群体感应淬灭酶克隆表达及其对铜绿假单胞菌的影响

【背景】由于抗生素的大量使用,导致细菌耐药性越来越强,寻找新的抗细菌感染药物成为研究热点。【目的】克隆表达群体感应淬灭酶,探究其对铜绿假单胞菌毒力及致病性的影响。【方法】利用PCR技术从产群体感应淬灭酶的芽孢杆菌QSI-1基因组DNA中克隆出aiiA基因,将其克隆到表达载体pET30a并导入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中进行诱导表达,通过镍柱亲和层析获得纯化的N-酰基高丝氨酸内酯酶。用不同浓度的淬灭酶作用于铜绿假单胞菌,检测其对铜绿假单胞菌毒力因子产生以及生物膜形成能力的影响;以秀丽隐杆线虫为模型,考察其对线虫感染铜绿假单胞菌存活率的影响。【结果】克隆表达出群体感应淬灭酶,该酶能显著抑制铜绿假单胞菌毒力因子产生和生物膜的形成,并能降低铜绿假单胞菌对感染线虫的致死率。【结论】群体感应淬灭酶可作为一种能高效抑制细菌致病性的物质,为临床治疗细菌性感染提供新的策略。     

一株裂解性低温假单胞菌噬菌体的分离及特性研究

从明永冰川低温土壤中分离、纯化获得一株低温假单胞菌噬菌体PFV1,并对其生物学特性(噬菌体基因组限制性酶切片段长度多态性、衣壳蛋白组分分析及生理特征)进行了初步研究。基于16S rRNA基因测序分析结果,将宿主菌初步鉴定为荧光假单胞菌菌株。噬菌体PFV1为球形,直径约50 nm。PFV1在4℃时具有侵染活性,4~25℃范围内均可形成噬菌。对氯仿具有一定的敏感性,具有热不稳定性,基因组为双链DNA,大小约38 kb。     

膜蛋白晶体的生长及其进展

生物膜中与脂双层结合的蛋白质称为膜蛋白.由于它们具有很大的疏水表面以及既亲水又疏水的两性特点致使其纯化与结晶都十分困难.在膜蛋白晶体生长系统中引入小分子去污剂与小的两性分子获得突破性进展.迄今为止,结晶出来的膜蛋白为数不多.其中只有光合细菌绿色红假单胞菌及球型红假单胞菌的反应中心得到3分辨率的晶体结构与解析.一系列膜蛋白形成二维晶体,可用电子显微镜与像重构技术获得三维结构信息.     

铜绿假单胞菌致病力和致病机理研究进展

铜绿假单胞菌是在临床上引起多种感染的重要的致病菌 ,其致病机理复杂而多样。综述了国内外近年来研究铜绿假单胞菌的结构、胞外产物的致病机理。了解铜绿假单胞菌的致病机理对预防及治疗其引起的感染具有指导意义。     

脉冲场凝胶电泳对铜绿假单胞菌的分子检测与相关性分析

目的应用PFGE对医院环境物体表面分离到的铜绿假单胞菌进行相关性检测与分析,探讨PFGE在监测和控制医院感染方面的意义。方法选择SpeⅠ酶对铜绿假单胞菌染色体DNA进行酶切,选用适宜的实验条件采用脉冲场凝胶电泳技术分析电泳酶切指纹图谱,了解其流行状况。结果14株铜绿假单胞菌基因组DNA经SpeⅠ限制性内切酶酶切后电泳,在30~800 kb之间产生18~24条大小不同的DNA切割片段区带。可分为9个带型。结论PFGE具有分辨力高,重复性好的特点,是铜绿假单胞菌分子流行病学分析的理想方法。     

具胶原蛋白酶活性铜绿假单胞菌的筛选*

从成都皮革厂等堆积废弃毛皮、皮革的场所采集土样,通过以明胶为主要基质培养基进行富集和初筛,获得95株有明胶酶活性菌株。挑选其中28株明胶酶活性较高的菌株进行牛皮消化试验,有12株菌能在48h内完全消化小牛皮。以Ⅲ型酸溶性胶原为底物,测定了12株菌发酵培养液中胶原蛋白酶活性,确认这12株菌都具有胶原蛋白酶活性,酶活力基本相同,约10-16U／mL。经形态观察、生理生化特征分析及BIOLOG微生物鉴定仪鉴定,这12株菌分为两类,分别是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeraginosa)和火神发光杆菌(Photobacterium logei)(结果另发表)。对铜绿假单胞菌产生胶原蛋白酶粗酶性质进行了研究,其酶活最适温度为32℃,最适pH为7．5,可以被金属蛋白酶抑制剂EDTA和EGTA部分抑制,不能被PMSF抑制。对铜绿假单胞菌产胶原蛋白酶发酵条件的研究表明,不仅培养基中氮源、碳源和金属离子影响产酶量,而且发酵工艺对胶原蛋白酶的产生也有较大影响。     

冷链食品中铜绿假单胞菌的检测方法研究及进化树构建

铜绿假单胞菌是条件致病菌,对于患者具有较大的感染风险与危害,因此建立冷链食品中铜绿假单胞菌的检测方法并完成其溯源分子进化树构建工作,对于保障食品安全至关重要。以冷链食品中的铜绿假单胞菌为研究对象,应用实时荧光PCR检测技术建立快速检测方法。通过冷链食品抽样调查检测出铜绿假单胞菌后,将样品中检测出的铜绿假单胞菌菌株进行测序分析并建立铜绿假单胞菌生物进化树完成溯源分析。结果利用该方法成功从随机采集的271份冷链食品中检出10株病原菌,病原菌总体检出率为3.69%(10/271),并通过分子进化树的构建成功溯源铜绿假单胞菌的污染来源并完成菌种种属定位。研究成果可以为冷链食品中铜绿假单胞菌等相关病原菌的检测溯源分析提供思路与方法。     

生防绿针假单胞菌HT66中脂肽的鉴定与功能

【目的】脂肽(Lipopeptide,LP)是微生物合成的一类重要的生物表面活性剂,不仅影响细菌的生物学功能,还对多种植物和人类病原菌具有广谱的拮抗作用。然而至今未见绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)中脂肽产物的报道。【方法】通过生物信息学手段预测绿针假单胞菌HT66中脂肽的氨基酸组成及顺序,构建脂肽合成基因缺失突变株HT66Δclp,根据突变株缺失代谢产物的UPLC/QTOF-MS信息验证预测结果,并研究了脂肽对该菌株的生长、吩嗪-1-甲酰胺(PCN)合成、生物膜形成和群集运动性的影响。【结果】预测菌株HT66的脂肽氨基酸顺序为L-Leu–D-Glu–D-allo-Thr–D-Val–L-Leu–D-Ser–L-Leu–D-Ser–L-Ile,通过比对野生型和突变株代谢产物的质谱信息确定该产物为黏液菌素(Viscosin);脂肽合成基因缺失后,菌株HT66的生长无明显变化,但其PCN合成、生物膜形成和群集运动性均有不同程度地下降。【结论】菌株HT66的脂肽产物为黏液菌素,对菌株的代谢、生物膜形成和运动性等生物学功能具有重要的调控作用。研究报道了绿针假单胞菌中一种脂肽分子的结构与功能,为研究其合成和调控机制及开发和应用奠定了基础。     

脂肪酶产生菌的筛选、鉴定及其产酶条件优化

目的:寻找合适的产酶菌。方法:从富油土壤中分离到一株脂肪酶产生菌,并通过16S rRNA部分序列分析和系统发育分析将其鉴定为假单胞菌属,定名为:Pseudomonas sp.26-2。本研究进一步通过正交试验设计对该菌株的产脂肪酶条件进行了优化。结果:在摇瓶培养条件下,其最适产酶条件为:淀粉1.5%,酵母提取物3%,硫酸镁0.05%,K2HPO40.2%,橄榄油0.2%;反应起始pH值为7.0,发酵温度为30℃。在此条件下,发酵脂肪酶活力可达15.5U/ml。结论:所获得的假单胞菌26-2具有一定的脂肪酶生产能力,并为该菌株的菌种改良以及脂肪酶的高效基因工程菌的构建奠定了基础。     

假单胞菌研究现状及应用前景

假单胞菌是自然界分布最广的微生物之一,广泛的分布必然面对多样的生境,多样的生境造就了假单胞菌丰富的遗传多样性,此遗传多样性不仅为假单胞菌的环境适应性奠定了物质基础,也为人类提供了宝贵的遗传资源,具有巨大的理论和应用价值。从环境的生物修复、生物防治、生物转化、铜绿假单胞菌的耐药机制等4个方面总结假单胞菌的国内外研究现状,并对假单胞菌的应用前景进行展望。     

铜绿假单胞菌黏附素蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

[目的]克隆铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)黏附素(adhesin)基因,表达纯化黏附素蛋白和获得多克隆抗体。[方法]设计特异性PCR引物,以铜绿假单胞菌DNA为模板,PCR法扩增铜绿假单胞菌黏附素基因,并将其进行双酶切后连接到表达载体pET28a,将重组质粒pET28a-adhesin转入大肠杆菌BL21,IPTG诱导目的蛋白表达,然后通过亲和层析进行纯化。再利用各种生物信息学软件分析该蛋白的生物学特性。将adhesin蛋白免疫小鼠,并获得了高浓度的多克隆抗体。[结果]显示成功得到了重组质粒pET28a-adhesin,并通过亲和层析得到重组adhesin蛋白。Adhesin的α-螺旋含量为46.37%,无规卷曲的含量为35.96%,β片层的含量为17.67%。模拟得到了adhesin蛋白的三级结构。该蛋白是一个跨膜蛋白,具有两个跨膜区。Adhesin蛋白具有良好的免疫原性,获得的抗血清效价高于1:5120。[结论]纯化得到了重组adhesin及其抗血清,为研究该蛋白的功能提供了实验基础。     

铜绿假单胞菌中Ⅲ型分泌系统调控机制及针对性治疗的研究进展

铜绿假单胞菌是临床上重要的条件致病菌,具有多种毒力因子且极易产生耐药性。Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)是铜绿假单胞菌中重要的毒性因子分泌系统,该菌通过Ⅲ型分泌系统将多种毒力因子注入到真核宿主细胞内并逃逸宿主细胞免疫系统的清除,引起宿主细胞相应的病理变化。对Ⅲ型分泌系统的研究,不仅有助于明确铜绿假单胞菌的致病机理,更可为临床治疗和药物研发提供理论基础。本文主要对铜绿假单胞菌中Ⅲ型分泌系统的结构、功能、调控机制以及针对性治疗策略等方面的研究进行了综述。     

软腐白菜细菌群落结构多样性与生长环境的相关性

[目的]通过对比分析不同生境白菜软腐病变组织与根系土壤相关细菌的群落结构,探讨白菜软腐细菌种群的多样性,以及与生境土壤细菌种群的相关性.[方法]样品采自河南省2个不同生态型白菜田,以成熟白菜软腐组织及病株根系土壤为目标,利用模拟原环境的培养基成分和条件,对样品中的细菌进行高通量分离培养和细胞16S rRNA基因序列比对分析,获得各样品细菌种群结构及其丰度,进而对各样品的优势菌群进行对比分析.[结果]两种不同生境白菜软腐组织细菌总量M05T为4.0×l0s cell/g、Q2T为1.2×1011 cell/g,分别获得纯菌56株和85株.M05T优势菌为萎蔫短小杆菌萎蔫亚种(Curtobacterium flaccunfaciens pv.Flaccumfaciens);Q2T优势菌为假单胞菌(Pseudomonas spp.)(柄木槿假单胞菌(P.hibiscicola)、台湾假单胞菌(P.taiwanensis)、托木尔假单胞菌(P.tuomuerensis)、莫塞尔假单胞菌(P.mosselii)).根系土壤细菌总量M05S为2.7 × 105 cell/g、Q2S为6.2 × 107 cell/g,分别获得纯菌36株和70株.M05S优势菌为巨大芽胞杆菌(Bacillus megatherium);Q2S优势菌为假单胞菌(Pseudomonas spp.)(香鱼假单胞菌(P.plecoglossicida)、栖木槿假单胞菌(P.hibiscicola)、类黄色假单胞菌(P.parafulva)、蒙氏假单胞菌(P.monteilii)、膝形假单胞菌(P.geniculata)).[结论]依据不同生境的白菜软腐组织和根系土壤细菌群落结构对比分析,认为白菜软腐菌可能具有多样性和多种致病来源,本研究为软腐病多种防治措施的制定提供基础研究和菌种资源.     

假单胞菌脂肪酶的研究进展

脂肪酶是一种重要的工业用酶,来自于假单胞菌的脂肪酶较来自其它菌株的具有更强的温度、有机溶剂耐受性等比较优势,在有机合成、食品工业、药物制造、油脂深加工等工业应用方面应用潜力巨大。对假单胞菌脂肪酶的分类及性质、结构、表达调控和分泌机制等进行了简要的概述。     

多重耐药铜绿假单胞菌产ESBLs酶与高产AmpC酶情况及药物敏感性研究

目的探讨多重耐药铜绿假单胞菌产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs酶)与高产头孢菌素酶(Amp C酶)情况及药物敏感性。方法收集我院各病区提供的多重耐药铜绿假单胞菌菌株共128株,无重复菌株,检测产ESBLs酶、Amp C酶情况同时进行药物敏感性分析。结果 128株铜绿假单胞菌共检测出产酶菌株98株,占总菌株数的76.56%,其中单产ESBLs酶菌株25株、单产Amp C酶菌株58株、同时产ESBLs酶与Amp C酶菌株15株、不产酶菌株30株;大多数抗菌素对产酶铜绿假单胞菌不敏感,特别是同时产ESBLs酶与Amp C酶菌株几乎所有抗菌素均不敏感,而对于不产酶铜绿假单胞菌大多数抗菌素均较为敏感。结论多重耐药铜绿假单胞菌产酶菌株较多,抗菌药物敏感性差,临床应该根据药敏结果合理使用抗菌素,减少和控制细菌耐药的发生。     

假单胞菌合成环脂肽转录调控的研究进展

假单胞菌所合成的环脂肽是一类由环状的寡肽连接一个脂肪酸链组成的两亲性分子,利用巯基化模块由非核糖体肽合成酶合成。环脂肽的生物合成受到严格、复杂的调控,GacS/GacA双组分系统和群体感应系统是其中两类重要的调控系统。本文总结假单胞菌合成环脂肽的调控机制及相关调控因子;对基于PCR的高通量分子筛选方法获取特定环脂肽进行分析,同时对基于调控机制的遗传改造提高假单胞菌产环脂肽的能力和获取更多新型环脂肽等方面的应用进行 展望。     

产碱假单胞菌脂肪酶的克隆表达及酶学性质研究

【目的】克隆产碱假单胞菌的脂肪酶基因,实现其在大肠杆菌中异源表达并进行酶学性质研究。【方法】通过基因文库构建和PCR,获得脂肪酶基因,并以pET30a(+)为表达载体、E.coli BL21(DE3)为宿主菌,在大肠杆菌中进行异源表达,表达产物经HisTrapTM亲和层析柱纯化后进行酶学性质研究。【结果】从产碱假单胞菌中克隆得到一个脂肪酶基因,大小为1 575 bp(GenBank登录号为JN674069)。该酶分子量为55 kD,最适底物为p-NPO,最适反应温度和pH分别为35°C、pH 9.0。重组酶经1 mmol/L的Cu2+处理30 min可使酶活提高至156%。在最适反应条件下重组酶的比活力为275 U/mg,Km和Vmax分别为80μmol/L和290 mmol/(min.g protein)。【结论】产碱假单胞菌脂肪酶基因的克隆与表达不仅积累了脂肪酶基因的资源,并为其在手性拆分中的应用奠定基础。     

质粒pNK866的拷贝数测定和限制酶图谱

假单胞菌(Pseudomonds)降解质粒的基因组织和表达调控的研究,以及以这些质粒为基础的高效降解环境污染物菌株和产生精细化工产品菌株的构建,是当前一个极为活跃的研究领域.但是,由于假单胞菌基因在大肠杆菌中的表达水平非常低,可用的假单胞菌载体又比较少,使这方面的研究遇到不少困难.目前使用较多的是来自质粒RSF1010的载体,但由于分子量较大,使用不方便,因此构建新的假单胞菌载体是该领域研究的一项重要内容.我们从弯曲假单胞菌(P.geniculata)AS 1.866中分离到质粒pNK866.本文报道了该质粒的拷贝数和限制酶图谱,为假单胞菌新载体的构建奠定了基础.     

假单胞菌铁载体及色素研究

假单胞菌分布广泛,种类繁多,能够产生多种结构的铁载体及具有特定颜色的色素化合物,这使假单胞菌在生物病害防治、医学研究等领域应用潜力巨大.假单胞菌铁载体具有菌种和菌株特异性,可在一定程度上作为其分类依据.假单胞菌色素具有色调、结构、功能多样性,与其铁载体在功能上具有一定重叠性.假单胞菌铁载体及色素分离纯化方法相对比较简单,但它们的生物合成及转运代谢机制非常复杂.     

快速从医院废水中大规模分离铜绿假单胞杆菌噬菌体

目的:从医院废水中快速分离多株不同的铜绿假单胞杆菌噬菌体,研究其生物学特性,为建立铜绿假单胞杆菌噬菌体库做准备。方法:利用噬菌斑法从未经处理的医院污水中分离和鉴定铜绿假单胞杆菌噬菌体,根据感染谱的不同确定它们为不同的铜绿假单胞杆菌噬菌体;重点研究其中一株宿主谱较广的噬菌体的生物学特性,采用负染法电镜观察噬菌体的形态和大小,提取该噬菌体的基因组并进行酶切电泳分析,测定噬菌体感染复数并观察其一步生长曲线。结果:通过噬菌斑法分离出90株铜绿假单胞杆菌噬菌体。电镜观察显示,噬菌体Pa27P1头部呈立体对称,有一长尾;酶切结果显示,噬菌体Pa27P1的基因组为双链DNA;生长曲线表明噬菌体Pa27P1感染宿主菌的潜伏期为25 min,爆发时间为25 min,裂解量为514。结论:90株铜绿假单胞杆菌噬菌体中有5株具有较广的噬菌谱,其组合能裂解所有18株铜绿假单胞杆菌,为深入研究铜绿假单胞杆菌噬菌体的生物学特性及其功能提供了依据。