用悬浮搅拌培养体系体外大量扩增人脐血造血干/祖细胞

目的 :建立一种简便、有效的脐血造血干 /祖细胞体外大量扩增培养体系。方法 :淋巴细胞分离液分离的脐血单个核细胞在SCF ,IL - 3,IL - 6三种细胞因子的作用下 ,于悬浮搅拌培养体系中培养 ,分析其总细胞数、CFU -GM、CD34+ 细胞的扩增倍数。结果 :脐血单个核细胞在悬浮搅拌培养体系中培养 12天后 ,其总细胞数、CFU -GM、CD34+ 细胞的扩增倍数分别为 6 .31± 1.5 2 ,2 0 .6 3± 1.5 4和 7.11± 1.12。结论 :悬浮搅拌培养体系是脐血造血干 /祖细胞体外大量扩增的有效培养体系。     

一种新型生物反应器在造血干/祖细胞体外扩增中的应用

针对造血干/祖细胞体外扩增对培养环境的需求, 结合静/动态培养的特点, 开发了一种新型的生物反应器用于造血干/祖细胞的体外扩增.在该生物反应器内, 采用SCF TPO Flt-3细胞因子组合, 比较了静态和循环培养两种方式体外扩增脐血CD34 细胞的效果.培养7 d后, 总细胞分别扩增了(13.86 ± 4.26)和(7.23 ± 2.67)倍, 显示静态培养有利于总细胞的扩增; CD34 细胞扩增倍数、培养物中CD34 细胞含量均相近, 无显著性差异; 而CD34 CD38-细胞扩增倍数以及培养物中CD34 CD38-细胞的百分含量分别为(1.82 ± 0.58)和(3.90 ± 0.85)倍以及(9.45 ± 4.85)和(37.47 ± 14.06)%, 循环培养明显高于静态培养.可见, 在该生物反应器内, 采用静态和循环两种培养方式, 均能实现造血干/祖细胞的体外扩增, 但静态培养促使造血干细胞向定向祖细胞分化, 而循环培养则更有利于早期造血干细胞的扩增.     

SCF、G—CSF的胞内信息传递途径及协同机制

在造血干／祖细胞体外扩增及体内动员过程中，早期造血生长因子SCF与晚期系谱特异性G－CSF有明显协同作用。SCF、G－CSF与各自相应受体结合，启动Ras-Raf-MAPK、JAK－STAT等胸内信息途径，达到最大转录激活。     

中空纤维灌注培养模拟骨髓造血研究

采用细胞工程技术探索造血细胞体外扩增技术以维持其自我更新潜能,抑制过度分化。方法：首先建立微载体 基质细胞体外造血模型（G1组,即瓶培养模式）,设置单纯微载体 基质细胞培养（G2组）和单纯骨髓细胞液体悬浮培养（G3组）作对照。检测各组粒系 巨噬系造血祖细胞集落产率（CFU GM/105）。自行设计1对引物,以检测Balb/c小鼠原始造血细胞c kit基因mRNA表达水平。试用中空纤维模拟血管灌注功能（Gh组,即中空纤维灌注模式）,以G1、G2、G3作对照,并对各组培养效果进行评价。结果：微载体 基质细胞体外造血模型实验结果显示：小鼠骨髓细胞培养2周后,CFU GM/105检测G1组比G3组高7.7倍（P<0.05）,是2个对照组（G2+G3）集落产率总和的1.9倍。原始造血细胞c kit mRNA表达水平：模型G1组比G2组高3.7倍,比G3组高62.3倍,且差异均显著。在成功建立微载体 基质细胞体外造血模型基础上进行中空纤维灌注培养实验,CFU GM/105检测显示：Gh组比G3组高4.6倍,并且略高于G2组;Gh组与G1组集落产率差别不明显。在原始造血细胞c kit mRNA表达水平上Gh组最高,从Gh、G1、G2到G3依次呈下降趋势。结论：在没有外加细胞因子的条件下,微载体 基质细胞和中空纤维灌注造血模型可抑制造血干、祖细胞过度分化与耗竭,维持其c kit较高的表达水平。     

一种新型生物反应器在造血干/祖细胞体外扩增中的应用

针对造血干/祖细胞体外扩增对培养环境的需求, 结合静/动态培养的特点, 开发了一种新型的生物反应器用于造血干/祖细胞的体外扩增。在该生物反应器内, 采用SCF+TPO+Flt-3细胞因子组合, 比较了静态和循环培养两种方式体外扩增脐血CD34+细胞的效果。培养7 d后, 总细胞分别扩增了(13.86 ± 4.26)和(7.23 ± 2.67)倍, 显示静态培养有利于总细胞的扩增; CD34+细胞扩增倍数、培养物中CD34+细胞含量均相近, 无显著性差异; 而CD34+CD38-细胞扩增倍数以及培养物中CD34+CD38?细胞的百分含量分别为(1.82 ± 0.58)和(3.90 ± 0.85)倍以及(9.45 ± 4.85)和(37.47 ± 14.06)%, 循环培养明显高于静态培养。可见, 在该生物反应器内, 采用静态和循环两种培养方式, 均能实现造血干/祖细胞的体外扩增, 但静态培养促使造血干细胞向定向祖细胞分化, 而循环培养则更有利于早期造血干细胞的扩增。     

冻存时间对脐血造血细胞体外增殖潜能的影响

目的研究冻存时间对脐血造血细胞增殖潜能的影响.方法在所分离的脐血有核细胞中加入联合低温保护剂Dextran-40+10%DMSO,经梯度降温后置液氮深低温保存.采用无血清造血细胞扩增液对冻存不同时间的脐血造血细胞进行体外扩增,动态监测扩增潜能.结果将冻存1个月、4个月脐血造血细胞体外扩增5周,其总有核细胞分别被扩增了(1499.0±115.6)倍和(1513.0±110.4)倍,FCs均于体外扩增的第3周达到高峰,分别扩增了(53.8±6.3)倍和(54.8±6.7)倍,D34+造血细胞于体外扩增的第2周均达到高峰,分别扩增了(63.8±6.1)倍和(62.4±5.7)倍;统计分析冻存1个月与4个月后造血细胞扩增结果,不存在显著性差异,>0.05.结论在适宜深低温条件下冻存脐血造血细胞,在一定时间内,冻存时间的长短不会导致其增殖潜能下降.     

造血微环境细胞组成及功能的研究进展

造血微环境是造血干细胞(HSCs)居住的场所,对于维持HSCs自我更新、分化与稳态有着重要的调控作用。伴随着胚胎发育,造血主要分为卵黄囊造血、主动脉-性腺-中肾造血、胎肝造血及骨髓造血4个时期,因而研究造血发育时期的微环境对体外HSCs的扩增及诱导分化有着重要的指导意义。现对4个造血时期的造血微环境细胞组成及功能进行综述,阐明不同时期造血微环境调控作用的异同,为实现HSCs在体外的扩增与分化打下基础。     

造血干／祖细胞研究进展

造血干／祖细胞是具有高度自我更新能力和多向分化潜能的造血前体细胞。从造血干／祖细胞的生物学特性、检测方法、表面标志及体外扩增、定向诱导分化、造血／祖细胞的细胞治疗及基因治疗等几方面进行了综述。     

造血干/细胞研究进展

造血干/祖细胞是具有高度自我更新能力和多向分化潜能的造血前体细胞.从造血干/祖细胞的生物学特性、检测方法、表面标志及体外扩增、定向诱导分化、造血/祖细胞的细胞治疗及基因治疗等几方面进行了综述.     

HOXA9在正常造血和急性髓系白血病中的调控作用

HOXA9 (homeobox A9)是一种含有同源盒结构域的转录因子,在正常造血发育和急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)的发生发展中发挥重要作用。HOXA9在造血发育的早期有助于造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)的扩增,但在造血发育进程中HOXA9表达降低而逐渐失去对HSC的调控作用。HOXA9如何调控HSC的扩增仍有待阐明。在急性髓系白血病中,多种因素可导致HOXA9基因的过表达,而这正是维持白血病转化所必需的,但是HOXA9促进白血病发生发展的分子机制至今仍未完全阐明。该文将对HOXA9在正常造血和急性髓系白血病发生发展中的作用进行综述。     

造血干细胞生物学——研究与展望

造血干细胞（hematopoietic stem cell,HSC）是目前研究方法最为多样、研究技术手段最为成熟的一类组织干细胞,并且已经被成功运用于临床上对白血病以及先天性免疫缺陷等疾病的治疗。近年来,通过对一系列“转基因”与“基因敲除”小鼠模型的分析,人们对造血干细胞在胚胎早期发育过程中的发生与起源、造血干细胞“自我更新”与“定向分化”的调节机制、骨髓中造血干细胞的微环境（niche）对造血干细胞功能维持的调控,以及造血干细胞与白血病干细胞之间的相互关系等诸多方面都取得了很大的进展。如何实现造血干细胞的体外长期培养与扩增,实现胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC）或诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell,iPS细胞）向造血干细胞进行有效的定向分化,以及探索造血干细胞在病理状态（如癌症、贫血、衰老等）或应激状态下（如炎症与感染、组织损伤、代谢异常等）的功能变化,都将会是今后造血干细胞研究的重要方向。     

HOXB4基因及其在造血干细胞增殖分化调控中的作用

OX家族基因编码一类转录因子 ,参与造血干 /祖细胞的发育调控。其家族成员HOXB4基因具有独特作用。通过提高其表达水平 ,可以在体内外大量扩增造血干细胞。与此同时基本不影响细胞的分化、系特异性及终末细胞的形态和功能。不仅如此 ,HOXB4还可增强胚胎干细胞 (ES细胞 )的造血潜能 ,促进ES细胞向造血细胞分化。因此 ,HOXB4无论是用于基因治疗还是干细胞治疗 ,都将具有广阔的应用前景     

造血干细胞发生学研究 Ⅳ.小鼠胚胎早期造血的探索

我们对人胚胎的造血发育包括胚肝、胚胎、骨髓、脾脏和胸腺的造血已有较详尽的研究与报道。但鉴于人胚取材的限制,早期胚胎造血的材料极难取得,故设计动物实验和应用罗斯小室作环流培养以期明确胚胎早期造血部位和造血干细胞的可能来源,以使发生学的研究更为完善。材料和方法用日龄60—70天 LACA 雌性和雄性小     

人脐带血来源造血干细胞体外扩增的研究进展

造血干细胞（HSCs）是血液系统中的一类成体干细胞群,具有自我更新和多谱系分化两个基本特征。造血干细胞移植（HSCT）可以治疗退行性疾病和多种血液系统疾病。脐带血来源造血干细胞（CB HSCs）是降低HLA配型要求的突破点,但单份脐带血中HSCs数量不能满足使用要求,为了获得足够数量的CB HSCs,体外扩增是一种可行的方法。近几年,学者们探索了多种体外扩增方法,包括优化细胞生长因子混合物、与基质细胞共培养及加入小分子化合物（SMCs）激动剂等。目前应用细胞因子联合小分子的扩增方法在多个临床试验中获得成功。本文对目前体外扩增CB HSCs的研究进展做一综述。     

基于单细胞转录组分析的造血微环境研究进展

成体造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)是一类主要定居于骨髓,具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞。HSC能够源源不断地产生各谱系成熟血细胞以维持造血系统的动态平衡。HSC功能特性的维持不仅依赖细胞本身的内在调控,还受到其所处的造血微环境或造血龛(hematopoietic microenvironment or hematopoietic niche)中多种成分的影响,因此研究造血微环境对揭示稳态造血调控、HSC体外扩增以及血液系统疾病的发生和发展等具有重要意义。以往研究利用体内成像技术和细胞特异的基因敲除技术,发现了造血微环境中多种细胞、细胞因子以及细胞外基质等成分。但作为一个复杂的三维系统,造血微环境的细胞组成、空间区域划分以及在正常造血维持及应激条件下的作用目前仍有争议。近年来,单细胞组学技术的迅速发展为阐明造血微环境的细胞和分子的异质性提供了新方法,为造血微环境的研究翻开了新的篇章。该文就单细胞转录组测序技术在骨髓微环境研究领域的最新进展进行综述。     

巨细胞病毒感染对多向造血祖细胞体外增殖的影响

探讨人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)对脐血多向造血祖细胞(CFU-Mix)体外增殖的抑制作用,采用造血祖细胞体外半固体培养技术,培养、观察、计数HCMV-AD_(169)株对脐血CFU-Mix集落产率、抑制率、集落峰值时间和集落维持时间;用聚合酶链反应(PCR)技术检测集落细胞内HCMV-DNA。结果发现HCMV-AD_(169)株感染的CFU-Mix集落产率较对照组明显减少(P<0.01),集落产率随病毒感染滴度的增高而减少,抑制率随病毒滴度的增高而逐渐增加:各组CFU-Mix集落峰值时间为10～12d(P>0.05),不同滴度病毒感染组集落维持时间(15～18d)较对照组(22～24d)明显宿短(P<0.01);经PCR检测病毒感染组,发现CFU-Mix集落细胞内有HCMV-AD_(169) DNA存在。因此认为多向造血祖细胞是HCMV的宿主细胞之一,HCMV-AD_(169)能直接感染多向造血祖细胞,抑制多向造血祖细胞的增殖和分化,此可能是临床HCMV感染患儿出现粒细胞减少、血小板减少和贫血的主要原因。     

胚胎期造血干细胞发育的分子调控

造血干细胞是生物体所有血细胞的原始祖细胞,在维持血液系统长期稳定的同时,也是骨髓移植治疗恶性血液疾病的核心所在。因此,造血干细胞的体内发育和体外诱导扩增一直是倍受科学界关注的热点课题。该研究组以小鼠和斑马鱼为模型,从遗传调控和表观遗传修饰等角度阐释造血干细胞产生、维持和定向分化的分子调控机制;同时,揭示微环境在血液发生不同阶段的特异性调控作用。     

巨细胞病毒感染对多向造血祖细胞体外增殖的影响

探讨人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus, HCMV)对脐血多向造血祖细胞(CFU-Mix)体外增殖的抑制作用,采用造血祖细胞体外半固体培养技术,培养、观察、计数HCMV-AD169株对脐血CFU-Mix集落产率、抑制率、集落峰值时间和集落维持时间;用聚合酶链反应(PCR)技术检测集落细胞内HCMV-DNA. 结果发现HCMV-AD169株感染的CFU-Mix集落产率较对照组明显减少(P<0.01),集落产率随病毒感染滴度的增高而减少,抑制率随病毒滴度的增高而逐渐增加;各组CFU-Mix集落峰值时间为10～12d (P>0.05), 不同滴度病毒感染组集落维持时间(15～18d)较对照组(22～24d)明显宿短(P<0.01);经PCR检测病毒感染组,发现CFU-Mix集落细胞内有HCMV-AD169 DNA存在. 因此认为多向造血祖细胞是HCMV的宿主细胞之一,HCMV-AD169能直接感染多向造血祖细胞, 抑制多向造血祖细胞的增殖和分化,此可能是临床HCMV感染患儿出现粒细胞减少、血小板减少和贫血的主要原因.     

人骨髓CD34^＋造血细胞体外扩增形成HPP—CFC造血祖细胞的能力

目的和方法：高增殖潜能集落形成细胞（ＨＰＰＣＦＣ）是表达ＣＤ３４＋ＤＲＬｉｎ－的最早期造血祖细胞之一,它在体外的增殖分化能力可反映造血干细胞的某些特征。结果：本文研究了人正常骨髓ＣＤ３４＋造血细胞在体外扩增和形成ＨＰＰＣＦＣ的能力。利用ＣＩＭＳ１００免疫磁性分离术首先获得＞９０％的ＣＤ３４＋造血细胞以富集ＨＰＰＣＦＣ。在含有Ｅｐｏ＋ＧＭＣＳＦ＋ＩＬ３＋ＩＬ６＋ＳＣＦ（简ＥＧＩＩＳ）的无基质液培条件下,ＣＤ３４＋造血细胞在四周内可持续产生单个核细胞和ＨＰＰＣＦＣ,并使其总量最高可达１７７０倍和８倍,以第２和３周为最佳时期,但不同个体ＣＤ３４＋造血细胞的这种能力差别较大。结论：高度纯化的人骨髓ＣＤ３４＋造血细胞能够在含有最佳组合造血生长因子的无基质液培条件下持续扩增,为临床应用提供了重要依据。     

造血干/祖细胞的体外扩增和临床应用

介绍造血干 / 祖细胞的体外培养和扩增取得的显著进展 :包括各种生物反应器的应用 ,三维培养系统的建立。扩增后的造血细胞在动物模型和临床上的应用已取得了初步成效。