受精卵来建立转基因动物具有操作简便、经济、易于推广的优点,发展前景广阔。该文就利用雄性生殖细胞建立转基因动物的发展历程和方法进行系统的阐述和分析。从利用精子和精原干细胞携带外源DNA两个方向展开,分别分析和评价了恒温共孵育法、脂质体介导法、电穿孔法、胞浆内单精子注射法、输精管注射法、体外转染精原干细胞法以及体内转染精原干细胞法七种实验设计方法。     

动物转基因研究中的技术方法

转基因动物研究的深入为生物学的发展起到了巨大的推动作用。转基因新技术的不断出现,推动了转基因动物的发展。介绍了几种哺乳动物转基因研究中常见的方法,包括原核显微注射法、逆转录病毒感染法、胚胎干细胞介导法、生殖细胞介导法、基因打靶以及新的比较有应用前景的方法,如PiggyBac、iPS,锌指核酸酶法,并且分别对每种方法的优缺点进行了总结归纳。     

转几丁质酶和葡聚糖酶双价基因棉花对土壤细菌种群多样性的影响

以转几丁质酶和葡聚糖酶双价基因棉花为研究对象,非转基因受体棉花为对照,通过比较可培养细菌数量和基于16S rRNA克隆文库细菌种群分析,评价外源双价基因的导入在苗期、蕾期、花铃期和吐絮期对棉花根际细菌群落多样性的影响。结果表明,可培养细菌的数量不受外源双价基因的影响,随着棉花生育期的交替而变化,以代谢旺盛的花铃期最多。构建的转基因和非转基因不同生育期根际土壤细菌16S rRNA文库容量为2400个克隆,涵盖了细菌的283个属。其中,Acidobacterium是最大优势类群,共包括624个克隆,其次为未知细菌种群和Flavisolibacter。比较转基因和非转基因棉花根际土壤细菌的种群结构,结果显示,同一生育期内前者种群的多样性显著低于后者,二者的共有类群随着生长发育的进行而增多。研究结果说明几丁质酶基因和葡聚糖酶基因对棉花根际细菌种群多样性有着不同程度的削减作用,但是随着种植时间的延长,该差异呈现逐渐缩小的趋势。     

转基因动物研究新进展

我们曾对转基因动物的制作方法、转基因动物研究的应用、转基因的表达特征及提高转基因表达的策略等作过专题综述＾「１」。而这之后在转基因动物的研究方面又获得了许多新进展,其中转线粒体动物的问世拓宽了转基因动物的研究内容。在制作转基因动物的方法上,１９９８－１９９９年世界上先后报道了三种新方法：即由Ｓｃｈｎｉｅｋ等报道的体细胞核移植技术实现转基因,由Ａｎｔｈｏｎｙ Ｗ．Ｓ．Ｃ等报道的通过用逆转录病毒载体感     

国外动物生物技术研究和产业化趋势分析

生物技术在全世界范围取得了飞速的进展,与此同时其应用和产业化在各国政府、科研机构和生物技术公司的大力参与和激烈竞争中也逐步加快,预计它将成为许多国家经济的重要支柱产业之一。一些重大生物研究项目如人类基因组计划、克隆技术等开始引起公众的广泛注意。综述了２０世纪９０ 来动物生物技术的发展状况,对基因组研究、转基因动物、克隆技术和细胞培养等重要研究方向作了介绍和分析。