脲对棒状链霉菌棒酸合成的影响

【目的】棒酸(Clavulanic acid)是棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)产生的β-内酰胺酶抑制剂,其合成过程中产生副产物脲,旨在探讨脲对棒酸合成的影响。【方法】通过发酵过程中脲和铵盐添加实验、阻断脲酶活性以及pH梯度实验研究脲对棒酸合成影响。【结果】脲添加实验结果表明:低浓度脲降低棒酸产量,当添加脲浓度达到20 mmol/L时,完全抑制棒酸合成。由于脲酶可以把脲水解为铵离子,导致铵离子浓度及pH提高,因此,通过阻断棒状链霉菌脲酶活性,可以更准确地反映脲对棒酸合成的影响。结果发现,脲酶敲除株发酵液中脲大量积累,浓度高达10 mmol/L,但棒酸产量没有明显降低,说明在该浓度下脲自身并不能抑制棒酸合成。添加脲降低野生菌棒酸产量,可能是脲被水解为铵离子或其引起的pH变化所致。而棒酸发酵液添加铵盐的结果显示铵离子对棒酸产量没有抑制作用;另外,pH梯度实验证实不同pH对棒酸产量影响较大。【结论】排除了脲和铵离子对棒酸合成的抑制作用,证实了脲酶水解脲导致pH提高是脲添加导致野生菌棒酸产量降低的真正原因,为进一步阐明棒酸合成调控机制提供了根据。     

棒状链霉菌lat基因的中断对棒酸产量的影响

从棒状链霉菌中克隆1.8kb的lat基因片段,构建了基因置换质粒pXAL1和pXAL2。运用接合转移方法把中断载体导入棒状链霉菌中进行lat的中断,得到1株接合转移子AmrThios,命名为XAL863。通过Southern杂交分析及赖氨酸转氨酶活性测定,证明此菌株的lat基因被中断。通过发酵培养,HPLC方法检测棒酸含量,发现棒酸产量明显提高,约为原产量的1.8倍。     

细胞壁缺陷白喉棒状杆菌致病作用的观察及其毒力基因检测

目的比较白喉棒状杆菌亲代细菌型及其稳定L型动物致病性的差异,了解白喉棒状杆菌稳定L型变异的特点,探讨其变异的性质及其与细胞壁缺陷突变的关系。方法用氨苄青霉素在非高渗培养基内人工诱导产毒性白喉棒状杆菌为稳定L型。采用白喉棒状杆菌稳定L型纯培养物及其代谢产物皮内感染家兔,观察局部感染部位皮肤或全身的病理改变。采用微量法提取白喉棒状杆菌稳定L型的染色体DNA,用Tox基因特异性引物进行PCR扩增以检测毒素蛋白结构基因,并进行序列测定和分析。结果白喉棒状杆菌在氨苄青霉素作用下可发生细胞壁缺陷而成为L型,白喉棒状杆菌稳定L型不能引起动物局部或全身发生异常表现,该稳定L型的传代培养物可仍然保留同其亲代细菌型一致的Tox基因及其核苷酸序列。结论提示细胞壁缺失将导致白喉棒状杆菌与产生毒素蛋白有关结构基因在宿主菌细胞内的表达受到抑制,以致使白喉棒状杆菌稳定L型丧失了产生外毒素致病的作用。     

硫酸铜亚碲酸钾鸡蛋琼脂培养基培养白喉杆菌的实验观察

在白喉流行季节,及早发现带菌者并查明传染源,在流行病学上具有重要意义。近年来我们用硫酸铜亚碲酸钾鸡蛋琼脂培养基(简称铜—碲培养基),进行抑制杂菌、分离白喉杆菌的试验,得到了较满意的结果,现报告如下。     

不同来源的谷氨酸棒杆菌氨基脱氧分支酸合成酶的活性分析

分别以高产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)SYPS-062与模式菌株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032的基因组DNA为模板,运用PCR技术扩增出氨基脱氧分支酸合成酶(ADC synthase)的编码基因pabAB。实验结果表明：来源于SYPS-062和ATCC 13032的pabAB片段全长均为1863bp,编码620个氨基酸。两片段存在16个碱基的差异,引起了7个氨基酸的突变。将pabAB连接表达载体pET-28a(+),构建表达质粒pET-28a-pabAB,并转化E.coli BL21(DE3),在IPTG诱导下,E.coli BL21(DE3)(pET-28a-pabAB)高效表达分子量约为67kDa的可溶性蛋白。表达产物带有His-tag标记,选用Ni柱对表达产物进行纯化,纯化后酶活测定结果表明,来源于SYPS-062氨基脱氧分支酸合成酶的比酶活低于ATCC 13032达46.6%。     

双歧杆菌生态制品对海人酸模型抗癫痫作用的初步观察

用海人峻（ＫａｉｎｉｃＡｃｉｄ,ＫＡ）１０ｍｇ／ｋｇ给ＳＤｋ鼠皮下注射,注射后０－１／２ｈ之内,动物出现凝视和湿狗样抖动;１／２－２ｈ,动物出现癫痫发作（严重程度从１级发展至５级）;２ｈ后,动物反复自发出现严重的癫痫发作;４ｈ减弱;８ｈ停止。实验组动物分别于１或３周前开始并连续从饮水中定量投喂双歧杆菌活菌制剂（０．５ｇ／天／只）。结果表明,预先投喂该生态制品持续达３周组大鼠其癫痫发作受到明显抑制与对照组比较Ｐ＜０．０１。     

谷氨酸棒杆菌代谢芳烃过程中β-酮己二酸途径中原儿茶酸支路的分子基础

虽然在格蓝氏阴性菌中酮己二酸途径的原儿茶酸支路研究较多,但在格蓝氏阳性菌中的研究很少。本实验中,利用原儿茶酸、对甲酚和4-羟基苯甲酸作为惟一碳源和能源培养谷氨酸棒杆菌,酶活测定表明有原儿茶酸3,4-双加氧酶存在。对基因组数据分析表明在ncg12314-ncg12315位点可能编码原儿茶酸3,4-双加氧酶,ncg12314/ncg12315分别是两个连续的阅读框,采用PCR方法克隆了这两个基因,并在大肠杆菌中表达,测得原儿茶酸3,4－双加氧酶活性,进一步把这两个基因从谷氨酸棒杆菌中敲除,突变株失去了利用原儿茶酸、对甲酚和4-羟基苯甲酸的能力,同时,原儿茶酸3,4-双加氧酶活性消失。原儿茶酸3,4-双加氧酶由α-和β-两个亚基组成,基因同源性比较表明ncg12314/ncg12315分别与α-和β-两个亚基的编码基因同源。这些结果清楚地证明了ncg12314/ncg12315编码原儿茶酸3,4-双加氧酶的两个亚基。通过对谷氨酸棒杆菌基因组分析,发现了参与该芳烃代谢途径的其他基因。本项研究对揭示微生物尤其是格蓝氏阳性菌中芳烃代谢的遗传多样性,提供了新的依据。     

谷氨酸棒杆菌中芳香化合物降解的β-酮己二酸途径中原儿茶酸分支关键酶的鉴定

β-酮己二酸途径的原儿茶酸分支在革兰氏阴性细菌中研究较多,但在革兰氏阳性细菌中的研究却很少.本研究表明谷氨酸棒杆菌能以原儿茶酸、4-羟基苯甲酸、香草醛和对甲酚作为惟一碳源和能源生长,并且生长时诱导表达原儿茶酸3,4-双加氧酶.对谷氨酸棒杆菌基因组分析表明,基因位点ncg12314～ncg12315可能编码原儿茶酸3,4-双加氧酶.通过PCR反应扩增了ncg12314～ncg12315,并克隆到表达载体pET21a上,获得质粒pET21aP34D;携带pET21aP34D的重组大肠杆菌经诱导表达原儿茶酸3,4-双加氧酶.敲除ncg12314～ncg12315后,谷氨酸棒杆菌突变株失去原儿茶酸3,4-双加氧酶活性,同时丧失了利用原儿茶酸、对甲酚、香草醛和4-羟基苯甲酸作为惟一碳源和能源的能力;通过基因互补,这些能力又可重新获得.这些结果证实ncg12314和ncg12315(pcaHG)编码原儿茶酸3,4-双加氧酶.进一步对谷氨酸棒杆菌基因组分析后鉴定到一个完整的编码原儿茶酸分支途径中相关酶的基因簇,该基因簇的独特组织方式为芳香化合物的降解研究提供了新的视点.