用细胞培养的流行性乙型脑炎病毒抗原做ELISA检测特异的IgG抗体

用C6/36细胞增殖流行性乙型脑炎(乙脑)病毒制备抗原,用ELISA法检测乙脑IgG抗体,可获得满意结果。用此法检测了河南,海南地区不同年龄人群的253份血清标本,阳性检出率为55.6％(141/253)。与血凝抑制法(HI)相比较,HI的阳性率仅37.1％(93/253)。两种方法的抗体滴度呈正相关r=0.88。用ELISA检测,乙脑抗体与登革病毒抗原有一定交叉,但滴度平均有16倍差异。本方法重复性良好,具有特异、敏感、简便的特点。可用于乙脑的诊断、流行病学调查和疫苗效果的考核。     

流行性乙型脑炎病毒血清抗体半微量空斑抑制法的改进

本文报道一种检测流行性乙型脑炎(简称乙脑)中和抗体的简化空斑抑制试验方法,用BHK21传代细胞在24孔塑料板上进行试验,在细胞未形成单层时,将病毒直接接种在刚消化的细胞悬液内,孵育后加甲基纤维素复盖物,再培养,细胞层经染色后即可计算空斑数。 用该法检查47名儿童乙脑疫苗免疫前后的中和抗体,与常规的鸡胚细胞全量法或BHK21传代细胞微量中和试验法作了比较,结果表明本法与其它常规法的敏感性一致,且具有简便快速、节省人力和原材料、空斑形成率高的优点,便于大量血清学检测。     

乙型脑炎病毒（JEV）ELISA检测方法的建立

目的建立猪乙型脑炎病毒（JEV）抗体ELISA检测方法。方法培养BHK21细胞,接种JEV病毒,制备BHK21正常抗原和JEV特异抗原,滴定酶结合物和抗原最佳工作浓度,并进行精密性、敏感性、稳定性、特异性实验。结果正常、特异抗原和酶结合物最佳工作浓度分别为0.2μg/mL、10μg/mL和1∶20000;正常、特异抗原批内变异系数分别为8.3%和6.4%,批间平均变异系数分别为9.7%和11.5%;检测灵敏度为1∶1280;与猪瘟病毒（CSFV）、猪细小病毒（PPV）均无交叉反应。稳定性试验相对偏差小于25%。结论建立的ELISA方法重复性、稳定性好,特异性、敏感性强。可用于猪JEV抗体的检测。     

中国流行性乙型脑炎病毒分子生物学特性研究

为了从分子水平了解中国流行性乙型脑炎(乙脑)病毒与国外分离株的差异,对1949年以来在中国乙脑主要流行地区分离的19株乙脑病毒的PrM-C区及E蛋白基因区的核苷酸序列进行了对比研究,以期了解不同时间不同地区在中国流行的乙脑病毒的分子差异.结果显示:病毒生物学初步鉴定显示,病毒感染BHK细胞后56h所有细胞均发生病变,约50%以上细胞脱落(CPE( ));3日龄乳鼠接种病毒72h之内死亡;所有病毒均与乙脑病毒(A2株)抗血清发生阳性反应,但反应强度不同,提示所有病毒均为乙脑病毒.病毒PrM-C(456～695)区核苷酸序列与各个国家及地区、各个基因型以及各个年代的73株乙脑病毒相应序列,用Woan-Ru Chen建立的方法进行基因分型分析,结果显示,所有19株中国分离的病毒均属于基因型Ⅲ型,与国外相关文献所报道的乙型脑炎病毒中国分离株的基因型相符.以乙型脑炎病毒疫苗株P3株为标准,对各病毒E蛋白500个氨基酸序列进行分析.各毒株核苷酸差异在0和4.2%之间,氨基酸差异在0和4.0%之间.所有核苷酸差异均为碱基的替换,无论核苷酸或氨基酸均无插入或丢失.大多数核苷酸变异在氨基酸编码的第三位,属于沉默突变,不引起氨基酸变化.18株病毒E蛋白活性结构域与疫苗株P3株相比共有247个氨基酸的差异,平均每株病毒有12.35个氨基酸的差异,有11株病毒(SA14、TLA、CZX、CBH、G35、GSS、LYZ、SH-3、YLG、YN、ZMT)在该区的差异数低于这个平均值.而在超过这一平均数的7个病毒株(A2、HA-3、47、CH-13、CTS、LFM、ZSZ)中,LFM、ZSZ、47与疫苗株相比较分别有16～20个氨基酸的差异,相对其它17株病毒而言,差异较为明显.以上线索提示,现有的乙型脑炎灭活疫苗在理论上可以覆盖包括现存病毒在内的毒株.     

豆鼠对流行性乙型脑炎病毒和圣路易脑炎病毒感受性的比较研究

圣路易脑炎与流行性乙型脑炎(以下简称乙型脑炎),在临床、传播媒介、流行季节和病毒性质上都很类似。在免疫血清学上虽有一定区别,但对实验室常用的动物中,主要只有小白鼠有高度的易感性,而在易感程度、感受途径和症状上,两者都没有显著区别。在免疫血清学方面,不仅操作比较麻烦,并且二者的抗原构造也有相似的部分,出现某种程度的交叉反应。因此,我们认为进一步寻找对这两型病毒在易感性上有区别的动物种,对病毒生物学性质的研究以及实际应用都是必要的。     

流行性乙型脑炎病毒E蛋白主要抗原域的原核表达与间接ELISA检测方法的初步建立

重组质粒pET-E转化宿主菌BL21,经1.0mmol/LIPTG诱导,外源基因以包含体的形式获得高效表达。通过Westernblotting检测证明表达产物具有良好的抗原性。以纯化后表达产物作为诊断抗原包被酶标板建立了检测JEV抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原的最佳稀释度为1:2000,血清的最佳稀释度为1:200,待检血清阳性标准初步定为:OD490nm>1.2,且待检血清与阴性血清的OD490nm比值大于2。     

流行性乙型脑炎病毒E蛋白主要抗原域的原核表达与间接ELISA检测方法的初步建立

重组质粒pET-E转化宿主菌BL21,经1.0mmol/LIPTG诱导,外源基因以包含体的形式获得高效表达.通过Western blotting检测证明表达产物具有良好的抗原性.以纯化后表达产物作为诊断抗原包被酶标板建立了检测JEV抗体的间接ELISA方法.结果表明,抗原的最佳稀释度为12000,血清的最佳稀释度为1200,待检血清阳性标准初步定为OD490nm＞1.2,且待检血清与阴性血清的OD490m比值大于2.     

我国流行性乙型脑炎病毒毒力和抗原性的研究

流行性乙型脑炎(乙脑)病毒的毒力,多与毒株的大小空斑数的比例有关;同株内大斑小斑的特征各异。60年代和80年代的乙脑毒株,其毒力无明显差异。单克隆抗体(McAb)51～8对15株乙脑病毒的中和指数(log10)为:6.05～6.25者3株,5.08～5.67者5株,4.0～4.67者4株,1.95～3.83者3株。这种差别与毒株的分离年份和地区无关。多克隆抗体(PcAb)的中和指数(log10):5.0～5.33者11株,4.0～4.73者4株。可见McAb能较好地反映乙脑毒株的抗原性差别。文中讨论了毒力检查和McAb抗原分析的流行病学和免疫学意义。     

流行性乙型脑炎病毒在Vero细胞上传代适应的研究

通过乙脑病毒Ｐ＿３株以不同方式在鼠脑和Ｖｃｒｏ细胞间传代适应的研究,培育出适于工业化大生产制备乙脑疫苗的生产毒种。其毒力可达７．０±０．５ｌｇＬＤ５０／０．０４ｍｌ,空斑滴度为７．５±０．５ＰＦＵ／ｍｌ,免疫原性ＩＤ５０值为０．００００１６－０．００００２３ｍｌ;在含有适量人白蛋白的１９９营养液内,该毒种于－３０℃至少可稳定一年;与鼠脑组织毒种相比,传代细胞毒种的毒力、免疫原性及稳定性均与其相当。然而,后者不含脑组织,至少降低了一种过敏的危险。另外,细胞毒种的制备无需手工解剖鼠脑,易于控制外源因子污染,易于标准化。对于大规模生产疫苗、提高疫苗产量和质量,传代细胞毒种比鼠脑组织悬液毒种具有明显的优点。     

利用流行性乙型脑炎病毒减毒株脑细胞吸附特征快速筛选减毒株的初步研究

实验证明,流行性乙型脑炎病毒减毒株的脑细胞吸附能力明显低于强毒株。据此,我们发展建立了一种从强毒SA14株中快速、简便地筛选减毒株的新方法。将3周鼠脑细胞37℃吸附SA14株1小时,从未吸附的病毒颗粒中挑出3个减毒株(C4、C5和B1)。将C5株再次吸附筛选,得到C563株。C563株已完全丧失对3周鼠的脑内毒力和皮下毒力,免疫小鼠一针即能诱导良好的抗体反应和保护力,经BHK21细胞盲传5代或乳鼠脑传一代,毒力没有明显回升。     

2018年甘肃省平凉市流行性乙型脑炎病毒的分子特征

为研究甘肃省2018年蚊虫携带流行性乙型脑炎病毒(简称乙脑病毒)的分子特征,2018年7月上旬在甘肃省平凉市4个县采集蚊虫标本,采用实时荧光定量RT-PCR方法开展乙脑病毒筛查;通过高通量测序方法对乙脑病毒基因扩增阳性蚊虫标本进行深度测序研究.结果显示,本次调查在4个县共采集蚊虫1800只,均为三带喙库蚊,分36批研磨和检测.定量RT-PCR结果显示10批(27.8％)蚊虫样本呈乙脑病毒基因扩增阳性.对10批样本进行高通量测序共获得59.7 M读序,其中5.3 M(8.9％)条读序能够比对到病毒基因组数据库上,经注释属于14科15属28种病毒.在其中7批样本中检出乙脑序列共1357条,基因组覆盖度为9.5％-83.1％.系统进化分析显示甘肃省2018年采集的三带喙库蚊中乙脑病毒为基因Ⅰ型.     

流行性乙型脑炎病毒减毒株和野毒株在聚丙烯酰胺凝胶电泳上的表现

乙型脑炎病毒减毒株(2-8株)和野毒株(SA14株)在生物学性质上有明显的不同,特别是嗜神经毒力方面,2-8株已丧失了对小白鼠、马,猴等敏感动物的脑内致病力。为了探讨这些生物学性质变化的物质基础,我们开展了乙脑强、弱毒株聚丙烯酰胺凝胶     

流行性乙型脑炎猪肾组织培养疫苗的研究 Ⅰ.病毒的培养和疫苗的制备

为了改进流行性乙型脑炎疫苗的质量,在国内曾进行了乙醚提纯脑炎疫苗,白陶土和硫酸铵提纯病毒及疫苗以及鸡胚组织培养疫苗的研究。我系曾证明以流行性乙型脑炎病毒感染猪后能引起毒血症,其病毒滴度可达10-3.5。因此,在1958年我们开始用猪肾单层细胞来培养流行性乙型脑炎病毒,并进行了猪肾组织培养疫苗的研究。应用这种方法有可能制备出一种安全。     

流行性乙型脑炎病毒E基因的克隆、表达及初步应用

参照GenBank中的日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)SA14-14株序列设计了一对特异性引物,用PCR方法从SA14-14扩增E基因全长,然后克隆到pMD18-T载体中,转化宿主菌DH5a,提取阳性克隆质粒进行双酶切鉴定,将目的片段定向克隆到pET32a(+)中,转化入BL21(DE3),经IPTG诱导可表达分子量约73ka的蛋白,Western blottmg试验呈阳性,表明E基因得到表达.以纯化的表达产物为核心抗原,猪抗JEV血清为一抗,HRP标记羊抗猪IgG抗体为二抗建立间接ELISA方法,并初步检测了一些血清样品,结果提示表达的蛋白具有很好的应用开发价值.     

流行性乙型脑炎病毒E基因的克隆、表达及初步应用

参照GenBank中的日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)SA14-14株序列设计了一对特异性引物,用PCR方法从SA14-14扩增E基因全长,然后克隆到pMD18-T载体中,转化宿主菌DH5a,提取阳性克隆质粒进行双酶切鉴定,将目的片段定向克隆到pET32a( )中,转化入BL21(DE3),经IPTG诱导可表达分子量约73ka的蛋白,Western blotting试验呈阳性,表明E基因得到表达。以纯化的表达产物为核心抗原,猪抗JEV血清为一抗,HRP标记羊抗猪IgG抗体为二抗建立间接ELISA方法,并初步检测了一些血清样品,结果提示表达的蛋白具有很好的应用开发价值。     

流行性乙型脑炎病毒SA14-14-2弱毒株某些体外特征的研究

本文研究了流行性乙型脑炎病毒弱毒14-2株及5-3株的某些体外特征,发现:1.在地鼠肾细胞内弱毒株的病变较强毒株晚;在C6/36细胞内,弱毒株仅出现细胞圆缩、松散、脱落,而强毒株产生类似细胞融合型病变;在LLC-MK2和原代鸡胚细胞内,弱毒株出现模糊不清的针点状小蚀斑,而强毒株则出现清晰的3～5mm大蚀斑。2.在50℃加温条件下,14-2与SA14的热稳定性相同,但5-3的热稳定性明显地较差;两株弱毒株均能在40℃培养条件下繁殖良好,与37℃培养无明显差别,并均能在小鼠巨噬细胞内良好繁殖,但生长速度较强毒株慢,病变也较差。 本文并对弱毒株的免疫原性和ret及T50特征的关系进行了讨论。     

流行性乙型脑炎病毒E蛋白结构域Ⅲ的抗原表位鉴定与功能研究

流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是一种严重危害人畜健康的虫媒病毒.表面囊膜蛋白(E蛋白)是该病毒的主要结构蛋白.E蛋白在介导病毒与宿主细胞的吸附、融合,决定病毒的血凝活性、细胞嗜性以及决定病毒毒力和诱导宿主产生保护性免疫反应中起重要作用.E蛋白结构域Ⅲ(EⅢ)是诱导中和抗体的重要区域.为确定乙型脑炎EⅢ的抗原表位,实验首先克隆了JEV疫苗株SA14-14-2的EⅢ区域,并用pGEX-6P-1载体进行融合表达,免疫印迹分析表明,该融合蛋白能被抗JEV血清识别.为了进一步对该结构域进行抗原表位作图,设计了14个覆盖该区域且部分重叠的短肽.将各短肽与GST进行融合表达与纯化.短肽融合蛋白经JEV阳性血清免疫印迹和EUSA免疫反应性扫描分析,结果鉴定出,E39(306TEKFSFAKNPVDTGHG320)、EA5-l(355VTNPFVATSSA366)、FA8-1(377FGDSYIV384)和E49(385VGRGDKQINHHWHKAG400)4个线性抗原表位.分别将4个抗原表位融合蛋白免疫小鼠,制备各抗原表位单因子血清,结果经体外病毒中和试验表明,E39为具有病毒中和活性的抗原表位.试验结果为进一步分析JEVE蛋白结构与功能以及诊断试剂和表位疫苗的研究提供了重要工作基础.     

检测流行性出血热病毒滴度和中和抗体效价的半微量空斑法

建立了检测流行性出血热病毒滴度和中和抗体效价的半微量空斑法。小牛血清与胎牛血清的培养效果无差异。7株不同来源的出血热病毒均能在E6细胞上形成空斑。接种的病毒浓度与形成的空斑数呈直线关系。用空斑法测得的病毒滴度稍低于荧光TCIE50滴定法。空斑减少中和试验的敏感性较荧光中和试验高30倍左右。同时还初步表明了本方法可用于流行性出血热病毒的抗原性分析。     

用体外免疫法建立人—人抗流行性乙型脑炎病毒杂交瘤细胞株

利用单克隆抗体(McAb)进行病毒病的治疗是人们所关心的一个重大课题。 流行性乙型脑炎(乙脑)是一种严重威胁人民健康的急性传染病,病死率高,后遗症严重。国内外目前尚无特效疗法。陈伯权等用乙脑病毒皮下或腹腔感染3周龄小白鼠24、48小时及5天后,分别用乙脑病毒51-8McAb进行治疗,平均治愈率分别为78％、73％及22％。     

抗体捕捉ELISA法检测特异性IgM在流行性乙型脑炎诊断中的应用

用抗体捕捉ELISA法(Mac ELISA)检测了临床疑似流行性乙型脑炎病人109例,75例阳性,阳性率为68.8％。经与血凝抑制试验和2-ME处理试验进行比较,结果MacELISA查出的75例阳性中,血凝抑制试验和2-ME处理试验也阳性者54例,阴性者21例,说明本法较常规方法敏感。有6例病人在发病第1天就可测到IgM抗体。第一周的阳性检出率为83.8％。对正常人、其它疾病病人和类风湿因子阳性者的血清测试结果均为阴性。 本试验底物采用3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)代替OPD,使方法的敏感性提高4～8倍。用NaN_3终止反应能保持蓝色数月不变,视差明显,易于肉眼观察。