《自然-细胞生物学》：蛋白抗癌与其诱导细胞自噬有关

细胞自噬与肿瘤之间的相互关系是各国科学家的研究热点,而自噬在肿瘤细胞中发挥何种作用却一直存在争议。北京大学基础医学院朱卫国教授课题组的研究发现,肿瘤抑制因子FoxO1（叉头蛋自家族1）是诱导细胞自噬的关键蛋白,其抗癌作用与其诱导自噬功能密切相关。近日,《自然一细胞生物学》（Nature Cell Biology）杂志刊登了这一研究成果。     

MERS冠状病毒3C样蛋白酶是一种新的细胞自噬诱导蛋白

冠状病毒（Coronavirus, CoV）3C样蛋白酶（3CLpro）在冠状病毒复制过程中起重要作用,是一种重要的潜在抗病毒药物候选靶标。细胞自噬是宿主重要抗病毒防御机制之一,但目前冠状病毒诱导细胞自噬及其机制还不很清楚。本研究以人类新发高致病性冠状病毒 --中东呼吸综合征冠状病毒（MERS CoV）为研究对象,探讨人类冠状病毒感染与细胞自噬的关系。通过免疫荧光法检测发现,MERS 3CLpro引起细胞内eGFP-LC3B绿色荧光点状聚集,同时MERS 3CLpro诱导自噬标志蛋白微管相关蛋白1-轻链3基 (LC3-II)表达增多,表明MERS 3CLpro可激活细胞自噬。进一步研究发现,MERS 3CLpro诱导细胞自噬体形成而阻断或抑制自噬溶酶体形成,即MERS 3CLpro诱导不完全细胞自噬效应,而且MERS 3CLpro诱导细胞自噬具有时间依赖性且不依赖于其蛋白酶催化活性。此外发现SARS CoV和NL63 CoV等其它人类冠状病毒3CLpro也具有诱导细胞自噬效应,表明3CLpro诱导细胞自噬可能是人类冠状病毒所具有的一种普遍生物学特性。本研究首次发现冠状病毒蛋白酶3CLpro能诱导宿主细胞自噬,是一种新型冠状病毒来源的宿主细胞自噬诱导蛋白,这一发现拓展了对人类冠状病毒蛋白酶功能的新认识,为研究冠状病毒与宿主抗病毒天然免疫以及以病毒蛋白酶为靶标的抗病毒药物研究提供了理论基础。     

塞内卡病毒A结构蛋白VP2诱导PK-15细胞自噬的研究

本研究在塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)诱导自噬的基础上,着重探究VP2蛋白在细胞自噬过程中的作用。构建VP2基因真核表达载体pcDNA3.1-VP2,将其转染至PK-15细胞,通过检测自噬蛋白和相关基因的表达情况,明确VP2蛋白对细胞自噬的影响。结果显示,本研究成功构建了pcDNA3.1-VP2真核表达载体,且SVA VP2基因在PK-15细胞中正常表达;与对照组相比,VP2蛋白显著上调LC3蛋白的表达水平（P<0.01）;同时,自噬基因LC3、Beclin-1和ATG5转录水平均显著提高（P<0.01）。综上所述,本研究证实SVA VP2蛋白可诱导PK-15细胞自噬,且VP2蛋白与自噬蛋白和基因表达水平呈正相关,为进一步研究病毒感染与致病机制打下基础。     

MiR-147a 通过抑制细胞自噬促进HIF-1alpha蛋白的积累

目的：HIF-1alpha是由低氧诱导表达的一个重要的调节肿瘤生长、代谢的转录因子,它的降解除了通过泛素- 蛋白酶体途径降解 之外还与可以通过细胞自噬途径降解。通过研究miR-147a 对细胞自噬的影响从而进一步研究miR-147a 对HIF-1alpha降解的影响。 方法：在HeLa 细胞中过表达miR-147a,用Western blot 和Q-PCR 检测细胞自噬相关的标志物LC3B、P62、LAMP-2A的变化。再 通过溶酶体- 自噬泡共定位实验共聚焦显微镜观察自噬泡的数量以及共定位情况。最后通过加入自噬诱导剂（EBSS）和自噬抑制 剂（Bafilomycin A1）,用Western blot 检测转染NC 与miR-147a 后HIF-1alpha蛋白的表达情况。结果：过表达miR-147a 后自噬相关的 标志物LC3B、P62 表达量上升,LAMP-2A 表达量下降,且溶酶体与自噬泡的共定位增多;加入自噬诱导剂和自噬抑制剂后 HIF-1-alpha蛋白的表达量增加。结果表明miR-147a 可以抑制细胞自噬的巨自噬途径以及分子伴侣介导的自噬途径,积累HIF-1-alpha蛋 白。结论：miR-147a通过抑制细胞自噬从而减少HIF-1-alpha蛋白的降解,但是miR-147a 作用靶点的分子机制需要进一步研究。     

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路与细胞自噬

细胞自噬作为真核生物中最基本的生命现象,广泛参与机体的多种生理和病理过程,其发生的分子机制复杂且高度保守。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）通路和Beclin1及相关因子发挥了最直接的调控作用。mTOR可通过上游各信号因子的调节引起自身活性的变化,并通过调节下游复合物Atg1/ULK的生成诱导细胞自噬。弄清mTOR通路及其对自噬复合物的作用机制将有助于从分子水平上对各种肿瘤疾病进行分析和治疗。     

细胞自噬对酒精诱导的肝细胞毒性的保护作用

目的：研究细胞自噬对酒精诱导的人肝细胞系（CL-1）的保护作用。方法：培养正常肝细胞系CL-1细胞,80mmol／L酒精常规处理24小时,采用CCK-8法观察酒精对细胞活力的影响;流式细胞技术观察酒精对细胞凋亡的影响;免疫蛋白印迹及转染GFP-LC3法检测细胞自噬水平;选用rapamycin和3-MA调节细胞自噬,观察酒精处理后细胞活力及凋亡的变化。结果：酒精处理体外培养的CL-1细胞,实验组较对照组细胞活力下降（P〈0．05）;实验组细胞46．2％发生凋亡,显著高于对照组8．4％;LC3II及Beclinl水平显著高于对照组;GFP-LC3荧光数显著高于对照组（P〈0．05）;调节细胞自噬水平,rapamycin组细胞活性增加（P〈0．01）,31．1％（46．2％）细胞发生凋亡;3-MA组细胞活性降低（P〈0．05）,54．1％（46．2％）细胞发生凋亡。结论：酒精处理降低CL-1细胞活性,促进凋亡,提高自噬水平;提高或降低细胞自噬水平,细胞凋亡及活力随之降低和增加;细胞自噬能够对抗酒精诱导的肝细胞凋亡。     

细胞自噬与肿瘤耐药

细胞自噬是一种细胞自我降解的过程,在适应代谢应激、保持基因组完整性及维持内环境稳定方面发挥重要作用. 在肿瘤治疗中,凋亡耐受是产生肿瘤耐药的重要机制. 细胞自噬可防止抗肿瘤药诱导的凋亡,促进肿瘤耐药. 然而,自噬性细胞死亡可能是凋亡耐受肿瘤细胞的一种死亡方式. 因此,细胞自噬对肿瘤细胞的耐药性有双重影响. 本文综述了细胞自噬的分子机制、细胞自噬与凋亡的关系、细胞自噬与肿瘤耐药以及治疗的主要研究进展.     

雌激素通过GPR30-AMPK-mTOR通路诱导Ishikawa细胞自噬增强细胞活力

雌激素是子宫内膜癌发生发展的重要诱导因子,但关于其在子宫内膜癌中的作用机制目前仍不明确。自噬对细胞的存活具有重要的调节作用,研究发现其在子宫内膜癌发生发展的过程中起重要的调节作用。本文通过探讨雌激素对子宫内膜癌细胞自噬的影响,深入地了解雌激素促进子宫内膜发展的机制,并明确GPR30-MPK-mTOR 通路在其中的作用。MTT及透视电镜的结果显示,雌激素可以诱导细胞的自噬及增强细胞的活力,而这种作用具有一定的时间及浓度依赖性。同时,蛋白质印迹及实时定量PCR结果显示雌激素可以促进LC3、p-AMPK的表达,并且抑制P62、p-mTOR的表达,表明雌激素可以激活AMPK/mTOR通路。沉默G蛋白偶联受体30（GPR30）后,结果显示雌激素诱导细胞的自噬及细胞活力的作用被逆转,并且可以抑制AMPK/mTOR通路的激活,而G-1结果与之相反,表明雌激素通过GPR30激活AMPK/mTOR通路,诱导自噬及细胞活力。此外,加入AMPK抑制剂compound C,可以抑制雌激素诱导细胞的自噬及细胞活力的能力,并且促进P62、p-mTOR表达,降低LC3及p-AMPK表达,表明雌激素通过激活AMPK/mTOR激活细胞自噬及增强细胞活力。同时细胞预先加入自噬抑制剂3-MA或转染ATG5siRNA,可以降低雌激素增强细胞的活力,表明雌激素通过诱导自噬增强细胞活力。综合以上结果,雌激素通过GPR30-AMPK-mTOR通路诱导细胞的自噬增强细胞的活力。     

昆虫变态发育过程中的细胞自噬和凋亡

在昆虫变态期,幼虫组织发生退化或消亡,原因在于蜕皮甾醇激素（ecdysteroid）,即通常所说的蜕皮激素,诱导这些组织的细胞发生了自噬(autophagy)和凋亡(apoptosis)的程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)。一般情况下,自噬途径构成一种饥饿应激适应性以避免细胞的死亡,表现为低水平Cvt泡(Cvt vesicle)和自噬体(autophagosome)对部分胞质溶胶、蛋白聚集体和细胞器的吞噬和降解。昆虫进入变态发育时,由于蜕皮激素的激活,由遗传级联系统调控的PCD机制被启动,低水平的常态自噬转入高水平的自噬并同时诱发凋亡,细胞进入不可逆的死亡,导致幼虫组织在变态期退化或消亡。对果蝇Drosophila变态期PCD机制中最重要的发现是:（1）在自噬发生的PI3KⅠ- Tor 和 PI3KⅢ的分子通路中,由自噬相关蛋白Atg1引发的高水平自噬能够诱导凋亡;（2）蜕皮激素诱导表达的βFTZ-F1,E93,BR-C,E74A等转录因子不但激活凋亡的Caspases通路,还能诱导自噬的发生。     

抑癌基因p53与细胞自噬

细胞自噬(autophagy)是一种在进化上高度保守的代谢通路,它发生的分子机制和信号调控途径相当复杂,其中mTOR信号通路和Beclin1复合物发挥了最重要的调控作用,p53也是细胞自噬重要的调节因子。研究发现,p53可通过多种途径调节细胞自噬水平,这主要决定于它的亚细胞定位。在细胞核中,p53可通过多种方式上调细胞自噬;而在细胞质中,p53对细胞自噬具有负性调节作用,可抑制细胞自噬的发生。探究清楚p53与细胞自噬之间的调控关系将有助于人类正确认识由于细胞自噬功能异常所诱导的肿瘤的发生发展过程,从而最终攻克各种肿瘤性疾病。     

PC12细胞在缺氧条件下的自噬现象

目的：考察PC12细胞内自噬发生与缺氧时间的关系,探讨自噬对缺氧细胞的影响作用。方法：以PC12细胞为模型,将对数生长期的细胞加入96孔培养板,37℃、5% CO₂培养24 h后,放入0.5% O₂、94.5% N₂和5% CO₂的培养箱缺氧1 h、3 h、6 h、9h、12 h、24 h、36 h和48 h,用MTT法检测细胞存活率,透射电镜观察细胞内自噬体,Westen blot法检测自噬相关蛋白（LC3B、Atg5和Beclin1）的表达,用试剂盒检测细胞内乳酸脱氢酶（LDH）活性、活性氧自由基（ROS）和线粒体膜电位（MNP）水平,探究缺氧不同时间自噬对PC12细胞的作用。结果：在缺氧3~12 h,PC12细胞自噬明显增加,自噬相关蛋白（LC3B、Atg5和Beclin1）表达增加,尤其是缺氧9 h,PC12细胞存活明显增加,表明短时间缺氧自噬对细胞起保护作用,而随着缺氧时间的延长细胞存活明显降低,自噬相关蛋白表达水平减少,细胞LHD和ROS水平明显增加。MMP水平显著下降,细胞凋亡明显增加。结论：在缺氧早期自噬对PC12细胞起保护作用,但缺氧时间较长,超过了细胞自身调节能力导致细胞死亡。     

CHOP双重调控衣霉素诱导的DU-145细胞凋亡及自噬的研究

目的研究内质网应激分子CHOP调控细胞凋亡与自噬的作用和机制。 方法利用衣霉素诱导DU-145细胞产生内质网应激,Western Blot法检测内质网应激相关分子Grp78、Grp94、p-eIF2α和CHOP及自噬蛋白LC3Ⅱ、Atg5和Beclin1的表达;用流式细胞术检测细胞凋亡水平;沉默CHOP基因,用Western Blot法检测凋亡蛋白PARP、Caspase3的表达,流式细胞术检测细胞凋亡;并利用免疫荧光检测自噬标志性蛋白LC3B的表达。 结果衣霉素诱导DU-145细胞内质网应激能诱导一定程度的细胞凋亡,衣霉素处理8、12、24?h的细胞凋亡率分别为3.27﹪±1.02﹪,8.97﹪±0.71﹪和11.67﹪±1.41﹪,处理12?h及24?h的细胞凋亡率与对照组相比差异具有统计学意义（P < 0.01）。同时也能通过抑制PI3K/AKt/mTOR信号通路激活DU-145细胞自噬。CHOP基因沉默抑制细胞凋亡,shCtrl组细胞凋亡率为32.17﹪±3.93﹪,shCHOP-1组细胞凋亡率为23.53﹪±3.41﹪,两组相比差异具有统计学意义（P < 0.05）。且CHOP基因沉默能促进细胞自噬分子LC3B的表达。 结论衣霉素诱导DU-145细胞内质网应激状态下,CHOP在细胞凋亡与自噬之间发挥双重调控作用。     

镉诱导细胞自噬的研究进展

镉是一种有毒的重金属,其对环境和人类的健康造成巨大危害。越来越多的证据表明镉对多个器官和系统造成损害,甚至引起癌变和肿瘤。自噬是进化上保守的,利用溶酶体途径降解细胞内蛋白质和细胞器的过程。一方面,自噬通过清除受损的细胞器保护细胞免受镉损伤;而当细胞受到的损伤不可逆时,自噬作为一种死亡机制导致细胞死亡。自噬在镉引起的细胞损伤中的作用目前仍有争议,可能是镉的剂量和暴露时间的不同造成了自噬在损伤中的作用不同。目前对自噬在其中的作用机理研究,主要集中在m TOR,Ca2+,Beclin-1等信号分子。对镉与自噬分子机理的研究,可以为治疗和预防镉中毒提供新思路。综述了自噬在镉致细胞毒性中的作用,以及镉诱导细胞自噬的信号调节通路。     

MiR-147a通过抑制细胞自噬促进HIF-1α蛋白的积累

目的:HIF-1α是由低氧诱导表达的一个重要的调节肿瘤生长、代谢的转录因子,它的降解除了通过泛素-蛋白酶体途径降解之外还与可以通过细胞自噬途径降解。通过研究miR-147a对细胞自噬的影响从而进一步研究miR-147a对HIF-1α降解的影响。方法:在HeLa细胞中过表达miR-147a,用Western blot和Q-PCR检测细胞自噬相关的标志物LC3B、P62、LAMP-2A的变化。再通过溶酶体-自噬泡共定位实验共聚焦显微镜观察自噬泡的数量以及共定位情况。最后通过加入自噬诱导剂(EBSS)和自噬抑制剂(Bafilomycin A1),用Western blot检测转染NC与miR-147a后HIF-1α蛋白的表达情况。结果:过表达miR-147a后自噬相关的标志物LC3B、P62表达量上升,LAMP-2A表达量下降,且溶酶体与自噬泡的共定位增多;加入自噬诱导剂和自噬抑制剂后HIF-1α蛋白的表达量增加。结果表明miR-147a可以抑制细胞自噬的巨自噬途径以及分子伴侣介导的自噬途径,积累HIF-1α蛋白。结论:miR-147a通过抑制细胞自噬从而减少HIF-1α蛋白的降解,但是miR-147a作用靶点的分子机制需要进一步研究。     

ASPP2过表达可增强DRAM介导的自噬对HepG2细胞的促调亡作用

p53凋亡刺激蛋白2（apoptosis stimulating protein 2 of p53, ASPP2）能特异性地与p53蛋白结合并增强其促凋亡功能,进而发挥抗肿瘤作用.最近文献提示,自噬对肿瘤发生、发展及肿瘤细胞对抗肿瘤药物的反应都具有重要作用.在本研究中,甲基磺酸(MMS)处理HepG2细胞24 h后,用calcein AM/PI和M30染色检测细胞凋亡,可引起早期（M30免疫组化阳性）和晚期细胞凋亡（PI染色阳性）. 给HepG2细胞转染GFP-LC3质粒后,发现MMS处理24 h可引起自噬的发生. ASPP2腺病毒（rAd-ASPP2）感染HepG2细胞引起ASPP2过表达后,再用MMS处理24 h,能引起更明显的早期、晚期细胞凋亡和自噬. 荧光定量PCR检测发现,rAd-ASPP2诱导了更高的BCL-2相关X蛋白基因（BAX）和p53蛋白的目的基因p53诱导的自噬调节蛋白（p53-induced modulator of autophagy,DRAM）的表达. 但仅用rAd-ASPP2处理HepG2细胞不能引起自噬和凋亡.利用2条DRAM特异性的siRNA下调DRAM的表达,发现rAd-ASPP2引起的自噬被完全抑制, 早期和晚期凋亡均部分被抑制,同时BAX 的mRNA水平也明显下降. 以上结果说明,ASPP2可通过上调BAX和DRAM基因的转录而促进MMS引起的HepG2细胞凋亡; 另外,DRAM介导的自噬是ASPP2促进MMS引起的肿瘤细胞凋亡的机制之一. 该研究可为肝癌的基因治疗提供新的思路.     

ASPP2以p53非依赖形式促进自噬引起Hep3B细胞凋亡

p53凋亡刺激蛋白2（apoptosis stimulating protein 2 of p53, ASPP2）能特异性地与p53蛋白结合并增强其促凋亡的功能,进而发挥抗肿瘤作用. 本室前期研究发现,ASPP2可以通过p53-DRAM自噬途径诱导细胞凋亡. 在本研究中,利用ASPP2 腺病毒感染Hep3B细胞(p53缺陷型肝癌细胞系)并用甲基磺酸(MMS)处理后; Calcein AM/PI和M30染色检测细胞凋亡;GFP-LC3质粒转染细胞后检测自噬; 荧光定量PCR和免疫印迹检测自噬基因表达. 结果表明,ASPP2在p53缺陷的Hep3B细胞内可诱导发生凋亡;在MMS存在和缺失条件下, Adr-ASPP2均引起自噬体水平升高及自噬基因的表达增 加,且MMS协同Adr-ASPP2能使自噬水平增加; 进一步用VPS34 siRNA和DRAM siRNA抑 制自噬发现,细胞凋亡水平下降, 说明由Adr-ASPP2诱发经损伤相关自噬调节蛋白（ DRAM）介导的自噬参与了肝癌细胞系凋亡的发生. 综上结果表明,ASPP2可以通过非p53依赖的DRAM介导自噬,并促进肝癌细胞凋亡. 该研究可为肝癌的基因治疗提供新的思路.     

几个能量代谢相关蛋白在HeLa细胞自噬过程中表达下调

自噬是真核细胞中的一种保守的代谢信号通路。人们已经知道自噬与肿瘤发生等疾病密切相关,但对于自噬的分子机制仍然不是很清楚。鉴定更多的自噬相关蛋白对于进一步阐明自噬的分子机制具有重要意义。该研究使用饥饿法处理HeLa细胞,通过电镜观察以及检测自噬标记蛋白LC3-I的转换,证实HeLa细胞发生了明显的自噬。之后,使用双向电泳结合串联质谱分析鉴定细胞自噬时发生变化的蛋白质。结果发现果糖二磷酸醛缩酶A、GAPDH和ATP合成酶O亚基的量在HeLa细胞发生自噬后明显降低。实时定量PCR结果证明饥饿诱导后,这三种蛋白的mRNA水平都发生了明显的下降。使用自噬抑制剂3-Methyladenine预处理HeLa细胞后再行饥饿,三种蛋白mRNA的表达水平与正常细胞相当而明显高于饥饿诱导的细胞。结果表明这三种蛋白在饥饿诱导的自噬中表达下调,其分子机制还有待进一步研究。     

细胞自噬与肝纤维化

自噬是细胞内一种进化保守的依赖溶酶体的蛋白降解途径,存在于大多数真核细胞中,细胞自噬可以为应激状态(如炎症、肿瘤、毒物等)的细胞提供能量。已有研究表明,肝纤维化的发病机制中涉及肝星状细胞的活化,伴随着细胞内脂质小滴的消耗,当肝细胞经历自噬,溶酶体的胞内基质将下降。研究还发现肝星状细胞的活化过程中伴随着其自噬水平的升高。本文将就自噬在肝纤维化中的作用做一综述。     

PINK1/Parkin介导的线粒体自噬

线粒体自噬（mitochondrial autophagy, or mitophagy）指的是细胞通过自吞噬作用,降解与清除受损线粒体或者多余线粒体,其对整个线粒体网络的功能完整性和细胞存活具有重要作用。线粒体自噬过程受多种途径调控,PINK1/Parkin通路是其中的一条,其异常与多种疾病的发生密切相关,如心血管疾病、肿瘤和帕金森病等。在去极化线粒体中,磷酸酶及张力蛋白同源物(PTEN)诱导的激酶1（PTEN-induced kinase 1,PINK1）作为受损线粒体的分子传感器,触发线粒体自噬的起始信号,并将Parkin募集至线粒体;Parkin作为线粒体自噬信号的“增强子”,通过对线粒体蛋白质进一步泛素化介导自噬信号的扩大;去泛素化酶和PTEN-long蛋白参与调控该过程,并对维持线粒体稳态具有重要作用。本文主要对PINK1与Parkin蛋白质的分子结构和其介导线粒体自噬发生的分子机制,以及参与调控该途径的关键蛋白质进行综述,为进一步研究以线粒体自噬缺陷为特征的疾病治疗提供理论基础。     

Bel-7402细胞通过自噬逃避FAS/ActD诱导的凋亡

为了探究FAS抗体与放线菌素D（actinomycin D,ActD）诱导肝癌细胞Bel-7402凋亡的作用机制,通过自噬阻断剂3-MA的作用,来探讨自噬与凋亡的关系.利用电子显微镜和流式细胞仪观察细胞自噬及凋亡.结果表明,FAS/ActD在诱导细胞凋亡的同时伴有细胞自噬现象,在3-MA作用下,FAS/ActD所诱导的细胞自噬体减少,而凋亡现象严重.并且通过流式细胞仪分析表明,3-MA明显增高FAS/ActD所诱导的细胞凋亡率. Western印迹分析进一步显示,FAS/ActD能引起caspase-3激活产生断裂,同时刺激LC3和BECN1表达,而3-MA作用后自噬体减少,同时LC3和BECN1表达降低,但是caspase-3断裂带表达明显增加.以上结果提示,FAS/ActD诱导的Bel-7402细胞凋亡的同时伴有细胞自噬,Bel-7402细胞通过自噬逃避FAS/ActD诱导的凋亡.