阴道毛滴虫黏附蛋白33基因原核表达载体的构建及表达

目的构建阴道毛滴虫黏附蛋白33基因原核表达载体并诱导其体外表达。方法pMD-18T-ap33重组质粒和pUC18空质粒经BamH Ⅰ和XbaⅠ限制性内切酶双酶切,将ap33基因亚克隆入pUC18载体并进行筛选和鉴定。重组质粒经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳及Western-blot杂交鉴定重组蛋白。结果经双酶切及PCR鉴定,构建的重组质粒为阳性重组子,诱导出的重组蛋白大小约为Mr36000,与理论值基本相符。结论成功构建重组质粒并获得体外表达。     

人BMP4基因的克隆及其原核表达载体的构建

以成熟人胎盘组织为材料来源,克隆人BMP-4基因的全长cDNA,经过PCR扩增后与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T-BMP4克隆质粒.酶切后回收小片段与表达载体pET-22b的多克隆酶切位点连接,构建原核表达载体pET22b-BMP4,酶切及测序鉴定重组子.重组质粒转化至感受态的Rosseta宿主菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达情况.结果显示,从胎盘组织中成功地克隆到人BMP4基因,与NCBI中公布的序列100％相符合,原核表达载体pET22b-BMP4转化至Rosseta构建表达菌体,经IPTG诱导后电泳分析可见重组蛋白表达的条带.     

鼻咽癌侯选抑瘤基因BRD7原核表达载体的构建及其表达

BRD7基因是一个鼻咽癌侯选抑瘤基因,为了构建BRD7基因的原核表达载体并使其在大肠杆菌得到表达,设计了带有SalⅠ,NotⅠ酶切位点的引物,以已构建好的质粒pGEM-T Easy/BRD7为模板,用PCR扩增出BRD7基因的完整阅读框架,并用SalⅠ,NotⅠ酶切PCR产物和原核表达载体PGEX-4T-2,然后用T4 DNA连接酶将其连接,得到重组表达质粒PGEX-4T-2/BRD7,经双酶切鉴定和测序验证,表达载体构建正确.重组表达质粒转化感受态大肠杆菌Jm105后用IPTG诱导,成功表达了一分子质量约为90 ku的融合蛋白;37℃诱导4 h后,SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳后,经扫描分析该融合蛋白产量占菌体蛋白总量28.48%, 蛋白质印迹(Western-blot)证实了该融合蛋白的表达获得成功.这为BRD7基因的蛋白纯化及抗体制备,进一步开展其功能研究奠定了基础.     

大黄鱼MSTN成熟肽区基因的原核表达

根据本实验室克隆的大黄鱼肌肉生长抑制素(MSTN)基因编码序列设计引物,通过RT-PCR法扩增大黄鱼MSTN成熟肽区域的基因,将目的片段插入pMD18-T克隆质粒,并测序验证。验证后用BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切含目的片段的pMD18-T克隆质粒和pET-28 a表达质粒,构建MSTN-pET-28 a重组表达质粒。将重组表达质粒转化至BL21菌中,经IPTG诱导后表达蛋白的大小约17 kD。     

托佩克猪SLA-3原核表达载体构建及表达

目的:研究托佩克猪SLA-3-TPK的原核表达载体的构建及蛋白表达。方法:设计引物扩增SLA-3-TPK胞外区(命名为SLA-3-TPKe),并将此片段克隆至p MD19-T Simple Vector,经双酶切筛选阳性克隆测序,序列正确的克隆片段与表达载体p ET-21a(+)连接,转化宿主菌BL21,并经过诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白的表达。结果:PCR成功扩增获得SLA-3-TPke,大小约为850bp,酶切后插入片段大小约为830bp,经克隆测序,阳性克隆序列与原序列一致,双酶切鉴定证实目的基因与p ET-21a(+)成功连接,经过IPTG诱导表达和SDS-PAGE检测,结果显示目的基因成功表达且目的蛋白大小约为31k Da。结论:该研究成功构建了托佩克猪SLA-3原核表达载体,获得了表达蛋白,为今后进一步的结构和功能研究奠定基础。     

δ-睡眠肽与GFP融合蛋白的表达和纯化

构建δ-睡眠肽(DSIP)蛋白与GFP的融合基因表达载体,高效表达和纯化GFP-DSIP融合蛋白。通过SOE-PCR拼接DSIP全长编码基因,并使得DSIP上游具有肠激酶识别位点,经双酶切定向克隆至表达载体pET-28a,构建重组载体pET-28a-DSIP,通过PCR扩增GFP全长编码基因,经双酶切定向克隆至pET-28a-DSIP,构建原核重组表达载体pET-28a-GFP-DSIP,通过双酶切和测序鉴定后,导入E.coli BL21宿主菌中,IPTG诱导表达融合蛋白,采用镍亲和层析和分子筛凝胶层析获得高纯度蛋白,SDS-PAGE分析鉴定。经测序鉴定成功构建了原核重组表达载体pET-28a-GFP-DSIP,在IPTG诱导下获得可溶性的绿色荧光蛋白与睡眠肽的融合蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化成功获得高纯度的融合蛋白。成功构建了DSIP与GFP融合基因的重组表达载体,确定了GFP-DSIP融合蛋白诱导表达的最佳条件,获得了较高纯度的融合蛋白,为进一步研究DSIP蛋白的生物学功能奠定了基础。     

猪白细胞介素18基因的克隆、表达及生物学活性检测

通过RT-PCR方法直接从猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因的cDNA, 克隆到pGEM-T载体, 构建重组质粒pGEM-T-IL18, 转化E.coli JM109感受态细胞, 取PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定。测序结果表明, pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474 bp, 编码157个氨基酸。将其克隆到表达载体pGEX6P-1中, 构建重组质粒pGEX-IL18, 转化E.coli BL21感受态细胞, 用IPTG诱导表达。重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量为45 kD的重组蛋白, 占菌体总蛋白的28%左右, 以包涵体形式存在。对包涵体进行洗涤, 用MTT法测定表明, 重组蛋白能明显刺激猪脾脏T淋巴细胞增殖反应的活性。     

猪白细胞介素18基因的克隆、表达及生物学活性检测

通过RT-PCR方法直接从猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因的cDNA, 克隆到pGEM-T载体, 构建重组质粒pGEM-T-IL18, 转化E.coli JM109感受态细胞, 取PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定。测序结果表明, pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474 bp, 编码157个氨基酸。将其克隆到表达载体pGEX6P-1中, 构建重组质粒pGEX-IL18, 转化E.coli BL21感受态细胞, 用IPTG诱导表达。重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量为45 kD的重组蛋白, 占菌体总蛋白的28%左右, 以包涵体形式存在。对包涵体进行洗涤, 用MTT法测定表明, 重组蛋白能明显刺激猪脾脏T淋巴细胞增殖反应的活性。     

阴道毛滴虫黏附蛋白65-3基因原核表达质粒的构建及表达

质粒 pMD-18T-ap65-3 经 Xho I 和 BamH I 双酶切, 1.0% 凝胶电泳后纯化回收阴道毛滴虫黏附蛋白 65-3 基因,定向克隆至原核表达载体 pET-32a( ), 构建原核表达质粒 pET32a-ap65-3. 重组质粒转化大肠埃希菌 JM109 感受态细胞中, 筛选阳性克隆, 进行PCR﹑酶切及测序鉴定正确后, 将重组质粒 pET32a-ap65-3 转化于大肠埃希菌 BL21 中,异丙基-β-D硫代半乳糖苷 (IPTG) 诱导重组蛋白表达后利用十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 和免疫印迹 (Western blot) 对重组蛋白进行分析鉴定. 本实验为研究阴道毛滴虫病的致病机制及蛋白生物学功能奠定了基础.     

肺炎克雷伯菌CS309耐药基因检测和NDM-1基因的克隆及原核表达

目的 检测产NDM-1肺炎克雷伯菌CS309是否同时携带产IMP、VIM型金属β-内酰胺酶或KPC型碳青霉烯酶的耐药基因,同时构建NDM-1基因原核表达质粒,并在大肠埃希菌中进行表达。方法 采用聚合酶链反应（PCR）扩增IMP、VIM和KPC耐药基因;以产NDM-1肺炎克雷伯菌CS309为DNA模板,PCR扩增NDM-1全长,并将其与pGEM-T克隆载体连接后转化至大肠埃希菌DH5α,继而对阳性克隆进行双酶切,将酶切片段与pET-28a(+)表达载体连接,并转化大肠埃希菌BL21,再用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达,并采用SDS-PAGE和Western blot技术验证NDM-1蛋白。结果 经PCR和测序证实,该菌同时携带NDM-1和IMP-4两种金属酶基因,未扩增出VIM、KPC耐药基因。经双酶切和测序证实,原核表达质粒pET-28a(+)-NDM-1构建成功。SDS-PAGE发现,重组菌株经诱导后在28 kDa附近有明显条带,与预期蛋白大小27.9 kDa一致。Western blot表明诱导产生的融合蛋白可与NDM-1抗体特异性结合。结论 肺炎克雷伯菌CS309同时携带NDM-1和IMP-4两种金属酶基因;成功构建了NDM-1基因的原核表达质粒,该质粒在大肠埃希菌BL21中高效融合表达。     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.     

Cause of Senescence of Nine Sorts of Flowers

The levels of endogenous phytohormones and respiratory rate in nine sorts of flowers such as Cymbidium faberi Rolfe, Nopalxochia ackermannii Kunth and others were investigated both at full bloom and senescence and meanwhile the effect of exogenous phytohormones on prolonging the blossoms and promoting ethylene production were tested. There is a high content of endogenous ethylene in all the long-lived flowere, about 3–16 folds higer than the short-lived ones. There is a high level of ABA at full blooming flowers of short-lived flowers, in which there is no or only some cytokinins in it, but the ratio of CTK (6BA+zeatin)/ABA is smaller(l.7). The endogenous ABA reached a much higher level at senescence in all nine sorts of flowers, so it is reasonable to consider that it is ABA which plays an important role of regulation in controlling flower's senescence. There is a much higher level of GA3 and zeatin in the long-lived flowers which is not demonstrated in the shortlived ones. The respiratory rate is one of the factors controtling the longevity of flowers, but it does not play a decided role. Application of 6BA and zeatin prolongs distinctly orchid’s longevity, however exogenous IAA through the promotive action on ethylene production, evidently extends the longevity of the flowers of the Nopalxochia ackermannii Kunth.     

真菌类遗传学分析的知识结构教学

本文以认知结构理论为指导,讨论了真菌类遗传分析与高等动植物遗传分析的内在联系,认为利用这种内在联系进行教学可收到好的效果并说明了作者的具体教学过程。 Abstract:In the paper, the relationship between genetic analysis of Fungi and genetic analysis of high animal and plant was discussed.A good results were obtained when we adopted this method in the teaching.     

医疗机构合理用药评价模型的构建研究

目的 针对医疗机构的合理用药水平进行评价研究。方法 根据医疗机构合理用药的具体要求,构建医疗机构合理用药评价指标体系,采用基于模糊群决策的方法和多指标评价分析法构建医疗机构合理用药评价模型。结果 构建了基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型,并通过实例分析证明了评价模型的可行性。结论 建立的基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型能够对医疗机构的合理用药水平进行科学评价,为提高医疗机构合理用药水平奠定基础。     

棉铃虫钙粘蛋白N端多肽多克隆抗体制备及对Bt抗性的初步检测

用重组表达的棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)中肠钙粘蛋白N端多肽片段制备兔多克隆抗体,并利用其对Bt抗性进行鉴定。通过RT-PCR方法对棉铃虫中肠钙粘蛋白N端多肽的基因片段Cad285进行PCR扩增,将其克隆到pET-30a原核表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,得到35ku的重组融和蛋白,融合表达的包涵体经过变性、Ni-NTA柱亲和纯化、复性等方法处理包涵体,获得可溶性纯化蛋白,用纯化后蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA检测其效价高于1∶16000;利用最终获得的多克隆抗体对室内纯合Bt抗/感品系的棉铃虫中肠钙粘蛋白进行Western blot分析,结果显示敏感和抗性品系之间有明显差异,表明其能够应用对Bt抗性进行初步检测。     

Photoregulation of seed germination of wild-type and of an aurea-mutant of tomato

Seed germination of an aurea mutant of tomato ( Lycopersicon esculentum Mill.) is promoted by continuous irradiation with red, far-red or long-wavelength far-red (758 nm) light as well as by cyclic irradiations (5 min red or 5 min far-red/25 min darkness). Far-red light applied immediately after each red does not change the germination behaviour. Seed germination of the isogenic wild-type, cv. UC-105, is promoted by continuous and cyclic red light while it is inhibited by continuous and cyclic far-red light and by continious 758 nm irradiation. Far-red irradiation reverses almost completely the promoting effect of red light. The promoting effect (in the aurea mutant) and the inhibitory effect (in the wild-type) of continuous far-red light do not show photon fluence rate dependency above 20 nmol m⁻² s⁻¹. It is concluded that phytochrome controls tomato seed germination throgh low energy responses in both the wild type and the au mutant. The promoting effect of continuous and cyclic far-red light in the au mutant can be attributed to a greater sensitivity to P_fr.     

龙胆科药用植物化学成分的研究现状

龙胆科植物在我国的分布范围很广,且多数为药用植物,其多数种属的药用植物,至今其化学成分尚未被系统研究。综述了目前龙胆科药用植物的化学成分的研究现状及一般提取方法,对近年来发现的环烯醚萜及裂环烯醚萜类化合物进行了总结,为本科药用植物的更深入研究提供了参考。