TNNT3~（R69H）突变转基因小鼠模型的建立

目的建立TNNT3（R69H）突变转基因小鼠模型。方法构建pEGFP-TNNT3（R69H）转基因构件,通过原核显微注射方法将线性化、纯化后的外源质粒pEGFP-TNNT3（R69H）注射入BDF1小鼠受精卵中,胚胎移植至同期发情的假孕受体母鼠输卵管内,获得子代小鼠。用PCR和Southern blot方法检测子代鼠尾基因组DNA,通过RT-PCR及Western blot的方法检测TNNT3基因表达。结果 8只假孕小鼠共移植注射后的胚胎82枚,出生40只子代鼠,经PCR和Southern方法检测得到5只转基因阳性小鼠。对其子代小鼠进行RT-PCR、Western blot检测结果显示,TNNT3在转基因小鼠心脏和骨骼肌中表达量明显增多。结论通过显微注射法使外源基因pEGFP-TNNT3（R69H）在小鼠基因组中整合,成功建立了TNNT3（R69H）突变转基因小鼠模型。     

绿色荧光蛋白转基因小鼠模型的建立及胚胎冷冻保种

目的建立绿色荧光蛋白转基因小鼠模型,并采取胚胎冷冻的方法进行保种。方法通过原核显微注射法,把线性化、纯化后的外源基因pEGFP注射入BDF1小鼠受精卵中,胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠,获得子代小鼠。经鉴定对有表达的转基因鼠进行胚胎冷冻保种。结果移植注射胚胎385枚给30只假孕小鼠共出生了306只后代鼠,经PCR和southern blot检测得到5只阳性小鼠。F2代转基因鼠胚胎冷冻240枚胚胎。结论通过显微注射法使外源基因pEGFP在小鼠基因组中得到整合,建立了转pEGFP的转基因小鼠模型。     

慢病毒载体介导IκB激酶-α(IKKα)基因RNA干扰转基因小鼠的制备

IκB激酶-α(IKKα)的功能与淋巴形成和乳腺发育相关,在乳腺肿瘤中观察到IKKα蛋白的过量表达.应用小鼠受精卵卵周隙注射慢病毒载体的方式,建立IKKα基因RNAi转基因小鼠模型,为在体内研究IKKα基因的生物学功能及其与肿瘤发生的关系创造条件.实验构建了针对IKKα基因RNAi(剔降)的慢病毒载体,并将载体导入小鼠受精卵卵周隙,获得携带该载体的转基因小鼠模型,经PCR鉴定首建鼠阳性率为15%.转基因小鼠外周血细胞IKKαmRNA表达量明显降低.初步表型观察分析,IKKα基因RNAi小鼠发育正常,进一步的分析工作正在进行中.     

钙蛋白酶抑制蛋白转基因小鼠的构建和鉴定

目的：将人的钙蛋白酶抑制蛋白（ calpastatin, CAST）外源基因整合到C57BL/6J小鼠中,构建高表达CAST的转基因小鼠模型。方法利用Gateway技术构建pRP．EX3d-EF1A-CAST-IRES-eGFP载体,回收片段后通过显微注射法将目的基因片段注入到C57 BL/6 J小鼠受精卵中,将其胚胎移植至同期发情的假孕受体母鼠输卵管内获得子代小鼠。采用PCR方法鉴定出阳性的转基因小鼠,确定首建鼠,通过与C57BL/6J小鼠回交后互交数代建系。利用RT-PCR和Western blotting方法检测CAST基因和蛋白在各组织中的表达情况。结果将90枚注射受精卵移植到3只假孕鼠中,3只均怀孕,移植成功率100％,产下23只子鼠,经PCR鉴定得到2只转基因阳性首建鼠,阳性率为9％。子代小鼠进行RT-PCR检查显示,CAST基因在转基因小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑和骨骼肌中均有表达;Western blotting检查显示,CAST蛋白表达在转基因小鼠中显著高于同窝阴性小鼠。结论通过显微注射法成功构建CAST高表达的转基因小鼠,为进一步研究CAST奠定了良好的模型基础。     

肝组织特异表达人核受体nr5a2转基因小鼠的构建

人乙肝病毒增强子ⅡB1结合因子（hB1F）系Ftz—F1（NR5A）亚家族的新成员。经基因重组法将人hb1 fcDNA置于小鼠白蛋白增慢子／启动子序列下游构建成肝特异重组载体,通过原核显微注射将该载体导入小鼠受精卵原核,经注射且状态良好的卯回输至假孕母鼠输卯管。产下仔鼠经PCR和Southern blotting鉴定,同时RT—PCR和Western blotting分析转基因的表达。阳性Founder鼠与正常C57鼠交配以建立转基因纯系小鼠,F1代以PCR法鉴定。结果共获得4只PCR鉴定转基因阳性Founder鼠,其中一只同时经Southern blotting鉴定为阳性。RT—PCR和Western blotting结果显示,外源基因在转基因小鼠的肝组织成功表达。遗传学分析表明,转基因已整合入小鼠基因组并可稳定溃传。     

慢病毒载体介导的转人ahsp基因的β654地中海贫血小鼠的制备

目的：经慢病毒载体介导,制备转人α血红蛋白稳定蛋白基因（ahsp）的β654地中海贫血小鼠。方法：用巢式PCR从人血DNA中获得人ahsp基因,构建含有人ahsp基因的慢病毒载体,制备假病毒,通过卵周隙显微注射手段将其导入β654地贫小鼠的受精卵,经移植至假孕母鼠输卵管,最终孕育出转人ahsp基因的β654地贫小鼠;分析小鼠体内外源ahsp基因的表达情况及其遗传稳定性。结果：共获得了8只人ahsp阳性小鼠,转基因阳性率为32%（8/25）,其中3只同时具有β654突变基因;人ahsp基因在小鼠体内的表达水平维持在小鼠自身ahsp表达量的1%左右,且可稳定遗传至子代。结论：制备了转人ahsp基因小鼠,并可遗传至子代,为在个体水平上研究α血红蛋白稳定蛋白与β地贫之间的关系提供了工具。     

TNNI2突变转基因小鼠模型的建立

目的建立TNNI2突变转基因小鼠模型。方法构建pEGFP-tnni2转基因构件,TNNI2基因的第175个氨基酸缺失,通过原核显微注射法。把线性化、纯化后的外源基因pEGFP-tnni2注射入BDF1小鼠受精卵中。胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠,获得子代小鼠。用PCR和Southern方法检测子代鼠尾DNA鉴定基因型。通过RT-PCR方法检测tnni2基因表达。结果移植注射胚胎115枚给4只假孕小鼠共出生了23只后代鼠。经PCR和Southern方法检测得到4只阳性小鼠。对其子代进行RT-PCR检测,tnni2基因在肌肉、心脏内表达。结论通过显微注射法使外源基因pEGFP-tnni2（TNNI2基因的第175个氨基酸缺失）在小鼠基因组中得到整合,建立了转pEGFP-tnni2的转基因小鼠模型。     

Dicer1转基因小鼠模型的建立

目的建立Dicer1转基因小鼠模型。方法构建pcDNA3.1-Dicer1转基因构件,经酶切、纯化后通过显微注射方法导入BDF1小鼠受精卵原核并移植到同期受孕的ICR受体母鼠输卵管内。出生后仔鼠用PCR和Southern方法检测鼠尾DNA鉴定基因型,通过免疫组化检测Dicer1基因表达。结果显微注射172枚卵,移植119枚卵于3只受体输卵管中,2只怀孕,共产仔15只,经PCR检测获得6只阳性鼠,Southern检测6只均为阳性。对Southern检测阳性转基因小鼠子代进行RT-PCR检测和免疫组化分析证明Dicer1基因在肝脏、肾脏、肺内均有表达。对腹腔肿胀的转基因阳性1号鼠解剖发现肝脏、脾脏明显增大,胚胎发育异常。结论成功建立Dicer1基因表达的转基因小鼠模型,该模型为进一步研究DICER1基因功能及miRNA的表达及功能等奠定基础。     

肾素－Ⅱ转基因的初步研究

将注射２４ｋｂ小鼠肾素－２（Ｒｅｎ－２）基因的４２５枚受精卵再植于２２只假孕大鼠输卵管内（每只约２０枚）。怀孕的１６只母鼠共生得子代鼠９７只,用ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交技术对存活的６０只子代鼠进行鉴定,发现有两只大鼠携带Ｒｅｎ－２基因。此两只转基因大鼠整合外源基因的拷贝数约为１～２个,血压均未见升高。     

绿色荧光蛋白基因在转基因小鼠体内的表达

建立绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠,继而传代建系。采用显微注射法,将GFP基因注入FVB／NJ小鼠受精卵原核内,获得子代鼠。分娩后3周剪取仔鼠尾,提取基因组DNA,应用PCR、Southern印迹技术进行整合检测。结共用雌性小鼠200只,注射受精卵1586枚,移植卵数386枚,受体鼠32只,怀孕鼠4只,子代鼠18只,有4只为阳性：取2只首建鼠的胚胎,在荧光显微镜下观察GFP表达明显,表明初步获得了转绿色荧光蛋白基因小鼠,     

增强子驱动的Cre转基因小鼠的构建及Cre基因的表达鉴定

目的:探索将增强子应用于构建Cre转基因小鼠品系,为以条件基因敲除为基础的基因功能研究提供更多的工具。方法:通过PCR方法从小鼠的细菌人工染色体扩增UH增强子片段,构建含有Hsp68基础启动子、增强子UH、Cre重组酶基因和SV40 polyA的转基因载体pLW400,将3.3 kb的转基因片段通过显微注射导入小鼠受精卵;为了检测Cre在转基因小鼠中的表达,将转基因一代小鼠与纯合子ROSA26报告小鼠(R/R)交配,收集第14 d胚胎期(E14)的舌组织进行LacZ染色检测鉴定。结果:经鉴定,31只子代小鼠中有6只携带外源基因,整合率为19.4%;与R/+对照相比,E14期的双基因型Cre,R/+舌组织为阳性结果(蓝色)。这表明Cre基因在转基因小鼠舌组织内得到表达,并在体内介导ROSA26基因座loxP位点间的重组,且有效删除了2个loxP之间的片段,从而启动了LacZ基因的表达。结论:构建了UH增强子-Hsp68Cre的转基因小鼠,在舌肌中特异表达Cre基因,提示增强子可以被选择应用于Cre转基因小鼠的构建;为舌肌的发育和再生研究奠定了基础。     

携带HLA-B2704基因转基因小鼠技术的建立

应用显微注射法制备携带HLA B2 70 4基因的转基因小鼠 .对 2 86只昆明小鼠激素注射进行超排卵 ,采集受精卵 ,将含HLA B2 70 4基因的基因组DNA片段 (简称HLA B2 70 4DNA)显微注射到受精卵原核内 ,把注射存活的两细胞期受精卵移入假孕鼠的输卵管内使其发育产生后代 .用PCR方法进行F0代仔鼠及F1代仔鼠的转基因整合的检测 .利用RT PCR检测阳性鼠中的HLA B2 70 4转基因的表达 .采集了 84 11个卵 ,可注射卵 6 6 0 9个 ,其中注射存活的两细胞期受精卵 4 2 77个 ,卵的注射存活率为 6 4 7%.将卵移入 15 3只假孕鼠 ,其中 2 6只怀孕产仔 ,存活 10 1只 .在 10只F0代仔鼠基因组中有HLA B2 70 4基因整合 ,整合率为 9 9%.转基因阳性鼠F0代之间以及与正常鼠之间进行交配 ,产生的F1代仔鼠 78只 ,其中 15只为阳性 .阳性鼠的皮肤、结肠、睾丸和脾脏组织中均有HLA B2 70 4转基因mRNA的表达 .在HLA B2 70 4转基因阳性小鼠中 ,6只小鼠皮肤出现脱毛 ,1只小鼠的足部及足趾明显红肿 ,2只在脱毛同时明显畏光 ,1只出现腹泻 .结果表明 ,成功地建立了HLA B2 70 4的转基因小鼠技术 ,该小鼠类似强直性脊柱炎的小鼠模型 .     

激肽释放酶转基因大鼠模型的建立

目的建立KLK1转基因大鼠模型。方法腹腔注射PMSG-HCG（150-150IU/kg）超排不同周龄（4-8周）SD大鼠比较超排效果的差异,以可用于注射胚胎数作为评判标准确定最佳超排周龄。构建pBC-klk1转基因构件,经酶切、纯化后通过显微注射方法导入SD大鼠受精卵原核并移植到同期受孕的SD受体母鼠输卵管内。出生后仔鼠用PCR和Southern方法检测鼠尾DNA鉴定基因型,通过RT-PCR和免疫组化方法检测klk1基因表达。结果4-8周SD大鼠超排后分别获得受精卵14±14.8、30±15.2、13.3±13.7、13±14.7、8±5.7,5周龄大鼠超排效果最好,与其他周龄大鼠相比有显差异,P〈0.05;显微注射1538枚卵,移植685（44.53%）枚卵于31只受体输卵管中,12（12/31,38.7%）只怀孕,共产仔62只,经PCR检测获得6只阳性鼠,Southern检测3只阳性。对Southern检测阳性转基因大鼠子代进行RT-PCR检测和免疫组化分析证明klk1基因在肾脏、胰腺和乳腺内表达。结论成功建立klk1基因表达的转基因大鼠模型,该模型是高血压病研究的理想动物模型。     

Advances in transgenic rat production

Predictable and reproducible production of transgenic rats from a standardized input of egg donors and egg recipients is essential for routine rat model production. In the course of establishing a transgenic rat service, transgenic founders were produced from three transgenes in outbred Sprague-Dawley (SD) rats and four transgenes in inbred Fischer 344 (F344) rats. Key parameters that affect transgenesis efficiency were assessed, including superovulation treatments, methods to prepare pseudopregnant recipients, and microinjection technique. Five superovulation regimens were compared and treatment with 20 IU PMSG and 30 IU HCG was selected for routine use. Four methods to prepare pseudopregnant egg recipients were compared and estrus synchronization with LHRHa and mating to vasectomized males was selected as most effective. More than 80% of eggs survived microinjection when modified pronuclear microinjection needles and DNA buffers were used. The efficiencies of transgenic production in rats and C57BL/6J (B6J) mice were compared to provide a context for assessing the difficulty of transgenic rat production. Compared to B6J mice, SD rat transgenesis required fewer egg donors per founder, fewer pseudopregnant egg recipients per founder, and produced more founders per eggs microinjected. Similar numbers of injection days were required to produce founders. These results suggest that SD rat transgenesis can be more efficient than B6J mouse transgenesis with the appropriate technical refinements. Advances in transgenic rat production have the potential to increase access to rat models.     

Rapid generation of dendritic cell specific transgenic mice by lentiviral vectors

Dendritic cell (DC) specific transgenic mice are a most important model for investigating dendritic cell functions in vivo. Recently, lentivirus mediated gene transfer has become a powerful and convenient method for generation of transgenic mice. We cloned a 1.2 kb CD11c promoter and constructed a lentiviral vector, which efficiently drove DC-specific expression in vitro. After microinjection of purified virus into the perivitelline space of single-cell embryo, more than 80% newborn mice were transgenic and 7 F0 founders were rapidly generated in 2 months. GFP was strictly expressed in CD11c+ cells in spleens, thymus and lymph nodes of the transgenic mice. Importantly, the physiological characteristics and functions of DCs in the transgenic mice were not altered by the specific expression. These results indicate that this vector could be used to rapidly prepare DC-specific transgenic mice. Thus, this lentiviral vector system may provide a convenient and useful tool to study the properties of DCs in vivo.     

庚型肝炎病毒转基因小鼠的建立

利用受精卵原核显微注射的方法,产生了含有ＨＧＶ结构蛋白Ｃ、Ｅ１、Ｅ２及部分非结构蛋白ＮＳ２、ＮＳ３的转基因小鼠。得到１０只ｆｏｕｍｄｅｒ小鼠,其中有３只ｆｏｕｎｄｅｒ小鼠与正常小鼠交配后得到了整合有外源基因的Ｆ１代阳性小鼠。ＲＴ－ＰＣＲ的结果显示,外源基因可在ｆｏｕｎｄｅｒ小鼠及Ｆ１代小鼠的血液有核细胞及肝细胞内转录;组织病理学检查显示,某些转基因小鼠的肝细胞出现了水样变、脂肪变性及轻微炎性反应等     

人尿激酶原乳腺定位转基因小鼠的建立

应用大鼠β乳酪蛋白基因的上游调控序列和人尿激酶原ｃＤＮＡ构建成功了乳腺定位表达载体．用显微注射的手段导入到受精卵的雄前核,从注射的３００枚受精卵中,１４０枚被移植到９只假孕的受体小鼠．结果从获得的子一代小鼠中,经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实,有３只转基因阳性的小鼠．