L—乳酸脱氢酶基因克隆及功能分析

构建了一株产D,L-乳酸的乳杆菌(Lactobaeillus sp．)MD—1的基因库。利用乳酸脱氢酶和丙酮酸裂解酶缺陷的Escherichia coli FMJ144作为宿主,通过互补筛选分离克隆到乳酸脱氢酶基因(ldhL)。核酸序列分析表明,该基因以ATG为起始密码子编码316个氨基酸残基组成的蛋白质,预测的分子量为33．84kD;5′端存在典型的启动子结构,3′端的终止子是不依赖于ρ因子的转录终止子。ldhL编码的蛋白质有3个保守区域,其中Gly13～Asp50保守区域是NADH的结合位点,Asp73～Ile100和Asn123～Arg154保守区是酶的活性部位。该ldhL和其他乳杆菌的ldhL基因和编码的氨基酸序列相似性较低,核苷酸序列相似性最高仅为64．1％,氨基酸序列相似性最高仅为68．9％,是新的L—乳酸脱氢酶基因。     

D-乳酸脱氢酶基因克隆及其表达

构建了一株产D ,L 乳酸的乳杆菌 (Lactobacillussp .)MD 1的基因文库。利用乳酸脱氢酶和丙酮酸裂解酶缺陷的EscherichiacoliFMJ1 4 4作为宿主 ,在厌氧条件下通过互补筛选获得乳酸脱氢酶基因 (ldh) ,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Native PAGE)检测证明其阳性克隆表现出D 乳酸脱氢酶 (D LDH)活性。核酸序列分析表明 ,ldhD的ORF编码 331个氨基酸残基组成的蛋白质有两个保守区域 ,其中V1 47～D1 76 区是NADH的结合位点 ,R77～E1 0 7区据报道是酶的活性部位。该菌株D LDH和D羟基异己酸脱氢酶 (D HicDH)属于NADH依赖性脱氢酶家族 ,ldhD和其他乳杆菌属的ldhD及D HicDH基因和编码的氨基酸序列相似性较低 ,核酸序列相似性最高达 4 9 33% ,氨基酸序列相同性最高为 4 2 % ,是一个新的D 乳酸脱氢酶基因     

L-乳酸脱氢酶在大肠杆菌BL-21(DE3)中的表达

为了在大肠杆菌中构建利用葡萄糖生产L-乳酸的途径,以鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LA - 04 -01基因组为模板,设计引物扩增L-乳酸脱氢酶基因L-ldh.将该基因连接到表达栽体pET-28a(+)上,并转化大肠杆菌Top10.通过卡那霉素抗性平板筛选,提取重组质粒pET28a-L-ldh并测序,结果正确.将pET28a-L-ldh转化大肠杆菌BL-21( DE3),通过卡那霉素抗性平板筛选,得到产乳酸的大肠杆菌基因工程菌.经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳,检测到目的蛋白条带,L-乳酸脱氢酶比酶活力达到9.44 U/mL.该基因工程菌通过摇瓶发酵,L-乳酸产量达到3 g/L,成功构建出一条在大肠杆菌中生产L-乳酸的新途径.     

保加利亚乳杆菌ATCC11842 L-乳酸脱氢酶同工酶基因的克隆与表达分析

通过对保加利亚乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)L-乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase, L-LDH)同工酶基因的异源表达、酶活测定和摇瓶发酵研究L-LDH在乳酸合成中的作用。将保加利亚乳杆菌ATCC11842中L-乳酸脱氢酶基因ldb0120和ldb0094分别克隆至载体pET28a(+)中,构建重组表达载体pET28aldb0120和pET28aldb0094,并转化到大肠埃希菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中进行表达。进一步对重组蛋白进行Ni-NTA柱亲和层析和酶学活性测定,结果显示,LDB0120和LDB0094的比活力分别为0和25 U/mg,表明LDB0094是具有低活性的L-乳酸脱氢酶,而LDB0120不具有活性。对两株重组菌分别进行好氧和微好氧发酵,重组菌E.coli BL21/pET28aldb0094在好氧和微好氧条件可以合成L-乳酸,浓度分别为41.9和227.9 mg/L,而菌株E.coli BL21/pET28aldb0120在两种培养条件下均基本不合...     

芽孢杆菌P38中乳酸脱氢酶对其产L-乳酸光学纯度的影响

【目的】研究芽孢杆菌(Bacillus sp.) P38中乳酸脱氢酶对其产高光学纯L-乳酸(光学纯度>99%)的影响。【方法】全基因组测序显示在该菌中存在3个乳酸代谢关键酶,分别为L-乳酸脱氢酶(L-LDH)、D-乳酸脱氢酶(D-LDH)和苹果酸或L-乳酸脱氢酶(M/L-LDH)。通过将这3个酶进行异源表达、纯化与酶学特性分析,结合Native-PAGE、实时荧光定量PCR等方法,初步确定该菌高产光学纯L-乳酸的机理。【结果】Bacillus sp. P38中L-LDH对丙酮酸的催化活性(Kcat/Km值)最高,分别是D-LDH的2.9倍和M/L-LDH的4.3倍。其中M/L-LDH主要起L-LDH的功能。Native-PAGE实验中未检测到D-LDH活性。Bacillus sp. P38所有发酵阶段ldhL的转录水平均高于ldhD和ldhM/L。【结论】L-LDH是Bacillus sp. P38产高光学纯L-乳酸的主要关键酶。     

干酪乳杆菌L-乳酸脱氢酶在大肠杆菌中的表达、纯化及酶学性质

L-乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase,L-LDH)是发酵生产L-乳酸中催化丙酮酸转化成L-乳酸的关键酶。以干酪乳杆菌G-02(Lactobacillus casei G-02)基因组DNA为模板,克隆得到L-LDH基因(ldhL),经序列分析后将其连接到表达载体pET-28a(+)上,构建成重组质粒pET-ldhL转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,实现ldhL基因的表达。30°C加入IPTG诱导表达后,经镍柱亲和层析纯化的重组蛋白样品通过SDS-PAGE分析,约在40 kD处出现显著的特异性条带。对表达的L-LDH生物学特异性研究显示:重组L-LDH的比酶活为1 722 U/mg,最适反应温度为40°C-45°C;果糖-1,6-二磷酸(FBP)为别构激活剂,使最适pH向中性方向偏移(pH为6.6-6.8),Mn2+可拓宽最适酶活pH范围;Mn2+、Ca2+和Mg2+对L-LDH有激活作用,而Zn2+对L-LDH有抑制作用。     

L-乳酸脱氢酶热变性的热力学研究

用差示扫描量热法对L-乳酸脱氢酶的热变性进行了研究(温度扫描范围为290—390K,酶蛋白溶液浓度为0.28—0.72mg蛋白/mg溶液)。实验观察到当酶溶液浓度在0.62—0.72mg蛋白/mg溶液范围内有一个吸热转变,酶溶液浓度小于0.62mg蛋白/mg溶液时有两个未完全分开的吸热转变。 这个酶的量热焓与范德霍夫焓的比远大于1,而接近于2,这表明乳酸脱氢酶的变性过程不是一个简单的两态转变,从热力学和吸热峰的形状、大小分析,可以推断乳酸脱氢酶分子是由两个以弱相互作用相连结的合作结构区组成,而每一个结构区是由两个相互作用很强的亚基组成。也就是说乳酸脱氨酶的变性过程包括两个半独立的合作结构区的转变,每一个结构区的转变都近似一个两态转变,ΔHeal与ΔHvh的比值是随着两个半独立部分相互作用的增强,即蛋白浓度的增加而减小。随着蛋白浓度的减小,蛋白质周围水分子增多,酶分子中两个半独立部分的相对独立性增强,这可由热谱图上一个吸热转变变成两个半独立的转变得到证实。     

嗜热菌的耐热L-乳酸脱氢酶的研究

从广东各地的热温泉(55—95℃)水样中,分离到200余株最适生长温度高于70℃的极端嗜热菌。其中一株编号为HG25,具有耐热胞内L-乳酸脱氢酶(L—Lactate dehydrogenase EC．1．1．1．27．,简称LDH),有栖热菌属(Thermus)的特征,革兰氏阴性,无芽孢,好氧,不运动,产黄色素,最适生长温度为65—75℃,最高生长温度为85℃,最低为40℃,不水解淀粉,不从葡萄糖产酸,DNA的G+c百分含量为65mol％,L-乳酸脱氢酶经硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素生层析作了初步提纯,比活提高7倍,LDH还原丙酮酸反血的最运温度为6 0℃,最适PH为8 0,酶在70℃稳定,保温10分钟后,仍保留85％的原始酶活力。失活半寿期(t1/2)为85℃10分钟。     

免疫沉淀法测定乳酸脱氢酶同工酶1的研究

应用免疫沉淀法测定了乳酸脱氢酶同工酶1(LD1).血清与抗血清用量为10:1,加入抗血清5min后再加入与血清量相等的饱和硫酸铵溶液.离心后测定上清液中的LD.总酶活性在618U/L内线性关系良好.二份标本批内精度CV值分别为3.76%和4.70%,批间CV值为7.00%,免疫沉淀法与电泳法高度相关(n=22,r=0.976).72例正常人LD参考值为102.31±16.4U/L,LD1为23.65±4.39U/L,LD1/LD为23.12±3.85%.免疫沉淀法的优点是特异性高,操作简单,可用于自动生化分析仪.精确度高,线性关系好,测定范围宽,是测定LD1的理想方法.     

ldhL-ldb0094基因敲除对保加利亚乳杆菌产L-乳酸的影响

以保加利亚乳杆菌Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CICC21101为出发菌株,利用PCR扩增L-乳酸脱氢酶(ldhL)基因上下游序列ldhL1、ldhL2,获得ldhL基因缺失且包含上下游序列的片段,连接到乳酸菌专用温敏性基因敲除质粒pGhost4,将构建好的敲除载体电转入保加利亚乳杆菌CICC21101,低温筛选。结果表明,成功获得敲除ldhL基因的敲除突变株,敲除后的工程菌D-乳酸产量由30. 5g/L降为4. 8g/L,L-乳酸的产量由25. 4g/L增至58. 3g/L,光学纯度由54. 56%增至90%。同时发现ldhL-ldb0094基因的敲除致使ldhL-ldb1020表达的上调,D-乳酸脱氢酶(ldbD)基因表达量没有变化,ldhL基因敲除株的成功构建将为进一步研究该基因在保加利亚乳杆菌中的功能及后续高光学活性D-乳酸工程菌构建奠定基础。     

黑暗链霉菌中新脱氢酶基因的克隆与功能初步研究

S.tenebrarius H6主要产生安普霉素、氨甲酰妥布霉素和氨甲酰卡那霉素B,其中后两者仅在3′位有差异。为克隆相关基因,根据已报道的aprD3、livY、gentY基因设计兼并性PCR引物,并采用SON-PCR(singleoligonucleotide nested PCR)方法和LASP-PCR(linear amplification single primer PCR)方法,扩增获得部分SCD1基因,Blast分析为短链脱氢酶基因。采用基因阻断技术,使S.tenebrariusH6中SCD1基因失活。与野生菌株相比,变株的抗生素组分和含量几乎没有变化,但变株产孢子能力下降,且产孢子时间推迟,推测该基因与孢子的生成调节相关。     

芽孢杆菌Bacillus sp. S-1壳聚糖酶基因的克隆与序列分析

从连云港海滩晒虾蟹壳的泥土里筛选出一株产壳聚糖酶能力较高的菌株S-1,根据其形态特征、生理生化以及16S rDNA鉴定,初步认定该菌为芽孢杆菌属（Bacillus）。利用NCBI数据库中已经报道的Bacillus壳聚糖酶序列设计兼并引物,以菌株Bacillus sp. S-1的基因组DNA为模板进行聚合酶链式反应（PCR）,克隆到壳聚糖酶基因的部分序列;利用Clontech公司Universal GenomeWalker试剂盒构建该菌株的基因组步移文库,根据已测定的序列信息设计特异性引物,结合两步法PCR技术分别克隆两端未知序列,拼接获得壳聚糖酶基因的全长序列（该基因全长1362 bp编码453个氨基酸,注册号：EU924147）,并对该序列进行了生物信息学方面的分析。     

鼠李糖乳杆菌D-(+)-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用PCR的方法从鼠李糖乳杆菌基因组DNA中扩增到D-(+)-乳酸脱氢酶基因(ldhD),并连接到载体pSE380上,构建表达质粒pSE-ldhD,将重组质粒pSE-ldhD转化大肠杆菌BL21(DE3),重组菌株经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表明ldhD在大肠杆菌中实现了表达,表达产物的分子量约为37kD。同时采用紫外分光光度法测定D-乳酸脱氢酶的酶活,测得重组菌株的D-乳酸脱氢酶活力为5.4U/mL,最适反应温度为35℃,最适pH为5.6。     

甘蔗细胞质型苹果酸脱氢酶基因的克隆及其表达分析

对甘蔗(Saccharum officinarum L.)叶片全长cDNA文库进行测序,获得了1个细胞质型苹果酸脱氢酶(cMDH)基因的全长cDNA序列,命名为Sc-cMDH。生物信息学分析表明,该基因全长1314 bp,开放阅读框为999 bp,编码332个氨基酸。Sc-cMDH与其他植物cMDH的氨基酸序列同源性高达86.5%～97.0%。Sc-cMDH包含典型的NAD+结合基元T11GAAGQI17和催化基元I184WGNH188,还有相当保守的6个半胱氨酸残基,因此推断该基因为细胞质型NAD-MDH。定量PCR分析结果表明,该基因在甘蔗叶片和根中的表达量高于茎。     

香蕉枯萎病菌Fow1基因的克隆及序列分析

为了解Fow1基因在尖镰刀菌古巴专化型侵染香蕉过程中的作用,及其与尖镰刀菌古巴专化型生理小种1号和生理小种4号之间的致病力差异的关系,采用PCR和RT-PCR方法扩增了2个生理小种的Fow1基因,并对扩增产物进行了克隆测序及相似序列搜索和比对,还对基因编码的蛋白进行了结构预测和功能分析。研究结果表明2个生理小种Fow1基因开放阅读框均为957bp,编码318个氨基酸,基因序列和氨基酸序列差异小,而且两个生理小种Fow1基因所编码的蛋白均具有酵母线粒体载体蛋白典型的结构特征,推测Fow1基因可能为香蕉枯萎病菌在香蕉组织中定殖所必需。从Fow1基因序列及其编码蛋白的氨基酸序列看,2个生理小种致病力的差异与Fow1基因并无明显对应关系,这为进一步研究Fow1基因功能奠定了基础。     

Purification, Characterization, and Gene Cloning of Ceriporiopsis sp. Strain MD-1 Peroxidases That Decolorize Human Hair Melanin

Ceriporiopsis sp. strain MD-1, isolated from forest soil, produced several extracellular enzymes that decolorized human hair melanin. Among them, three enzymes (E1, E2-1, and E2-2) were purified to homogeneity and characterized. The enzymes required hydrogen peroxide in their enzyme reactions and, typical of other fungal peroxidases, oxidized various phenol compounds such as guaiacol, but not 3,4-dimethoxybenzyl alcohol. The spectra of the three enzymes showed an absorption maximum at 406 nm, indicating that they were heme proteins. However, the A₄₀₆/A₂₈₀ values of the enzymes were below 0.4, which was lower than those of other peroxidases. E2-1 and E2-2 were similar to each other in their molecular and catalytic properties, and they possibly represent products of posttranslational modifications and/or allelic variants of the same gene, mdcA. The corresponding cDNA was cloned and sequenced; the deduced amino acid sequence showed high identities to the manganese peroxidases from other microorganisms. The specific activities and K_m values of E2-1 and E2-2 for synthetic and human hair melanins were much higher than those of Phanerochaete chrysosporium manganese peroxidase and lignin peroxidase.     

中国红豆杉TcNPR1基因的克隆与功能研究

水杨酸（SA）可诱导红豆杉细胞中紫杉醇的合成,病程相关基因非表达子基因（NPR1）是SA介导的植物系统获得性抗性（SAR）信号途径中的关键信号分子。本研究从中国红豆杉（Taxus chinesis）细胞中克隆了TcNPR1基因,该基因完整的开放阅读框大小为1857 bp,编码蛋白序列由619个氨基酸组成,含有典型的NPR1保守结构域、锌指结构域和锚蛋白结构域。进化树分析发现,TcNPR1蛋白与拟南芥AtNPR3和AtNPR4类蛋白的亲源关系较近。TcNPR1基因表达响应SA、干旱和NaCl胁迫处理,且随着处理时间增加,TcNPR1基因表达量逐渐增大。超表达TcNPR1的转基因烟草植株对干旱的耐受力增强,叶片内可溶性糖含量达43.8 mg/g（FW）,比对照高出2倍左右,说明TcNPR1基因具有表达功能,此结果为探究中国红豆杉细胞响应SA诱导大量合成紫杉醇的信号途径提供了依据。     

重组酵母菌乙醇脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的:克隆产麻黄碱重组酵母菌乙醇脱氢酶基因片段,并对其进行序列分析,为研究该基因在重组酵母中与麻黄碱生物合成途径的关系提供参考.方法:根据一段利用抑制差减杂交技术获得的来源于重组酵母乙醇脱氢酶基因片段,采用RACE的方法扩增Adh基因,使用分子生物学软件对该基因进行生物信息学分析.结果:获得一段大小为1 245 bp的基因片段,编码375个氨基酸,含有两个催化域和两个锌结合域,与来源于Gandida boidinii ADH3基因的同源性为85％.结论:克隆的基因为乙醇脱氢酶基因,并在GenBank注册,登录号为JF293468.