培养勾体的无蛋白和低蛋白培养基

<正> 许多限定的(defined)化学培养基培养勾体已有报告(Babudiri B.等1960)。然而,无蛋白培养基可能使许多致病性血清型大量的发生变异,以致高的勾体浓度亦不能使用。Shenberg E的化学培养基是最成功的。她能连续次培养52株致病性勾体,能从开始的少接种量生长至10~8/毫升的勾体。虽然某些血清型,诸如拜伦和爪哇不可能在这种培养基中生长(ShenbergE.1967)。Kdo和Yanagawa(1970)使用 Shenberg E培     

布氏杆菌属内种和生物型的鉴定(续一)

<正> 三、布氏杆菌属的特性1.布氏杆菌属内的变异布氏杆菌生长于培养基中时,易倾向于变异。这种变异伴有抗原性的改变、丧失毒力、改变对噬菌体的敏感性以及菌落形态和其他的改变等。这种趋势是如此的显著,以至在讨论任何不同特性时都必须予以考虑。培养物在液体培养基中比在固体培养基上变异的更快。如果初次分离系采用液体培养基进行的,那末当检查时培养物可能已高度变异。因此,建议应迅速移植于固体培养基上。当进行任一培养物的分型前,均需检查其纯度和菌落形态。如果出现变异株,则需     

拟南芥Mo敏感变异株的筛选和表型分析

本文以EMS诱变处理野生型拟南芥Col-0获得的M₂代种子为试验材料,通过在不含钼（-Mo）和含170 nmol·L^-1钼（+Mo）的培养基上进行反复筛选培养,根据拟南芥根系在2种培养基上的生长差异筛选出31株Mo敏感变异株。并对变异株2-4的表型特征及鲜重和Mo含量进行了分析。结果显示,在-Mo培养基中变异株2-4的生长明显受到抑制,且叶鲜重、根鲜重和Mo含量均低于野生型。而在+Mo培养基中变异株2-4叶鲜重、根鲜重与野生型的差异不明显,且都高于在-Mo培养基中的。随着钼含量的增加,变异株2-4矮小、叶片失绿和叶缘卷曲的症状不断恢复。当钼含量达到170 nmol·L^-1时,变异株2-4的生长情况与野生型相比没有明显差异。这说明筛选出的2-4植株是一种Mo敏感型变异株。     

曼陀罗培养细胞的硝酸还原酶突变株

经紫外诱变氯酸钾筛选,得到一个低硝酸还原酶(NADH:硝酸氧化还原酶.EC1.6.6.1.,以下简写为NR)活力的细胞株。其主要特征:NR活力低,约为正常型的1/5;对氯酸钾具有较强的抗性;不适合在单纯以硝酸盐为氮源的培养基上生长,能在以(NH_4)_2SO_4为唯一氮源的培养基上生长。蛋白电泳表明,此细胞株与正常型有不同的蛋白带。这些特征在没有选择压力的培养基上培养二年后,仍保持不变,说明此细胞株是一个遗传型的变异株。     

利用基因芯片分析拉米夫定治疗过程中HBV DNA的基因变异

依据乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus;HBV)聚合酶基因序列研制HBV基因芯片,此芯片可分析HBV的7个基因型、4种血清型和HBV聚合酶基因rtV173、rtL180、rtM204和rtV207位点的突变。利用此芯片对A、B两组共计45例拉米夫定治疗12个月的患者进行服药前和服药后3、6、9、12个月的动态检测,其中C基因型39例,且血清型均为adr;B基因型6例,其血清型均为adw。在完成全程检测的38例患者中,17例ALT升高的A组出现1例拉米夫定耐药变异株,而21例ALT正常的B组出现4例变异株,且所有变异株均为rtM204 V／rtL180M,其中2例野生株和变异株共存。rtM204V变异最早在服药6个月时出现,随后出现rtL180M变异。10份PCR产物测序分析表明,芯片检测结果与测序结果基本一致,仅在rtL173位点出现1例差异。进一步分析HBV DNA变异与HBV DNA含量、ALT水平和HBeAg血清转换率的相关性,初步结果表明变异株的出现与治疗过程中的DNA反弹呈正相关,而与起始HBVDNA水平、ALT值无关联。HBV基因芯片可初步用于HBV DNA检测,可能是临床追踪评价抗病毒治疗效果的较好方法之一。     

北京地区G1-G4型人轮状病毒地方株VP7编码基因的序列分析

本文报告了北京地区流行的４个轮状病毒地方株（Ｇ１－Ｇ４）ＶＰ７编码基因的核苷酸序列。４个地方株的该基因核苷酸全长均为１０６２ｂｐ,读码框架和已往的研究一致。地方株和相同血清型的标准株之间ＶＰ７氨基酸序列具有高度同源性（９２％－９４％）,而不同血清型间则变异较大（６９％－８０％）。不同血清型间氨基酸序列的变异主要存在于高变区内,高变区以外的区域在不同血清型轮状病毒间保守。这一序列分析结果进一步从分子水平分析了地方流行毒株的血清型别,揭示了轮状病毒地方流行毒株和标准株之间ＶＰ７序列的变异情况     

利用基因芯片分析拉米夫定治疗过程中HBV DNA的基因变异

依据乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus; HBV)聚合酶基因序列研制HBV基因芯片,此芯片可分析HBV的7个基因型、4种血清型和HBV聚合酶基因rtV173、rtL180、rtM204和rtV207位点的突变.利用此芯片对A、B两组共计45例拉米夫定治疗12个月的患者进行服药前和服药后3、6、9、12个月的动态检测,其中C基因型39例,且血清型均为adr;B基因型6例,其血清型均为adw.在完成全程检测的38例患者中,17例ALT升高的A组出现1例拉米夫定耐药变异株,而21例ALT正常的B组出现4例变异株,且所有变异株均为rtM204 V/rtL180M,其中2例野生株和变异株共存.rtM204V变异最早在服药6个月时出现,随后出现rtL180M变异.10份PCR产物测序分析表明,芯片检测结果与测序结果基本一致,仅在rtL173位点出现1例差异.进一步分析HBV DNA变异与HBV DNA含量、ALT水平和HBeAg血清转换率的相关性,初步结果表明变异株的出现与治疗过程中的DNA反弹呈正相关,而与起始HBV DNA水平、ALT值无关联.HBV基因芯片可初步用于HBV DNA 检测,可能是临床追踪评价抗病毒治疗效果的较好方法之一.     

猪轮状病毒vp4基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

本研究扩增猪轮状病毒中国分离株JL94株VP4蛋白主要抗原编码区基因(1-756bp),将测序结果与国外分离株进行比较;将该基因片段同载体pMel BacA连接后,与杆状病毒DNA共转染入昆虫细胞Sf9,经蚀斑筛选纯化重组病毒并再感染Sf9细胞获得vp4基因的表达,对表达的VP4蛋白进行Western blot分析和血清中和抗体试验。结果表明：JL94株VP4主要抗原编码区基因与国外分离株CRW-8株、Gottfried株该基因片段氨基酸同源性分别为96．43％和67％,说明JL94株与CRW-8株属同一VP4血清型,而与Gottfried株属不同血清型。JL94株vP4主要抗原编码区氨基酸最大变异处位于aa81-aa207。vp4基因在昆虫细胞中表达量占细胞总蛋白的20％,Western Blot证实表达蛋白有良好的生物学活性。所表达的蛋白免疫小鼠产生中和抗体,阻断JL94在MA104细胞上引起的细胞病变。     

金藻吞噬微囊藻产生的无毒变异株与产毒原始株的比较

分别从喂食三株原始产毒铜绿微囊藻Microcystis aeruginosa(AC、DS和PCC 7820)的金藻Poterioochromonassp.培养物中获得三株藻,以Nest PCR方法(引物对CC/CG和CH/CI)确定此三株藻均为微囊藻属藻株.HPLC测试结果显示这三株藻均不产生微囊藻毒素.显示Poterioochromonas sp.具有将产毒微囊藻转化为尤毒微囊藻的能力.比较产毒原始株与无毒变异株的生理特性发现,变异株的类胡萝卜素/叶绿素比值高于原始株;而光反应曲线结果表明,变异株的PSⅡ的量子产率和光合作用活力高于原始产毒株,并且变异株在较低光强下就可达到最大的光合作用活力.显示喂食后产生的变异株比原始株有较高的光合作用效率.变异株的藻蓝蛋白/叶绿素比值则低于原始株,光合作用最适光强低于变异株,并且显示产毒原始株通过增加藻蓝蛋白的相对含量来提高对光照的吸收.变异株具有较高的光合作用效率和藻蓝蛋白含量可能是其能够在微囊藻和金藻混合培养的群体中占优势的原因之一.     

猪轮状病毒vp4基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

本研究扩增猪轮状病毒中国分离株JL94株VP4蛋白主要抗原编码区基因(1-756 bp),将测序结果与国外分离株进行比较;将该基因片段同载体pMel BacA连接后,与杆状病毒DNA共转染入昆虫细胞Sf9,经蚀斑筛选纯化重组病毒并再感染Sf9细胞获得vp4基因的表达,对表达的VP4蛋白进行Western blot分析和血清中和抗体试验.结果表明JL94株VP4主要抗原编码区基因与国外分离株CRW-8株、Gottfried株该基因片段氨基酸同源性分别为96.43%和67%,说明JL94株与CRW-8株属同一VP4血清型,而与Gottfried株属不同血清型.JL94株VP4主要抗原编码区氨基酸最大变异处位于aa81-aa207.vp4基因在昆虫细胞中表达量占细胞总蛋白的20%,Western Blot证实表达蛋白有良好的生物学活性.所表达的蛋白免疫小鼠产生中和抗体,阻断JL94在MA104细胞上引起的细胞病变.     

空肠弯曲菌增菌方法的研究与血清学分型

本文对空肠弯曲菌增菌培养基作了改进,以增菌法与直接分离法(直接法)对比进行实验。从379份腹泻成人粪便中分离出29株空肠弯曲菌,其中增菌法分离出29株(100%),直接法15株(51.72%)。增菌法提高检出率48.28%,P<0.001,两法差异非常显著,符合率为96.3%,说明增菌法优于直接法。另外,用烛缸培养法从鸡和猪粪便中分离出空肠弯曲菌分别为50和32株。对人、鸡和猪粪便中检出的110株菌作了血清学和生物学分型。从分出的15个血清型谱中发现不同来源菌株有共同性血清型,多集中于45型     

甲型肝炎病毒株间的基因,抗原性和生物学差异

甲型肝炎病毒（ＨＡＶ）只有一个血清型，但各株间存在不同程度的核苷酸序列差异，为３％￣２５％，大致可分为７个基因型。变异的核苷酸大多发生在密码的第三个位置，不会改变翻译蛋白氨基酸的组成，故各株间的抗原性差异不显著。     

登革病毒流行株的分离鉴定及其毒力位点变异研究

目的:从登革热患者血清中分离登革病毒,鉴定流行株的血清型及其毒力。对其中两分离株E基因进行序列测定,分析其可能的毒力位点变异。方法:采集临床诊断为登革热患者急性期血清91份,接种于C6/36细胞分离病毒,应用间接免疫荧光法鉴定及分型。并通过乳鼠脑内接种和空斑试验,测定分离株的毒力。扩增2株分离株E基因,克隆到pGEM-T载体进行序列测定,分析变异位点。结果:在91份血清中经2~3次传代分离出8株病毒,鉴定为登革1型病毒。在E蛋白影响毒力的3个区段中,两分离株有3处存在变异。结论:推测此次广州地区流行登革热可能由DEN 1型病毒感染引起,流行株的毒力较弱。毒力减弱可能和其基因位点变异有关。     

小麦愈伤组织及再生植株的染色体变异

对培养在含有不同附加成分的MS培养基上的小麦愈伤组织染色体进行了跟踪研究。结果表明,在整个培养过程中各培养基上愈伤组织都有一定程度的染色体变异。在培养初期,高浓度2,4-D可增加愈伤组织中的染色体变异率,AgNO_3可降低染色体变异率。6-BA对培养初期愈伤组织染色体变异率没有显著影响。但高浓度6-BA可加大长期培养愈伤组织中的超倍体细胞频率。蔗糖浓度对最初9代愈伤组织染色体变异率无显著影响。但之后,低浓度蔗糖培养基上亚倍体细胞频率明显减小。随着培养时间的延长,各培养基上愈伤组织中正常二倍体细胞的频率都有逐渐上升的趋势。在再生植株中,大部分核型正常,只有少数植株具有染色体数目或结构变异。有些核型正常植株也有表型变异。     

减毒痢疾菌为载体的HIV gag DNA疫苗的免疫原性

最近有报道指出,减毒侵袭性活菌可作为DNA疫苗的载体而被应用。在本研究中,我们将血清型为2a rfbF志贺氏菌属福氏痢疾杆菌变异株用于编码HIV-1 SF2 Gag蛋白的DNA疫苗的免疫。重组的细菌载体将gag DNA递呈给哺乳动物细胞,实现了Gag蛋白的表达,     

伤寒沙门菌线性质粒pBSSB1的p17基因的生物学功能分析

H:z66阳性伤寒沙门菌含有一特有的介导鞭毛单向相变换的线性质粒pBSSB1,其上第17号基因(p17)编码一未知功能蛋白(P17)。利用λ-Red系统制备p17基因缺陷变异株,测定变异株和野生株的生长曲线,比较其生长差异,同时通过半固体LB培养基进行动力试验比较其动力差异。利用PCR技术扩增获得p17基因,构建其重组表达载体pET28a(+)-p17,通过镍柱纯化目的蛋白P17-His6,纯化后蛋白作为抗原免疫兔子以制备多克隆抗体。结果显示,制备了p17基因缺陷变异株,变异株的生长明显迟缓于野生株(P0.05),变异株的动力明显减弱。构建了重组表达载体pET28a(+)-p17,纯化获得了高纯度的目的蛋白P17-His6并制得相应的多克隆抗体。     

两株雨生血球藻对四种培养基的适应性差异

研究了两株雨生血球藻(CG-11,CG-16)(Haematococcuspluvialis)对4种培养基BBM、BBM.R、BG11、MAV中的生长适应性情况.结果表明:BBM-R培养基使两株雨生血球藻的A680值、生物量、叶绿素a和可溶性蛋白含量均显著高于其它三种培养基;比较两株雨生血球藻在四种培养基中的生长情况得出,藻株CG-16的细胞密度(A680值)、生物量、叶绿素a和可溶性蛋白含量等指标均显著高于CG-11株;两个参试藻株与四种培养基之间在生产能力方面的最佳组合为CG-16藻株在BBM-R培养基中培养,该组合的最终细胞密度可达到60.11 × 104cell·mL-1,干重为0.84g·L-1,可溶性蛋白质最高含量为432.16 μg·L-1,最高叶绿素a含量为12.868 mg·L-1.     

适于无血清贴壁培养的抗凋亡宿主细胞系CHO-IVB2的构建

应用无血清培养基培养CHO细胞时 ,由于没有血清提供各种贴壁因子 ,细胞以悬浮的方式生长。在实际的大规模细胞培养中 ,CHO细胞往往以贴壁方式培养 ,要么贴壁于悬浮的微载体中 ,要么贴壁于固定的聚酯盘状介质或中空纤维中 ,而很少直接悬浮于培养基中。在无血清培养基中 ,Vitronectin单一组分可以促使CHO细胞的贴壁和扩增。通过双表达Igf_1和Bcl_2基因 ,已经构建了可以在无蛋白培养基IMEM中抗凋亡生长的细胞株CHO_IB3。在此基础上 ,构建了可以同时表达Igf-1、Vitronectin和Bcl-2三个蛋白的三顺反子表达载体pCI-NII-IVB。将该载体转染于CHO-dhfr^- 细胞中 ,构建了一个细胞株CHO-IVB2。该细胞株可以在无蛋白培养基中抗凋亡生长 ,适于以贴壁的方式大规模培养 ,用于大量生产外源目的蛋白.     

应用酶联免疫吸附技术(ELISA)鉴定根瘤菌血清型和测定大田接种回收率

本文采用酶联免疫吸附技术测定了我国根瘤菌株与引进菌株NC92的血清型异同和大田接种花生后的结瘤比率,并比较了限定培养基和YMA培养基培养制备的抗原-抗体反应。结果指出,NC92酶标记抗体与其相对应的NC92菌株抗原起专性反应,不与供试的我国根瘤菌株抗原起反应;NC92菌株大田接种三个花生品种后的结瘸比率与不接种比较,达到极显著水准(P<0.01),不同花生品种间也达到显著水准(P<0.05),证明酶联免疫吸附技术用于根瘤菌血清型鉴定及其大田接种回收率测定是可行的。两种不同制备来源的NC92抗体和酶标记抗体     

表达外源rhBMP2的CHO细胞株稳定性分析

骨形态发生蛋白2(BMP2)属于TGF-β超家族,是诱导成骨活性最强的BMPs之一, 具有广泛的临床应用的前景。本实验室已成功构建高效表达rhBMP2的重组CHO细胞株, 现选取其中一株表达量最高的细胞rCHO(hBMP2)-C8进行长期体外培养, 并在培养过程中比较了添加和去除压力筛选中使用的MTX对细胞生长, rhBMP2基因拷贝数及rhBMP2分泌蛋白表达的影响;检测了该细胞株在无血清培养基中可以连续表达rhBMP2的时间以及培养基中rhBMP2的温度敏感性等等。该研究为进一步采用动物细胞规模化培养技术生产rhBMP2奠定了基础。