拟南芥转录因子NF-YC的原核表达及多克隆抗体制备

采用PCR方法扩增NF-YC基因得到其全长cDNA序列,并将其克隆至原核表达载体pET-48b中,在大肠杆菌BL21中用IPTG诱导出分子量约为45 kD的融合蛋白,SDS-PAGE和Western blotting检测鉴定表达产物。利用亲和层析技术对融合蛋白进行纯化,纯化后的目的蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。间接ELISA检测抗体效价大于1 62 500,Western blotting结果显示,该抗体可特异性识别NF-YC蛋白。     

拟南芥转录因子DYT1的原核表达与多克隆抗体制备

以拟南芥雄性不育突变体ms157为材料,对其转录因子DYT1的原核表达进行了分析及多克隆抗体的制备.结果表明:构建的原核表达载体转化入BL21菌株后,经IPTG诱导,表达了分子量约为50 kD的重组蛋白.SDS-PAGE检测结果表明,该重组表达蛋白以可融性形式表达.用该蛋白作为抗原注射新西兰兔后,成功获取了多克隆抗体.Western blotting证实其具良好的免疫原性,ELISA结果表明融合蛋白的效价大于1:5 120.     

人类新型Krueppel类转录因子hBKLF的cDNA克隆、亚细胞定位及表达特征

人胎肝cDNA文库FLD4585克隆可能编码一种造血相关的转录因子,本文旨在从22周孕龄人胎肝中获得其编码基因的全长cDNA序列,分析其编码蛋白的功能域、基因组结构、染色体定位、亚细胞定位及表达谱特征。采用5′RACE方法获得FLD4585克隆全长;生物信息学方法确定hBKLF基因结构、染色体定位及功能域特征;GFP融合蛋白技术确定hBKLF亚细胞定位;Northern杂交、RT-PCR、Western印迹方法分析其表达谱。结果获得了Fld4585克隆编码的hBKLFcDNA全长序列,它含1810bp,编码345个氨基酸,与小鼠BKLF同源,C端含3个特征性C2H2结构的锌指,是KLF转录因子家族的新成员。HBKLF基因跨越33kb,含6个外显子和5个内含子,位于4号染色体4p15.2-p16.1。GFP-hBKLF融合蛋白在COS-7细胞中呈细小点状分布于核内,核仁区无分布。HBKLF含有两个转录本,大小为4.4kb-7.5kb和1.35kb-2.4kb。大转录本在成人及胎儿组织广泛表达,小转录本在外周血白细胞、肝脏和骨髓表达量最高,红系和粒系细胞均表达hBKLF。HBKLF表达量随肝脏发育成熟而下降,随红系、粒系成熟而升高。以上研究提示hBKLF可能是一种在体内广泛发挥作用的转录因子,在造血的调控中可能有重要作用。     

新型转录因子MDFIC的原核表达及多克隆抗体制备

小鼠MDFIC(MyoD family inhibitor domain containing) 蛋白是一个新近发现的与HIC(Human I-mfa domain containing protein)高度同源的转录调控因子,可能在肌细胞的分化过程中起着重要的作用。为了深入研究MDFIC的功能,首先要制备抗MDFIC的多克隆抗体。首先采用PCR方法扩增出编码MDFIC的cDNA片段,然后将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-3, 并在大肠杆菌BL21中进行诱导表达。SDS-PAGE 和Western blotting 检测鉴定表达产物。亲和层析技术对融合蛋白进行纯化,纯化后的目的蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。间接ELISA检测抗体效价达1∶640 000以上,检测证明抗体效价较高。此外, Western blotting结果显示, 该抗体可特异性识别真核细胞外源性及内源性的MDFIC蛋白。MDFIC多克隆抗体的成功制备为进一步研究MDFIC的功能以及进一步探索肌细胞的发生分化机制提供了重要工具。     

人生长分化因子15的原核表达、纯化与多克隆抗体制备

目的:原核表达并纯化、鉴定人生长分化因子15(GDF-15),制备其多克隆抗体。方法:从人结肠癌细胞系HT29的cDNA扩增出GDF-15基因片段并插入pET-32a(+)原核表达载体,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达重组GDF-15,用镍亲和柱纯化,SDS-PAGE、Western印迹鉴定重组蛋白。用纯化的重组GDF-15免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,鉴定并检测其效价。结果:制备了pET-32a(+)-GDF-15表达载体;经IPTG诱导重组蛋白表达后,采用Ni亲和柱纯化蛋白,并经SDS-PAGE和免疫印迹鉴定;免疫BALB/c小鼠后获得了GDF-15多克隆抗体,ELISA检测抗体效价为1∶100000,并应用于肿瘤细胞的GDF-15检测中。结论:用基因工程和免疫学方法制备了重组人GDF-15及其多克隆抗体,为后续的分子机制和靶向治疗研究奠定了基础。     

人硫氧还蛋白cDNA的克隆、表达及其多克隆抗体制备

目的 制备硫氧还蛋白1 （thioredoxin-1,Trx-1）多克隆抗体.方法 从乳腺癌细胞系MCF-7中用RT-PCR的方法得到了Trx-1全长基因,将它克隆到原核表达载体上进行大量的表达和纯化,纯化的蛋白对新西兰大白兔进行背部多点注射,40 d后取其血清用梯度饱和硫酸铵沉淀的方法进行多克隆抗体的纯化.用ELISA和Western印迹实验测定抗体效果.结果 成功获得了Trx-1全长cDNA,通过原核表达得到了大量Trx-1蛋白,并制备了高效价的多克隆抗体.结论 此多克隆抗体对Trx-1蛋白具有良好的识别能力,可以应用于Trx-1的功能研究.     

拟南芥DREB 1A转录因子的原核表达和多克隆抗体制备

采用PCR技术,从质粒pCAMBIA 1301/DREB 1A中扩增拟南芥DREB 1A转录因子的编码序列,并将其插入原核表达载体pGEX-4T-1中诱导表达,获得分子量约50.4 kDa的融合蛋白,经融合蛋白纯化酶切后免疫家兔获得DREB 1A转录因子特异性的多克隆抗体,经酶联免疫吸附测定表明,所制备的多克隆抗体的稀释倍数为25 600时,显色仍清晰可见。     

转录因子hB1F的融合表达及抗体制备

通过酵母单杂交系统从成人肝库中克隆到转录因子,即人Ｂ１结合因子（ｈＢ１Ｆ）。ｈＢ１Ｆ是核受体超家族的一个新成员。将ｈＢ１Ｆ的ｃＤＮＡ片段（ｎｔ４５０－９３０）克隆到表达载体ｐＧＥＸ－３Ｘ中,在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达,得到可溶性的蛋白质产物。免疫小鼠获得多克隆抗体,经ＧＳＴ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ反向亲和纯化后,表现出较好的针对ｈＢ１Ｆ的专一性,可以用于对ｈＢ１Ｆ的进一步的结构和功能的研究。     

RNA病毒感染性转录体的制备

构建感染性转录体已成为研究ＲＮＡ病毒复制,表达,致病机制等的有力工具。感染性转录体可通过ｃＤＮＡ克隆经体内或体外转录获得,也可通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增产物直接转录获取。ＤＮＡ聚合酶引起的点突变、ｃＤＮＡ克隆的稳定性,转录体长度多态性、病毒基因组的５‘和３’端序列等均可影响转录体的感染性。     

小麦类脱水素的表达、纯化及多克隆抗体的制备

脱水素在胚胎发育后期累积,外源脱落酸(ABA)、低温、干旱和其他一些环境条件下能诱导脱水素的产生,尽管植物在脱水条件下脱水素广泛存在于细胞中,但其生化功能仍不清楚.为研究小麦在不同时期脱水素基因的表达情况和生物学功能及抗体制备,以小麦幼芽为材料,经干旱胁迫处理后,提取总RNA,通过RT-PCR得到小麦类脱水素基因片段(WZY1-1),再连接至克隆载体PUCM-T,并成功构建重组表达质粒PET-32a( )-wzy1-1,将阳性重组质粒转化于受体菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达,进行表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测.结果表明,表达蛋白位于37ku处,小麦类脱水素基因获得高效表达.表达蛋白经Ni2 琼脂糖凝胶亲和层析和透析袋电洗脱法纯化后,对兔子进行免疫,制备的抗血清通过ELISA检测到较高的多克隆抗体效价.蛋白质印迹结果显示,利用纯化的蛋白质制备的兔抗血清可以很好地和所表达的蛋白质带特异性结合,且郑引1号小麦幼苗进行干旱处理,提取粗蛋白,SDS-PAGE,蛋白质印迹检测显示,在分子质量28ku处出现特异的蛋白质条带,这说明所制备的抗血清可以与小麦叶片所表达的dehydrin蛋白特异性结合,证明其具有良好的免疫原性.     

多功能转录因子CTCF研究进展

CTCF是一种多功能的真核转录因子,它可以抑制c—myc基因的表达,增强app基因的启动子活性,调控H19／Igf2的印记,作为鸡β-球蛋白等多个基因结构域的绝缘子成分,以及作为X染色体失活的候选蛋白等。CTCF与BORIS的交互表达和雄性生殖细胞的系统发生有关。CTCF的缺失和突变可能导致肿瘤的发生。     

多功能转录因子CTCF结构域的转录活性研究

目的:CTCF是广泛存在于真核生物中的多功能转录因子。利用细胞瞬时表达实验在HeLa细胞系中研究CTCF各结构域的转录活性。方法:借用CheckMate哺乳动物双杂交系统的2个质粒pBIND和pG5LUC,将CTCF的N、M、C段及全长编码序列克隆至pBIND质粒的GAL4DNA结合结构域编码序列后的多克隆位点,将表达GAL4DNA结合结构域-CTCF融合蛋白的pBIND重组质粒与由腺病毒晚期主要启动子控制的报告基因质粒pG5LUC共转染HeLa细胞系,检测CTCF各结构域对报告基因表达水平的影响。结果:转染含CTCFN段的质粒可使报告基因的表达量增长至3.5倍以上;转染含CTCF其他片段的质粒对报告基因的表达没有明显的影响。结论:在HeLa细胞中,对启动子具有转录激活活性的主要是CTCF的N段,而M段和C段几乎没有转录激活活性。     

O-GlcNAcase抗原片段的选择、优化表达和多克隆抗体的制备

为了探讨O-GlcNAc修饰的生物学作用和相关疾病的发病机理,需制备高效、专一的O-GlcNAcase (OGA) 抗体。通过对人源OGA蛋白进行序列分析发现,氨基端1~350 aa片段 (sOGA) 抗原性和亲水性较强,将该片段构建至原核表达载体pET-28a,并在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3) 中进行诱导表达,通过优化IPTG浓度 (0.05 mmol/L) 和诱导时间 (10 h) 获得了高可溶性表达的重组蛋白酶。采用Ni-NTA亲和层析和分子筛层析对重组蛋白进行了纯化,SDS-PAGE检测分子量的大小 (45 kDa) 和纯度 (95％以上)。以4-MU-O-GlcNAc为荧光底物,检测到sOGA的糖苷酶活性为106 nmol/(min·mg),表明该片段是OGA糖苷酶的活性区域。以此片段作为抗原免疫新西兰大白兔,以CNBr活化Sepharose 4B微珠纯化抗血清制备OGA特异性多克隆抗体。Western blotting和ELISA检测表明,该抗体可以特异识别含有OGA糖苷酶活性区域的多种变体,检测灵敏度为0.11 ng/mL (效价为1∶80 000),可应用于O-GlcNAcase生物功能研究。     

冠突散囊菌转录因子stf1基因的克隆及其表达分析

利用RACE技术获得了冠突散囊菌stf1基因的全长DNA序列。该序列全长3 029bp,开放阅读框长度为2 664bp,从114–2 908bp,在253bp处含有一个131bp的内含子,预测编码887个氨基酸。同源分析结果表明该基因与Snd1/p100转录因子同源。应用相对定量SYBR Green I荧光定量PCR技术对stf1基因在不同发育时期的表达量的差异进行了检测。结果表明,这个基因在子囊孢子时期的表达量最高,在分生孢子时期的表达量最低,相比子囊孢子时期下降了1倍。为深入研究冠突散囊菌的产孢调控机制奠定了一定的基础。     

利用RNA干扰抑制HeLa细胞中CTCF基因的表达

目的:CTCF是一种多功能的转录因子,参与启动子调控、绝缘子功能和遗传印记等过程。利用RNA干扰技术抑制CTCF在体细胞中的表达。方法:以CTCF为靶基因,利用ShortCutRNaseⅢ切割体外转录的长双链RNA制备esiRNA,转染HeLa细胞,用RTReal-TimePCR检测CTCF的mRNA水平,用免疫印迹检测CTCF水平。结果:转染CTCFesiRNA后,细胞内的CTCFmRNA被抑制了70%左右,CTCF水平明显下降。结论:CTCF的esiRNA可以明显抑制CTCF在HeLa细胞中的表达,从而为进一步研究CTCF的未知功能打下了基础。     

D1蛋白酶的克隆表达、纯化、生物活性测定及多克隆抗体的制备

为了开发以D1蛋白酶作为靶标的新型除草剂,需要对先导化合物的生物活性进行检测和筛选。从菠菜中提取总RNA,逆转录合成cDNA,采用PCR扩增了CtpA的基因,连接至表达载体pET-28a中,构建了重组表达质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行高效表达,通过降低IPTG和诱导温度获得了可溶性表达的重组蛋白酶。采用Ni-NTA亲和层析和凝胶过滤柱层析对重组蛋白进行了纯化,SDS-PAGE和Western blotting结果证实目的蛋白为含有His-tag的融合蛋白。以合成的D1前体蛋白羧基端24肽作为模拟底物,采用高效液相色谱法测定了其水解活性,结果表明活性可达1.10nmol/(mg·min),为文献报道数据的15倍。纯化后的CtpA蛋白免疫日本的长耳大白兔制备多克隆抗体,ELISA法测定其血清抗体的效价高达1:100000。该结果为抑制剂先导化合物的筛选和酶蛋白与化合物的作用机理研究提供了必要的基础。     

棉铃虫转录因子c-Myc基因在滞育和非滞育蛹脑中的表达分析及多克隆抗体制备

【目的】c-Myc是近年来研究较多的转录因子,也是受Wnt/β-catenin信号通路调节的重要靶标。本研究旨在克隆棉铃虫 Helicoverpa armigera c-Myc基因,从核酸水平初步调查 c-myc 在滞育和非滞育蛹脑中的表达情况,同时制备其蛋白的多克隆抗体。【方法】通过RACE方法克隆棉铃虫 c-myc 基因的cDNA,运用RT-PCR方法比较滞育和非滞育蛹脑中Har-c-myc基因的表达情况。根据获取的序列构建原核表达载体,在大肠杆菌 Escherichia coli 中进行表达,纯化后免疫新西兰兔,制备了多克隆抗体。【结果】克隆了棉铃虫 c-myc 基因,核酸水平的研究表明滞育蛹脑中 c-myc 表达水平明显低于非滞育蛹脑。成功地在大肠杆菌中表达了c-Myc部分肽段并通过镍柱纯化获得了较纯的重组蛋白。制备的c-Myc抗体效价达到了1:125 000。【结论】滞育蛹脑中 Har-c-myc 的表达下调。获得了抗棉铃虫c-Myc的多克隆抗体。本研究的成果为后续进一步深入研究棉铃虫Wnt/β-catenin信号通路在棉铃虫发育中的作用奠定了基础。     

琥珀蚕丝腺转录因子基因AaSGF-1的克隆、原核表达及组织表达分析

[目的]本研究旨在克隆琥珀蚕Antheraea assama丝腺转录因子基因AaSGF-1,分析其序列特征及表达模式并制备多克隆抗体,为探讨该基因的生理功能奠定基础.[方法]采用RT-PCR和RACE技术从琥珀蚕丝腺中克隆AaSGF-1的cDNA序列,并进行生物信息学分析;利用qPCR检测AaSGF-1在琥珀蚕5龄第4...