凡纳滨对虾β-actin基因的克隆与表达

目的:克隆凡纳滨对虾肌动蛋白基因并在原核表达系统中表达.方法:根据GenBank上凡纳滨对虾β-actin基因序列设计引物,采用RT-PCR方法,从凡纳滨对虾肌肉组织中克隆出β-肌动蛋白基因cDNA部分序列,克隆序列连接到pBAD/gⅢA质粒,转化人大肠杆菌TOP10,筛选阳性克隆,进行温度诱导表达重组蛋白.结果:克隆序列长度为1300bp,测序结果与Gene-Bank序列同源性达99.91%;获得重组体诱导表达产物经SDS-PAGE分析,在约48kD处有表达的蛋白带,表达产物经Western Blotting鉴定为阳性.结论:获得β-actin基因在大肠杆菌中稳定表达产物.     

蝇蛆蛋白粉对凡纳滨对虾生长的影响

设计了4种实验饲料(ABCD)并进行了8周饲养试验来评定添加蝇蛆粉对凡纳滨对虾生长性能的影响.以实用饲料D作为对照组,ABC是在D的基础上,分别以5%,10%和15%的蝇蛆粉替代鱼粉.养殖试验结束后,分别计算体长、全长和背甲宽等生长性能.实验结果显示,AB组凡纳滨对虾的生长性能与对照组差异不显著(P>0.05).C组与对照组差异极显著(P<0.01).结果表明,饲料中添加适量的蝇蛆蛋白粉对凡纳滨对虾有一定的促生长作用,可用适量的蝇蛆蛋白粉替代对虾配合饲料中的部分鱼粉.     

凡纳滨对虾TCP-1-eta基因的克隆及与耐寒性状的相关性

为研究凡纳滨对虾耐寒性状的分子机理,文章克隆了凡纳滨对虾的耐寒相关基因TCP-1-eta并对其与耐寒性状的关系进行了研究。首先,根据电子克隆所得序列设计引物,采用RT-PCR方法克隆得到长1 705 bp的TCP-1-eta基因序列,其中包括1 629 bp的完整开放阅读框,编码542个氨基酸残基。然后,运用荧光定量PCR对TCP-1-eta基因进行时空表达谱的分析:(1)组织表达分析结果显示,该基因在凡纳滨对虾肌肉组织中表达量最高;(2)不同低温处理下的表达结果显示,该基因在15℃开始呈上调表达,13℃时表达量最高;(3)13℃低温处理的表达结果显示,该基因在36 h内呈小幅上调表达,但36 h后表达量显著升高,48 h表达量达到0 h的150倍。进一步采用PCR-RFLP方法对216只凡纳滨对虾TCP-1-eta基因进行了SNP多态性检测,并将其与耐寒性状进行了关联分析。在该基因编码区第731碱基上发现C/T突变,方差分析结果表明该位点的不同基因型与耐寒力指标CDH(Cooling-degree hours)值相关(P<0.05),其中CC基因型的耐寒能力比TT基因型强。     

凡纳滨对虾溶菌酶基因在毕赤酵母中的分泌表达和活性检测

原核重组表达的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)溶菌酶蛋白主要以包涵体形式存在, 经变性和复性处理后活性仍较差。研究将凡纳滨对虾溶菌酶基因(Lvlyz基因)克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中, 电击转化毕赤酵母GS115细胞, 经组氨酸营养缺陷培养基筛选和PCR检测获得转化子。对其进行连续甲醇诱导表达, 利用SDS-PAGE和C端携带的6×His标签,对发酵液上清进行Western blot检测, 结果表明19.3 kD左右的条带即是重组表达的溶菌酶蛋白。用溶壁微球菌平板抑菌法鉴定表达产物具有较强的抑菌能力。研究首次利用毕赤酵母真核表达系统实现对虾溶菌酶基因的可溶性表达, 并且表达产物的活性良好。       

凡纳滨对虾卵母细胞卵黄发生的超微结构

利用电镜研究凡纳滨对虾卵母细胞卵黄发生的全过程。结果表明 :凡纳滨对虾卵黄的发生是双源性的。卵黄发生早、中期是内源性卵黄大量合成的阶段 ,卵黄发生中、后期则以外源性卵黄的合成为主。内源性卵黄主要由内质网、线粒体、核糖体、溶酶体、高尔基器等多种胞器活跃参与形成。其中数量众多的囊泡状粗面内质网是形成内源性卵黄粒的最主要的细胞器 ;部分线粒体参与卵黄粒的合成并自身最终演变为卵黄粒 ;丰富的游离核糖体合成了大量致密的蛋白质颗粒并在卵质中直接聚集融合成无膜的卵黄粒 ;溶酶体通过吞噬、消化内含物来形成卵黄粒和脂滴 ,且方式多样 ;高尔基器不直接参与形成卵黄粒。外源性卵黄主要通过卵质膜的微吞饮活动从卵周隙或卵泡细胞中摄取外源物质来形成     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)盐度调控相关基因CLCA1的克隆及表达分析

钙激活氯离子通道调节剂(calcium-activated chloride channel regulator,CLCA)为一类金属蛋白酶依赖家族,在哺乳动物上皮组织杯状细胞的粘液产生和粘液平衡中起重要作用.为了探究CLCA1基因在凡纳滨对虾渗透压中的作用机制,本研究采用RACE技术在凡纳滨对虾中克隆出了CLCA1基因,该基因总长度为3129 bp,5'端非编码区长度为175 bp,3'端非编码区长度为107 bp,开放阅读框ORF长度为2847 bp,共编码984个氨基酸,有1个跨膜区域,膜外有VMA结构域.与其他物种氨基酸序列比对结果显示,凡纳滨对虾CLCA1氨基酸与其他物种相似性都较低,相似度最高的为刀额新对虾(Procambarus clarkii) CLCA2氨基酸序列,为47.83％.RT-qPCR结果显示,CLCA1基因在凡纳滨对虾各组织中均有表达,其中肠道、肝胰腺和鳃中的表达量较高;对不同盐度下凡纳滨对虾4个组织中CLCA1基因的定量结果显示,随着盐度的下降,CLCA1基因的表达量在4个组织中呈下调趋势,表明CLCA1基因与凡纳滨对虾的渗透压调节相关.本研究初步阐明了CLCA1基因的理化性质,对CLCA1基因在凡纳滨对虾体内各组织和不同盐度下各组织的表达定量可为CLCA1基因在今后甲壳动物的渗透压调节及免疫调节的研究提供基础支持.     

维生素C对凡纳滨对虾生长及抗病力的影响

以不同水平维生素C 2 磷酸酯 (添加量分别为 0、75、15 0、30 0和 6 0 0mg/kg)的饲料喂养凡纳滨对虾 10周 ,研究维生素C 2 磷酸酯对凡纳滨对虾生长及抗病力的影响。结果显示 :在养殖前 4周 ,饲料中添加维生素C 2 磷酸酯显著促进凡纳滨对虾的生长 ,然而对对虾的成活以及饲料利用不产生影响 (P >0 0 5 ) ;而到实验后期添加维生素C 2 磷酸酯不能促进凡纳滨对虾的生长 ,却显著提高凡纳滨对虾的成活率 (P <0 0 5 )。维生素C 2 磷酸酯对对虾体水分、脂肪、蛋白质和维生素C在肝胰脏中的积累量的影响显著 (P <0 0 5 ) ,对对虾体灰分影响不显著 (P >0 0 5 )。维生素C 2 磷酸酯对对虾血清中超氧化物歧化酶活力无显著影响 ,饲料中未添加维生素C或过量添加 (超过 30 0mg/kg饲料 )均导致血清中酚氧化酶活力、血细胞总数和溶菌酶活力的显著下降。以生长、成活和酚氧化酶活力为指标 ,饲料中维生素C 2 磷酸酯的适宜添加量为 15 0mg/kg。     

凡纳滨对虾红体病病原

2001年7月辽宁省盘锦市大洼对虾养殖厂凡纳滨对虾大面积暴发红体病。主要表现为全身发红,活动减弱,食欲减退,壳变硬,死亡率高等。本研究从患红体病的凡纳滨对虾肌肉组织中分离到三株优势菌,经回归感染证实其中一株为引发本次凡纳滨对虾红体病的病原菌,编号为0107。对该菌进行了生理生化鉴定和16SrRNA基因序列同源性分析,将其判定为副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)。药敏实验结果显示,该菌对头孢哌酮、头孢曲松等多种抗生素敏感,对氨苄西林、青霉素等抗生素不敏感。     

凡纳滨对虾低温差异表达miRNA的分析鉴定及靶基因的验证

为了解析miRNA及靶基因在凡纳滨对虾低温适应过程中的分子调控机制, 研究开展了凡纳滨对虾常温(28℃)及低温锻炼(16℃, 6d)下肝胰腺小RNA文库的测序和分析。从常温对虾的小RNA文库测序获得18—32 nt的高质量序列10690259条, 鉴定出已知的成熟miRNAs 57条; 而从低温锻炼对虾的小RNA文库获得18—32 nt的高质量序列序列8587144条, 鉴定出已知的成熟miRNAs 48条。分析获得25个在低温锻炼下呈显著差异表达的miRNAs。运用qRT-PCR验证了3条低温下差异极显著的miRNAs的表达模式。结果显示, 3条miRNAs的表达模式与高通量测序结果基本一致。预测低温差异表达miRNAs的靶基因, 并与转录组分析获得的低温显著差异表达基因进行比对, 从二者重合的基因集中挑选出4个基因, 即nuclear export mediator factor Nemf-lik、synapse-associated protein、seleno proteins 以及DEAD-box RNA helicase Variant 1, 运用qRT-PCR验证其在不同条件低温锻炼凡纳滨对虾肝胰腺中的表达规律, 为解析miRNAs及其靶基因在对虾低温适应过程中的分子调控机制提供了基础数据。     

凡纳对虾对虾素基因的克隆与抗菌性质分析

目的:抗菌肽分子在无脊椎动物的先天免疫系统中,发挥着重要的抗菌作用;为了不断完善无脊椎动物先天免疫系统的抗菌机制,作者以凡纳对虾的对虾素基因作为研究对象,进行分子生物学方面研究。方法:以凡纳对虾的对虾素基因———penaeidin 4抗菌肽基因(Lva-pen 4)作为研究对象,主要进行了基因克隆、氨基酸序列比对、系统进化关系分析以及分子结构初步预测等研究内容。结果:Lva-pen 4的cDNA序列全长624bp,开放阅读框包括204bp,演绎67个氨基酸残基;在Lva-pen 4分子一级结构的氨基酸序列中,存在一个对虾素结构域,其中包括8个保守存在的半胱氨酸残基和6个脯氨酸残基。结论:根据分子结构的分析结果,推测Lva-pen 4是一个重要的免疫反应相关基因,在先天免疫系统中发挥着重要作用。     

凡纳滨对虾TCP-1-Beta基因的克隆及其与耐寒性状的相关性

为研究凡纳滨对虾耐寒性状的分子机理,研究克隆了凡纳滨对虾耐寒相关基因TCP-1-Beta并对其与耐寒性状的关系进行了研究.根据电子克隆所得序列设计引物,采用RT-PCR方法克隆得到长1691 bp的凡纳滨对虾TCP-1-Beta基因序列,其中包括1608 bp的完整开放阅读框,编码535个氨基酸残基.然后,运用荧光定量PCR对TCP-1-Beta基因进行时空表达谱的分析:组织表达谱的结果显示,该基因在凡纳滨对虾肝胰腺组织中表达量最高;不同低温处理下的表达结果显示,在28℃和15℃处理下基因表达量无显著变化,13℃开始呈上调表达,11℃时表达量升高;13℃低温处理发现该基因在24h内表达量无显著变化,但36h后表达量显著升高.采用PCR-RFLP方法对216尾凡纳滨对虾TCP-1-Beta基因进行了SNP多态性检测,并将其与耐寒性状进行了关联分析.在该基因编码区第420碱基上发现G/A突变,方差分析结果表明该位点的不同基因型与耐寒力指标CDH值相关(P＜0.05),其中GG基因型的耐寒能力比AA基因型强.     

凡纳滨对虾优势腐败菌鉴定及其群体感应现象

为了鉴定凡纳滨对虾的优势腐败菌并研究其是否存在以N-酰基高丝氨酸内酯类化合物(AHLs)介导的群体感应系统,采用16S rRNA序列鉴定凡纳滨对虾的优势腐败菌,并采用紫色杆菌CV026对优势腐败菌的AHLs活性进行检测.结果发现凡纳滨对虾优势腐败菌菌株1(Aci-1)和菌株2 (Aci-2)均为不动杆菌属,均存在以AHLs为信号分子的群体感应系统.添加外源信号分子AHLs能促进Aci-1菌株生物膜的形成,且呈浓度依赖性.在一定的贮藏范围内,凡纳滨对虾腐败菌信号分子AHLs浓度与细菌总数、挥发性盐基氮含量存在正相关性,其相关系数r分别为0.846 6和0.986 7,分别在P＜0.05与P＜0.01水平上显著,结论是凡纳滨对虾优势腐败菌不动杆菌菌株存在以AHLs介导的群体感应系统,且与凡纳滨对虾的腐败密切相关.     

海水和淡化水养殖凡纳滨对虾饲料蛋白需求量的比较研究

本研究从生长、饲料利用和体成分等指标综合评价饲料蛋白质含量对凡纳滨对虾的影响。研究发现,在海水养殖环境下,饲料蛋白水平对凡纳滨对虾的存活率、增重率、特定生长率、饵料系数、蛋白效率和虾体粗蛋白含量均有显著性影响(p<0.05)。摄食饲料蛋白含量38%的海养凡纳滨对虾有较高的存活率、增重率以及最高的特定生长率。饵料系数随蛋白含量的增加而减小,虾体粗蛋白含量随饲料蛋白水平升高而增加,而蛋白含量38%和41%实验组饵料系数和虾体粗蛋白含量均没有显著性差异(p>0.05)。淡化水养殖条件下,凡纳滨对虾的存活率随饲料蛋白水平的增加而提高,而增重率和特定生长率均在饲料蛋白含量35%实验组最高,饵料系数随蛋白含量的增加先减小后增大,蛋白含量35%实验组饵料系数显著小于其他实验组。海水养殖条件下,凡纳滨对虾的存活率、末体重、增重率、特定生长率和蛋白质效率均高于淡水养殖的对虾。对虾虾体粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量均随盐度升高而升高,而虾体水分随着盐度的升高而降低。     

地衣芽孢杆菌对凡纳滨对虾Toll和HSP70基因表达的影响

目的 分析地衣芽孢杆菌对凡纳滨对虾Toll和HSP70基因表达的影响.方法 根据芽孢杆菌的使用量设置测试1组(LDG,用菌量2.0×103 CFU/mL),测试2组(HDG,用菌量1.0 × 104 CFU/mL)及未使用芽孢杆菌的对照组(CG),每7d施菌1次,实验持续24 d.每6d取样对虾肌肉和肝胰腺检测Toll基因和HSP70基因的mRNA相对表达量.结果 对虾肝胰腺Toll基因mRNA表达量在LDG组和HDG组分别较CG组提高了410.05％和78.31％,但在肌肉中CG组的表达量则分别较LDG组和HDG组提高了31.81％和8.43％.可见,芽孢杆菌在一定程度上可提高Toll基因mRNA在对虾肝胰腺的表达,但对其在肌肉中的表达则呈一定的限制作用.在肝胰腺HSP70基因的mRNA表达量,HDG组显著高于CG组和LDG组(P＜0.05),CG组和LDG组的差异无统计学意义(P＞0.05);在肌肉中LDG组和HDG组的HSP70基因mRNA表达分别较CG组提高了26.07％和26.46％,但实验组的组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 在水体中施用芽孢杆菌104 CFU/mL和2.0×103 CFU/mL可分别提高对虾肝胰腺和肌肉HSP70基因的mRNA表达量.     

不同碳水化合物水平饲料对凡纳滨对虾生长及部分生理生化指标的影响

以等脂肪（7.5%）、饲料碳水化合物水平分别为13.82%、19.41%、25.72%、31.80%及38.2%的5组实验饲料,饲喂凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）（初始体重0.17±0.00g）8周。实验结果表明,最低碳水化合物饲料组成活率最低,其余各组间差异不显著。当饲料碳水化合物从13.82%升高到25.72%,而饲料蛋白从45.86%降低到37.82%时,对虾特定生长率差异不显著（p>0.05）。饲料碳水化合物水平显著影响了对虾血糖、血清蛋白浓度及肠道可溶性蛋白含量（p<0.05）,其含量均为最低碳水化合物饲料组最低,血糖浓度在饲料碳水化合物25.72%时达最高,随饲料碳水化合物的进一步升高其含量保持不变。虾体粗脂肪和能量有随饲料碳水化合物的升高有升高的趋势。以上结果表明：在本实验条件下,饲料中碳水化合物含量为13.82%时不能满足凡纳滨对虾的正常需要,饲料碳水化合物对蛋白质有一定的节约作用。     

凡纳滨对虾7个不同家系遗传差异的微卫星标记分析

应用7对微卫星引物对凡纳滨对虾3个世代共7个家系进行了遗传多样性分析,共检测到20个等位基因,每个位点的等位基因数为2-3个,平均为2.86个,观测杂合度(H0)、期望杂合度(H0)、多态信息含量(PIC)分别为0.47-0.90、0.50-0.66、0.37-0.58,平均为0.61、0.60、0.51,说明凡纳滨对虾具有较高的遗传杂合水平.F2代的多样性水平略高于F1代,而F3代则明显低于F1代和F2代.两两家系间的遗传分化指数FST介于0.01-0.34之间,其中C-F1和L-F1家系之间FST最小(0.01),C-F1和O-F3家系之间FST最大(0.34),表明世代间的家系遗传分化程度大于同一世代的家系.各家系间的Nei's遗传距离和FST分析结果相一致,表明凡纳滨对虾世代间具有明显的遗传分化.本试验将为开展凡纳滨对虾家系选育工作提供理论依据和技术指导,并对甲壳动物的遗传选育具有参考价值.     

绿原酸对凡纳滨对虾抗氧化系统及抗低盐度胁迫的影响

对绿原酸调节凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)血淋巴抗氧化系统功能及抗低盐度胁迫的效果进行了评价。360尾凡纳滨对虾随机分为4组,分别投喂含有0、100、200和400 mg/kg绿原酸的饲料28 d,随后将对虾从盐度为32的天然海水直接转入至盐度为10的水中胁迫72 h。结果表明,在正常养殖条件下,绿原酸对凡纳滨对虾的成活率、血淋巴总抗氧化能力(Total antioxidative capacity, T-AOC)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)及过氧化氢酶(Catalase, CAT)活力均无明显影响,然而投喂含有绿原酸的饲料14 d,对虾血淋巴谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GPx)活性和血淋巴细胞GPx和CAT基因表达水平均显著高于对照组(P<0.05);低盐度胁迫24 h,绿原酸组凡纳滨对虾的存活率较对照组提高10%,但各组之间无显著性差异(P>0.05);低盐度胁迫24 h,各组凡纳滨对虾血淋巴T-AOC、SOD和GPx活性与胁迫前相比均显著增加,说明低盐度胁迫条件下机体产生了抗氧化胁迫反应,同时绿原酸组对虾血淋巴GPx、CAT活性均显著高于对照组(P<0.05);低盐度胁迫72 h,绿原酸组对虾血淋巴T-AOC、GPx和CAT活性和血淋巴细胞GPx和CAT基因表达水平均明显高于对照组。上述结果表明绿原酸可有效调节凡纳滨对虾的抗氧化系统功能,增强对虾对于低盐度胁迫下的适应能力。     

高盐胁迫对凡纳滨对虾消化及免疫相关酶活力的影响

为探讨高盐对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)消化及免疫相关酶活力的影响,实验设置了30、40、50、60共4个盐度梯度。对虾体长(7.84±0.68)cm,养殖密度333尾/m~3,每个梯度设3个平行,实验周期30d。取血淋巴、肌肉、肝胰腺等组织,检测其超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、碱性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)及蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活力。结果表明,盐度显著影响凡纳滨对虾肝胰脏中胃蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活力(P0.05);随着盐度增加,消化相关酶活力均不断下降,处理间差异显著(P0.05);盐度对凡纳滨对虾不同组织的免疫指标产生影响,表现为随着盐度升高,血淋巴中,AKP活力逐渐升高,ACP、CAT和SOD活力均表现为先升高后降低;肌肉中,AKP、ACP和SOD活力呈现先升高后降低的变化趋势;肝胰脏中,AKP活力呈现先降低后升高再降低的变化趋势,ACP活力高盐处理间差异不显著(P0.05),CAT活力先降低后升高,SOD活力盐度40后逐渐降低。实验结果初步说明,高盐显著影响凡纳滨对虾的消化及免疫相关酶活力,且盐度对不同组织中免疫酶活力影响存在一定的组织特异性,50以上的高盐胁迫对对虾消化和免疫相关酶活力的影响尤为显著。     

凡纳滨对虾各月龄性状的主成分与判别分析

为了研究凡纳滨对虾各性状增长规律和判定最佳生长季节凡纳滨对虾的体格与月龄的关系,选择1～6月龄凡纳滨对虾各1000只,选择全长、体长、第一腹节背高、第三腹节背高、第一腹节背宽、头胸甲长和体重共7个性状,进行主成分与判别分析.结果表明:各月龄凡纳滨对虾性状之间均呈现显著的正相关(P<0.01), 其中以全长与体长的相关性最为明显,1月龄凡纳滨对虾体重与形态性状的相关系数较小.各月龄凡纳滨对虾的主成分有所不同,1～2月龄凡纳滨对虾的第一主成分为长度因子,第二主成分为宽度因子,第三主成分为高度因子;3月龄凡纳滨对虾的第一主成分与1～2月龄凡纳滨对虾一致,但第二主成分为高度因子,第三主成分为体重因子;4～6月龄凡纳滨对虾的第一主成分为体重因子,第二主成分为高度因子,第三主成分为宽度因子.1～3月龄凡纳滨对虾形态性状的增长优先于体重, 4～6月龄凡纳滨对虾体重优先于形态性状的增长.错过最佳生长季节的凡纳滨对虾的与体格大小相符的月龄可通过建立的判别式来判断,总的判别准确率为98.98%,其中2～4月龄凡纳滨对虾的判别准确率为100%.