欧洲专利局批准第一例植物技术专利

欧洲专利局(西德、慕尼黑)批准了一项有关植物的专利,这在欧洲看来还是第一例。这项专利将批给高级农业遗传科学公司(Agrigenetic Advanced Science Co.)。这项专利是使一个联接在一个植物启动子后面的植物基因在一种 T-DNA 转化系统中表达,专利包括了有关的载体、转化方法和植物材料。至今,欧洲专利协定(European Patent Convention)是否许可关于动植物的专利还未确定。但这项专利的批准为其它一些通过基因工程创造的新型动植物的专利许可开辟了道路。决定批准这项专利的关键论据是“由一种可以取得专利的技术产生的产品亦受该项专     

GFAP启动子调控的双顺反子真核表达载体pGFAP-IRES2-EGFP-p27的构建及表达分析

目的构建并鉴定带GFAP启动子的Flag-p27和EGFP双顺反子真核表达载体,观察其表达。方法利用IRES和GFAP启动子,通过质粒抽提、琼脂糖凝胶电泳、酶切、连接、转化等多种基因工程技术,经多步亚克隆后完成能同时表达p27和EGFP基因的星形胶质细胞特异性真核表达载体pGFAP-IRES2-EGFP-p27。转染体外培养的星形胶质细胞,观察EGFP的表达,并通过免疫荧光细胞化学技术观察p27的表达。结果经酶切鉴定和测序鉴定,成功构建真核表达载体pGFAP-IRES2-EGFP-p27。转染星形胶质细胞后可见EGFP的表达,并且在EGFP阳性的细胞中P27表达水平明显增高。结论GFAP启动子能启动目的基因p27和EGFP在星形胶质细胞的表达,连于Flag-p27的下游EGFP可作为报告基因,指示p27的表达情况。带启动子GFAP的Flag-p27和EGFP双顺反子真核表达载体的构建为进一步研究星形胶质细胞增生与神经系统疾病的关系,并为寻找神经系统疾病的有效基因治疗途径奠定基础。     

纳米载体介导的植物遗传转化研究现状和前景

高效遗传转化技术是植物重要性状功能基因鉴定的前提和转基因育种的基础.随着纳米生物技术的发展,以纳米载体介导的植物转基因技术已显示出巨大的应用潜力.综述了国内外应用于植物纳米载体的类型、与外源基因的结合方式以及传输细胞的原理,重点阐述了影响纳米基因载体性能与转化效率的重要因素,以及纳米载体介导外源基因转化植物细胞的方法,...     

精子载体鱼的转化成功

匈牙利农业生物技术中心分子遗传学研究所的Laszio Orban将精子作为载体,基因操作鲤鱼和非洲鲶等获得成功。实验方法是首先将在劳氏肉瘤病毒的启动子上结合氯霉素·乙酰转移酶基因(CAT)的质粒DNA(10μg)与10μg的精子(10~9～10~(10)个/ml)混合,短时培养后给予电击。因此,在1个精子内可导入几千个拷贝的质粒。一旦用这种精子使卵子受精,就会有1～3%的卵子发生性状转化,用孵化的转基因鱼确认CAT基因的存在和CAT蛋白的表达。     

重组家蚕病毒表达系统转移载体的构建和β─半乳糖苷酶的表达

本文从中国农科院蚕业研究所提供的我国家蚕核多角体病毒镇江株中获得了多角体蛋白的强启动子,用此启动子构建了家蚕病毒表达系统的转移载体。外源基因能在此启动子控制下在家蚕细胞和虫体中进行高效表达。用此载体我们首先成功地在家蚕虫体中高效表达了β－半乳糖苷酶,表达量达到５８０μｇ／条蚕,从而证实我们构建的载体是可靠的、有效的,可用于家蚕重组病毒表达外源基因的研究。     

非转座子载体介导的稳定转化家蚕BmN细胞表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子

为了建立非转座子载体介导的持续表达外源基因的转化家蚕BmN细胞系,将家蚕核型多角体病毒极早期基因(ie-1)启动子控制的人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因的表达盒克隆至pIZT/V5-His,获得重组载体pIZT-IE-hGM-CSF,该载体转染家蚕BmN细胞后,通过博莱霉素(Zeocin)筛选获得了稳定转化细胞系IE-hGM-CSF。转基因细胞基因组经PCR鉴定,成功检测到ie-hGM-CSF,Western blotting分析结果显示转化细胞表达的重组hGM-CSF的大小为22kDa,ELISA检测结果显示hGM-CSF在转化细胞系里的表达水平大约为2814.7pg/106个细胞。     

重组家蚕病毒表达系统转移载体的构建和β—半乳糖苷酶的表达

本文从中国农科院蚕业研究所提供的我国家蚕核多角体病毒镇江株中获得了多角体蛋白的强启动子,用此启动子构建了家蚕病毒表达系统的转移载体。外源基因能在此启动了控制下在家蚕细胞和虫体中进行高效表达。用此载体我们首先成功地在家蚕虫体中高效表达了β－半乳糖苷酶,表达量达到５８０μｇ／条蚕,从而证实我们构建的载体是可靠的,有效的,可用于家蚕重组病毒表达外源基因的研究。     

杜氏盐藻两种碳酸酐酶基因启动子的克隆和功能研究

将克隆得到的杜氏盐藻DCA7和CA基因的启动子区与bar基因和NOS polyA终止子片段融合,分别构建成pMDDC-B和pMDC-B转基因杜氏盐藻表达载体。用基因枪法将两种表达载体转化人杜氏盐藻细胞,通过除草剂草丁膦筛选培养获得转化藻株,对转化藻株进行分析。对转化杜氏盐藻藻株的筛选培养结果表明：pMDDC-B和pMDC-B载体中的外源bar基因能在杜氏盐藻细胞中稳定或瞬时表达。同时在氦气压力为690kPa条件下,微弹轰击2次比微弹轰击1次或3次的效果更好。对pMDDC-B转化杜氏盐藻得到的稳定表达的转化藻株进行的PCR和Southern印迹分析的结果表明：外源的bar基因确已整合到杜氏盐藻基因组中。Northern印迹分析表明：DCA7基因启动子驱动bar基因在杜氏盐藻细胞中的表达效率受氯化钠浓度梯度调控。推测首次克隆得到的DCA7基因启动子可能是一种活性高、安全性好的高渗诱导性启动子;杜氏盐藻DCA7和CA基因启动子区的GT高度重复序列,可能与杜氏盐藻高度耐盐的分子机制有关。     

新的单子叶作物高效表达载体

微弹导入系统(包括向细胞中射入覆盖DNA的颗粒)是一种成功的转化手段,却在单子叶植物如禾谷类作物上遇到麻烦,这导致人们研究寻找更加有效的启动子。CaMV(花椰菜花叶病毒组)35S RNA启动子和玉米乙醇脱氢酶启动子已被广泛用于植物转化,但在水稻细胞中效果不佳。Cornell大学由Ray Wu牵头的研究小组报导,用肌动蛋白基因启动子可使转化成功。 Act1肌动蛋白基因启动子在所有水稻细胞中均大量表达。初步实验表明,Act1启动子可促进β-葡糖     

EphA3基因启动子区域定位表达及活性分析

目的构建含有不同长度EphA3基因启动子片段的报告基因载体,研究其在293T细胞和MEF细胞中的转录活性。方法以Balb／C小鼠基因组DNA为模板,扩增不同长度的EphA3基因启动子片段,并克隆进入荧光素酶报告基因质粒pGL3-Basic真核表达载体内。酶切鉴定及基因测序无误后,将重组质粒和pRL—CMV内对照质粒共转染293T和MEF细胞,分析不同长度的OhA3基因启动子片段的转录活性。结果酶切和测序鉴定表明表达载体构建成功,EphA3基因的核心启动子区域位于-279bp～＋110bp之间,在293T细胞和MEF细胞中其转录活性相似。结论成功构建了荧光素报告基因重组质粒,并确定了BphA3基因的核心启动子区域。     

基因工程

将启动子和结构基因插入质粒,构成表达载体,用之转化受体菌,如大肠杆菌,从而使干扰素得到大规模生产。用仙台病毒诱导BALL一1细胞后,从这些细胞中制备出两种a一干扰素。这两种干扰素也可以从克隆的质粒载体转化     

将双元载体的使用权转让给Calgene公司

荷兰的植物生物技术企业MOGEN International公司将植物基因重组的双元载体使用权转让给美国Calgene公司。荷兰Leiden大学教授Robert Sohilperoort研究室开发了这个系统,MOGEN公司获得独占使用权。据该公司宣称,这个系统的专利最近在美国得到认可,10月23日获得欧洲专利。据说也向日本提出申请。广泛用于植物特别是双子叶植物基因重组的Ti质粒是巨大的质粒,在编入有用基因时费时。因此,把编入有用基因的部位和向植物细胞导入有用基因所必需的部位分为2个的系统是双元载体(binary vec-     

外源基因的靶向细胞表达

使外源基因在特定组织细胞中进行表达主要采用两方：一是使用靶向基因载体，这种载体可识别特定组织细胞膜上的一些分子，并与之结合，然后再将外源基因带入细胞中表达；另一种方式是使用组织细胞专一的启动子，来驱动外源基因在该细胞中的特异性表达。     

嗜酸氧化亚铁硫杆菌启动子探针载体的构建

目的：为了研究嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans）启动子结构与功能。方法：以pSV-β-galactosidase质粒为骨架,通过定点突变的方法引入一个新的BstBⅠ单酶切位点,构建能在大肠杆菌（Escherichia coli）中正常复制的启动子探针载体。利用PCR的方法将A.ferrooxidans菌cycA2基因上游5＇段上游DNA片段克隆到探针载体β-半乳糖苷酶基因上游以替代其原有启动子（gpt启动子）,并将重组的质粒转化E.coliDH5α菌株。通过检测宿主细胞的β-半乳糖苷酶活性,来鉴定启动子片段,并分析了启动子探针质粒载体的功能及启动子的强度。结果：pSV-β-galactosidase质粒被正确突变,成功构建了启动子探针载体pSVB。来源于A. ferrooxidans菌的启动子片段可驱动β-半乳糖苷酶基因在E.coli细胞中表达,转化子酶活性约为gpt 启动子驱动下活性的70 %。结论：启动子探针载体（pSVB）可用于A. ferrooxidans菌或者其它原核生物启动子的分离及进一步的分析研究。酶活性分析结果表明,来源于A. ferrooxidans菌cycA2基因上游5＇段上游DNA片段具有显著启动子活性。     

兰花的基因操作技术

美国洛克菲勒大学植物分子生物学研究所教授Nam-Hai Chua等培育出转基因兰花,这在世界上尚属首例.在京都召开的日本农艺化学会的特别讲演中公布了这项成果.在兰花中导入荧光素酶基因作为标记,用光检测装置确认了表达.启动子使用了花菜花叶病毒35S. 同时在新加坡的一家研究所任职的Chua与Wang G.Y.共同开发在体外培养兰花的技术.150天后90%的植株开花.常规培育的兰花从出苗到开花需要几个月～3年的时间.用生物技术培育的兰花大幅度缩短了开花时间.     

用绿色荧光蛋白和洋葱表皮细胞检测拟南芥rd29A基因启动子活性的方法

将rd29A基因的启动子与绿色荧光蛋白基因(GFP)融合在一起,构建成植物表达载体,并以CaMV35S启动子驱动的GFP基因的植物表达载体为对照,用基因枪介导法转化置于4种类型培养基上的洋葱表皮细胞.对其进行不同温度下的培养,16 h后观察GFP基因瞬时表达水平的结果表明,rd29A启动子对高盐和脱水逆境的响应较温度显著,特别是在含PEG6000的培养基上,细胞无破损,绿色荧光强烈,适合于GFP的瞬时表达.而高盐由于易导致细胞出现离子毒害,不宜作为GFP瞬时表达的培养基.     

胰蛋白酶抑制剂KSTI3基因新型真核表达载体的构建及其在盐藻中的表达

应用PCR技术扩增Nos基因、 CaMV35S 启动子片段和氯霉素抗性基因 Cat ,并与胰蛋白酶抑制剂 KSTI3 基因连接,构建真核表达载体pMDCKN-Cat。DNA序列分析结果表明:表达载体中的胰蛋白酶抑制剂 KSTI3 基因、启动子 CaMV35S 、终止子 Nos 和氯霉素抗性基因 Cat 与已知序列完全一致。采用LiAc/PEG介导法将质粒pMDCKN-Cat转化至盐藻细胞中,通过氯霉素抗性基因筛选和PCR鉴定获得转基因盐藻细胞。经Western blotting检测,在硝酸纤维素膜上出现清晰的条带,分子量为20.1kDa,证明胰蛋白酶抑制剂 KSTI3 基因在盐藻中得到成功表达。     

从水稻细胞质型果糖—1，6—二磷酸酶启动子上游中去除93bp可以彻底改变其表达模式

细胞质型果糖_1,6_二磷酸基因ATG上游 1195bp侧翼序列可调控GUS基因在水稻 (OryzasativaL .)中特异性表达 ,因此该片段包含有使报告基因在叶肉细胞中特异性表达的所有顺式元件。为了研究其调控特异表达的顺式元件 ,对启动子 5′端进行了一系列的缺失 ,得到 4种与GUS基因融合的植物表达载体 ,通过基因枪法转入水稻。结果表明 ,自启动子 5′端 - 1195bp缺失至 - 110 2bp时 ,GUS基因由叶肉细胞特异性表达变为组成型表达 ,且表达活性有所提高 ,推测在该区段中存在调控叶肉细胞特异性表达的顺式元件。进一步缺失仍然保持组成性表达的模式 ,即在转化株的根、茎和叶中的所有细胞中均有表达 ,同时启动子活性有所提高。这一结果暗示该启动子具有很大的应用潜力。     

gfP基因甘蓝质体表达载体构建及原核表达分析

以甘蓝自交系‘03097’为试材,PCR扩增并克隆了甘蓝质体的trnI-trnA基因区段,利用该基因区段作为定点整合外源基因的同源重组片段,构建了甘蓝质体定点转化载体,并进行了原核表达分析。结果表明,所扩增的基因区段大小为2.7 kb。进行序列分析后,经酶切、连接和转化,构建成含Prrn-gfp-aadA-TpsbA表达盒的质体表达载体,酶切鉴定表明,所构建载体符合预期设计;gfp基因能够在质体特异性启动子Prrn及终止子TpsbA的调控下高水平表达,表达量约占总可溶性蛋白的41.0%,包涵体占菌体蛋白的38.0%。该载体的构建为后期甘蓝质体转化体系的建立和其它功能基因导入甘蓝质体进行性状改良奠定了基础。     

用重组烟草大量生产生长激素

《日经生物技术》2000年3月13日号第12页报道：美国孟山都公司使用基因重组烟草大量生产生长激素。其产量相当于传统技术的300倍以上。详细情况见Nature Biotechnology杂志2000年3月号333页。 进行这项研究的是美国孟山都公司的子公司Agracetus公司。其最大特点是不仅向植物细胞核导入基因,而且还向叶绿体等细胞内小器官染色体中导入基因。 向植物细胞内100多个质体导入基因的技术是Agracetus公司和同样也是美国孟山都公司子公司的美国Calgene公司等共同开发的。该技术可称得上是进行超大量蛋白表达的关键技术。如果质体是来自母亲的,只遗传给下代,就不会通过雄性生殖器官-花粉传播。因此,可以避免花粉扩散,向近缘野生生物导入基因的危险。当然也有希望成为知识产权保护技术。这项成果可以说向实现植物物质生产技术-分子农业迈出了一大步。 据报道,可在叶绿体核蛋白体RNA操纵子和叶绿体表达基因-psbA启动子的下游构建泛琨素(工ビキチン)与生长激素的融合蛋白,然后使用基因枪向同源重组烟草的叶细胞叶绿体中导入基因。用细胞内泛琨素蛋白酶切断融合蛋白可分离出生长激素,叶绿体蛋白蓄积量(即可溶性蛋白)高达7％,而现已有用植物表达激素的例子,但其蓄积量只有O．1％。结果证明,除融合蛋白可用蛋白酶切断并再现生长激素内的2硫键外,还通过培养细胞系确认生长激素蛋白具有细胞增殖活性的蛋白。孙国凤