逆转录病毒介导的HSV—tk在肿瘤基治疗中的应用

本实验将HSV－tk基因构建在逆转录病毒载体PLXSNnco上,经PA317包装后,筛选出5x10^5pfu/ml的TK包装细胞。用该细胞培养上清感染体外培养细胞,并用Ganciclovir-GCV处理,可以对增殖的细胞产生细胞毒害作用。细胞增殖速度越快,细胞毒害作用越强。在体内实验中,将TK细胞直接注射到移植瘤中或与瘤组织悬液混合接种同种小鼠,再用GCV治疗,对肿瘤有较强的生长抑制作用。     

HSV—tk／NAS系统基因治疗脑肿瘤中野生型腺病毒的检测及其安全性

在腺病毒介导的ＨＳＶ－ｔｋ／ＮＡＳ系统脑肿瘤基因治疗研究过程中,建立了野生型腺病毒（ＲＣＡ）的检测系统,主要包括腺病毒Ｅ１区的ＰＣＲ以及野生型病毒的细胞病理效应观察这两种方法,ＰＣＲ的灵敏度为１个２９３细胞所含有的Ｅ１片段数。对基因治疗脑肿瘤所采用的重组腺病毒ＡｄＴＫ及其感染的细胞进行ＲＣＡ的检测,没有发现ＲＣＡ。通过离体实验首次发现,重组腺病毒对脑肿瘤细胞的杀伤作用明显高于正常的脑胶质细胞;大鼠     

昆虫P-450基因特点及研究现状

细胞色素P－450在生物体内的重要作用和功能正日益受到人们的关注,尤其是在药物代谢和致癌机理的研究中引起了人们的广泛兴趣。人们对P－450的研究已深入到基因水平,目前被克隆测序的P－450cDNA已多达300种以上,而且不断有其在体外表达的报道。这主要基于把人、鼠、兔、猴、狗等高等动物作为研究对象[1,2]。虽然,人们很早就认识到P－450在昆虫体内代谢外源性物质和产生抗药性过程中的重要作用,但对昆虫P－450基因的研究起步较晚,目前尚只对少数几种昆虫的P－450研究深入到基因水平。本文简要介绍近年来昆虫P－450基因的研究现状…     

氮源受限条件下植物病原真菌氮调控基因表达特性

研究证实植物病害的发生往往是由于植物病原真菌分泌的效应子诱导引起的,在此过程中,调控效应基因表达能够了解病原菌的侵染过程。细胞的营养状况据推测对于效应基因的表达起着重要的作用。已有研究表明在氮胁迫条件下相同效应基因的诱导作用在植株体内和体外是一致的,表明氮源缺乏的环境在植物体进化的早期就已经存在了。文章阐述了在氮受限条件下真菌致病系统中效应基因调控机制及其已经发现的氮调节基因特异性表达研究结果,通过对比几个病原菌中氮调控基因的功能,比较寄主植物体内和体外在氮限制条件下基因的诱导效应,从而揭示出氮的有效性在寄主植物病害发展过程中起到重要作用。     

肿瘤自杀基因治疗中的“旁观者效应”

肿瘤自杀基因治疗中的“旁观者效应”伍志坚（第一军医大学生物化学教研室,广州５１０５１５）关键词旁观者效应自杀基因基因治疗在肿瘤的基因治疗研究中,将“自杀基因（ｓｕｉｃｉｄｅｇｅｎｅ）”导入肿瘤细胞以激活自杀机制的策略占有重要地位。这类自杀基因包括单纯...     

骨骼肌基因靶向转移研究进展

近年来,骨骼肌靶向基因转移主要有两条途径;一是间接体外基因修饰成肌细胞后将植入骨骼肌组织;二是直接体内骨骼肌内注射,原位转染成熟的非分裂肌细胞。间接体外实验周期长,临床适用性较差,但易获得较高水平和较长期的外源性基因的体内表达;直接体内法直接简便,接近临床应用的实际情况,本文对两条途径进行的基因免疫,基因治疗及外源性基因在骨骼肌中表达的调控有关进展进行了一综述。     

基因打靶技术的原理及操作

基因打靶是近几年发展起来的一种通过同源重组定点改变小鼠基因组特定位点的技术,其诞生是分子生物学与实验胚胎学方法相结合的产物,它的出现又导致了体内研究与体外研究、分子生物学与临床病理学的有机结合,为研究基因的体内功能和疾病的致病机理提供了一种有力的实验手段。本文以基因打靶的实验过程为主线,介绍该技术的原理、操作、进展和应用。     

间隙连接细胞间通讯与胸苷激酶系统 "旁观者效应"的关系及其调控

增强“旁观者效应”是提高单纯疱疹胸苷激酶／更昔洛韦(HSV-TK／GCV)基因系统治疗效果的关键手段,旨在探讨间隙连接细胞间通讯(GJIC)在HSV-TK／GCV系统“旁观者效应”中的作用及其化学调控。通过采用划痕标记染料示踪技术(SLDT)比较ACHN、HeLa、NIH-3T3、Cos-7及L-02等五种不同细胞系GJIC功能状况,四甲基偶氮唑盐酶反应比色法(MTT法)检测HSV-TK／GCV对其杀伤效应和“旁观者效应”,并比较GJIC上调剂apigenin和抑制剂18-α-glycyrrhetinic acid(AGA)对GJIC和“旁观者效应”的影响。结果表明,GJIC功能强大的NIH-3T3、Cos-7及L-02细胞对HSV-TK／GCV敏感性及“旁观者效应”程度远较GJIC功能低下的ACHN和HeLa细胞高(P＜0．001)。Apigenin可显著提高ACHN细胞GJIC功能,对HeLa细胞则无影响;相反,AGA可显著抑制NIH-3T3、Cos-7和L-02等三种靶细胞的GJIC功能。相应地,apigenin可明显提高ACHN细胞的“旁观者效应”而对HeLa细胞的“旁观者效应”则无影响,AGA则可明显降低上述三种细胞的“旁观者效应”。因此认为,细胞内在的GJIC功能与靶细胞对HSV-TK／GCV的敏感性和“旁观者效应”程度有正向关系,人为调控细胞GJIC后,“旁观者效应”程度亦发生相应改变。     

小鼠胚胎干细胞中MT—Ⅱ基因的定位改变

构建了小鼠MT－Ⅱ基因的定位整合载体pMT－Ⅱ6.7,这是一个置换型载体,它包含了6．7kb的与MT－Ⅱ基因及其旁侧序列同源的序列。用电穿孔方法将这一载体转化入小鼠ES细胞Mespu22中,在G418R、GancR的双抗性克隆中,用PCR方法进行筛选,从104个克隆中获得26个阳性克隆;对这26个克隆进行核型分析表明,其中有2个克隆,即克隆5－2和8-4的核型（2n=40,XY）正常率很高,达到84％和88％;进一步用Southern杂交分析,结果证明,在MT－Ⅱ基因位点确实发生了定位整合事件。利用这两个克隆的细胞进行体内、体外分化实验表明,它们具有体内、体外分化能力,进一步进行了嵌合体的制作,现已获得用克隆8-4细胞制作的嵌合体小鼠。     

转基因鱼：生物及技术方面的若干问题

随着70年代基因工程的迅猛发展,人们可以得到真核细胞的基因,通过体外实验也积累了结构与功能方面的大量信息,然而基因存在并起作用于活体内,仅仅依靠体外实验显然是不足取的。到80年代早期,产生了一项革命性的技术,这就是将外源基因显微注射到受精卵,产生携带外源基因的动物品系,并追踪该基因在体内的功能。这种携带有外源基因的动物称     

I型单纯疱疹病毒胸苷激酶真核表达载体的构建及其表达鉴定

为构建单纯疱疹病毒I型胸苷激酶(HSV1TK)的真核表达载体pcDNA3.1-EGFP/HSV1TK,鉴定其在真核细胞中的表达和功能.以pORF-HSV1TK为模板,PCR扩增的目的基因HSV1TK片段与pMD18-T载体相连接构建重组克隆pMD18-T/HSV1TK.再双酶切出HSV1TK片段,插入pcDNA3.1-EGFP多克隆位点,构建pcDNA3.1-EGFP/ HSV1TK真核表达载体并进行酶切、测序鉴定[1].分别用荧光显微镜观察和RT-PCR方法检测脂质体介导pcDNA3.1-EGFP/ HSV1TK在卵巢癌细胞SKOV3的表达;分别用MTT法和光镜检测胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV1TK/GCV)系统对SKOV3体外杀伤作用及旁观者效应.结果表明,重组载体酶切鉴定结果与预期结果一致,基因序列与GenBank上报道的HSV1TK基因序列完全一致.荧光显微镜观察转染后的细胞发出绿色荧光;RT-PCR结果表明HSV1TK基因能在SKOV3内有效表达.MTT和光镜结果显示转染HSV1TK基因的SKOV3细胞,加入前体药物丙氧鸟苷(GCV)处理后对其有明显的杀伤作用和旁观者效应.成功构建的真核表达载体pcDNA3.1-EGFP/ HSV1TK能在SKOV3细胞中稳定表达,且HSV1TK对卵巢癌细胞株SKOV3体外有强大的杀伤作用和旁观者效应.     

单纯疱疹病毒I型扩增子系列载体的构建

我们先前已报道了构建成一种能在ＨＳＶ ｔｓＫ株辅助下进行复制和包装,并表达β－半乳糖苷酶基因ｌａｃＺ的ＨＳＶ－１扩增子质粒ｐＨＳＬ,以及它的应用。该质料中依次含有ＨＳＶ－１复制起点ｏｒｉＳ序列及ＩＥ６８启动子、ｌａｃＺ基因、ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ、ＨＳＶ－１包装信号‘ａ’序列和大肠杆菌质粒骨架。然而,该质粒中的报告基因ｌａｃＺ无法用简单的酶切方法卸载下来,继而装入目的基因。本研究在此基础上,新构建了一     

细菌毒力基因体内表达检测技术研究进展

病原菌入侵宿主是一个及其复杂的过程。为了深入了解病原菌的致病机理,人们需要鉴定那些在感染过程中特异表达的细菌毒力基因。为此,多种体内实验模型被建立起来分析细菌在宿主体内的基因表达,它们包括了体内表达技术、信号标签突变技术、差异荧光诱导、体外转座进行基因组分析和作图技术以及体内诱导抗原技术等。文章对目前运用的这些研究方法进展进行综述,并讨论了它们的优点与不足。     

体内诱生抗原鉴定技术

体外不表达而只在体内才表达的基因称为体内诱导基因。研究表明,体内诱导基因涉及病原菌在体内的生存和致病过程,因此有重要意义。最近提出的体内诱生抗原鉴定技术(invivo-inducedantigentechnology,IVIAT)就是用于筛选病原菌体内诱导基因的一种方法。该方法不使用动物模型,而是采用经病原菌体外表达抗原吸收处理的病人血清来检测病原菌的表达文库,从而筛选体内诱导基因;方法简便、快速。这些筛选得到的体内诱导基因有助于病原菌致病机制的研究,同时也能够为抗菌药物、诊断试剂及疫苗设计等研究提供潜在靶标。     

对小鼠ES细胞进行特异性的标记

虽然ES细胞技术的应用十分广泛,对ES细胞多能性本质的研究还不是很深入,体外培养的ES细胞群体的不均一性加大了这方面研究的难度,报道了对ES细胞中特异表达的基因,将报告基因βgeo插入oct-基因转录元件中构建了标记载体pG18NG,转染ES细胞MESPU22和MESPU13后获得了稳定整合的细胞克隆,经体外培养、诱导分化、嵌入体制作等实验,证明利用该载体对ES细胞中的未分化细胞成功进行了标记,该标记在体内、体外都是有效的。     

肿瘤特异表达的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因对人肺腺癌的实验治疗

利用CEA(癌胚抗原)只在肺腺癌中表达,而不在正常肺组织中表达的特点,构建了由CEA启动子控制的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)的逆转病毒载体(pCEATK),然后将pCEATK导入表达CEA的人肺腺癌细胞GL和不表达CEA的HeLa细胞,在体内外观察了Ganciclovir(GCV)的治疗效果和“旁观者效应”.结果表明pCEATK只在表达CEA的肺腺癌GL细胞中特异表达,而不在HeLa细胞表达;GL的pCEATK转染细胞对GCV的敏感性增加了992倍,在裸鼠体内GCV也可以明显抑制GL转染细胞的生长,并有明显的“旁观者效应”现象;而HeLa的pCEATK转染细胞体内外对GCV的敏感性没有明显变化.这提示由CEA启动子控制的HSV-TK的逆转病毒载体对表达CEA的人肺腺癌的基因治疗可能是治疗人肺腺癌的有效方法.     

磁处理对植物早期代谢的影响

磁生物学效应是多层次、多角度、多方面的综合表现。国内外有关磁效应机理的研究多为体外模型或假说,未见体内代谢变化方面系统工作的报道。本文对植物进行磁场和磁水处理试验,测定了早期发育过程中cAMP,ATP和核酸含量的变化,试图从代谢角度对磁作用机理做初步探讨。     

自杀基因治疗的作用机制及其应用

自杀基因治疗已逐渐成为肿瘤等疾病基因的治疗中的一种重要方法,本文介绍了ＴＫ,ＣＤ等几种常见的自杀基因,并概述了自杀基因治疗中的旁观者效应,基因转移系统靶向性研究及自杀基因治疗在肿瘤,骨髓移植,心血管疾病等领域中的应用。     

人mda-7／IL-24的抗肿瘤作用机制

mda-7／IL-24是20世纪90年代中期发现的一个新基因。由于mda-7／IL-24与人IL-10家族具有相当的同源性,后来HUGO基因命名委员会将之重新命名为IL-24,并将其归类到IL-10家族。近年研究表明,采用复制缺陷的腺病毒表达载体Ad．mda-7使其在肿瘤细胞异位表达,引起多种肿瘤细胞的生长抑制。尽管mda．7／IL-24肿瘤靶向性的作用机制还不是很清楚,但大量的实验结果表明该基因作为一个有效的肿瘤治疗基因,能够区分正常细胞和肿瘤细胞、诱导各种不同肿瘤细胞凋亡、启动抗肿瘤“旁观者效应”、增强肿瘤细胞对射线敏感性、抑制动物模型体内移植瘤的生长和血管新生以及具有调节免疫应答能力。     

寡核苷酸诱导的定点突变

蛋白质工程是生物技术中正在开发的一个新领域。由于它是一门从改变基因入手,制造新的蛋白质的技术学科,因此改变基因的方法就成为蛋白质工程的主要内容之一。 十年来由于重组基因和DNA序列分析方法得到成功,因此很多科学家的注意力都集中到研究DNA编码区域序列结构与功能的关系,发展了各种体内,体外突变方法。改变某一特定区域的DNA结构,用以确定DNA特定区域的功能。