水通道蛋白AQP2翻译后修饰及表达调控

AQP2(aquaporin-2)是一种水通道蛋白,表达于集合管的主细胞,其活性主要受抗利尿激素(arginin vasopressin,AVP)调控。AVP调节的AQP2数量和细胞内定位在维持机体水代谢平衡和尿液浓缩中发挥着决定性的作用。AQP2受多种修饰,如磷酸化、泛素化、糖基化等。本文根据最新的文献报道,着重介绍了AQP2翻译后修饰及调控机制。     

大鵟肾脏组织结构及相关活性物质的表达

应用生物显微技术及免疫组织化学方法,对大鵟肾脏的组织结构进行观察,检测了AQP2、AQP3和Bax、Bcl-2蛋白在肾脏中的表达.结果 表明,大鵟肾脏红褐色,表面覆以极薄的结缔组织膜,无肾脂囊.相对体积比哺乳类大,占体重的2.1%.肾小球毛细血管分支少,结构简单.但是肾小球单位面积上的数目比哺乳类多,这对于在旺盛的新陈代谢过程中,迅速排除废物、保持水盐平衡是有利的.集合管是尿重吸收的重要部位,上皮细胞有AQP2、AQP3免疫反应阳性表达,提示AQP2和AQP3对大鵟肾脏水的平衡有重要的调节作用.近曲小管上皮细胞有Bax和Bcl-2免疫反应阳性表达,说明Bax和Bcl-2的协同表达参与正常大鵟肾脏细胞凋亡的调控.     

子午沙鼠子鼠肾中水通道蛋白1、2的表达

应用免疫组织化学方法和体视学半定量方法检测了水通道蛋白1、2(aquaporin 1,2)在子午沙鼠(Meriones meridianus)子鼠肾中的表达,利用IPP专业图像分析软件对其表达强度进行了定量分析。结果显示,1、7、14、21、32日龄子午沙鼠仔鼠肾均有水通道蛋白1、2的阳性表达,AQP1表达部位为肾近曲小管上皮细胞的顶质膜和基底膜、髓袢细段;AQP2的表达位于集合管主细胞的游离面细胞膜;7日龄子午沙鼠仔鼠肾AQP1阳性表达的面密度增加显著(P0.05),光密度增加极显著(P0.01),7日龄子午沙鼠仔鼠肾AQP2阳性表达的面密度和光密度增加极显著(P0.01),7日龄后无差异(P0.05)。结果表明,7日龄后子午沙鼠子鼠肾AQP1、2的表达水平增强,近曲小管与髓袢细段、集合管对水的重吸收增强,以浓缩尿液,AQP1、2对子鼠尿的浓缩起重要作用,从而调节肾水的平衡。     

虎鼬肾组织结构及水通道蛋白1,2 的表达

<正>虎鼬(Vormela peregusna)属哺乳纲(Mammalia)食肉目(Carnivora)鼬科(Mustelidae)虎鼬属(Vormela),是虎鼬属唯一一种小型哺乳动物,主要分布在东欧到中国西部的广大干燥地区,主要以啮齿动物为食(雷刚等,2009)。目前国内外有关虎鼬的研究比较少,包括核型分析(许可芬和高行宜,1986)、分子遗传学研究(Rozhnov et al.,     

新型冠状病毒S1蛋白的表达及活性鉴定

旨在获得具有免疫活性的SARS-CoV-2S1蛋白,为COVID-19的免疫预防及临床诊断提供较好的候选抗原.该研究利用PCR技术扩增出刺突蛋白(Spike,S)的S1亚基序列,通过同源重组法将目的片段克隆至冷休克表达载体pCold I,转化至大肠杆菌BL21感受态细胞内诱导表达S1蛋白,经Ni2+柱亲和层析纯化后,通...     

黑胸大蠊浓核病毒NS2蛋白的表达、抗体制备及亚细胞定位

ns2是黑胸大蠊浓核病毒的一个非结构基因, 所编码的蛋白质大小为30 kD, 是一个功能未知的基因。为了对该基因进行深入的功能研究, 从感染了黑胸大蠊浓核病毒的蟑螂的后肠组织中通过RT-PCR得到ns2基因编码序列, 将其构建于原核表达载体pET-28a, 转化大肠杆菌BL21(DE3) 获得融合表达产物。此融合蛋白经分离纯化后, 免疫新西兰大白兔, 制备其多克隆抗体。采用Western印迹技术, 用该抗体检测ns2基因的真核表达产物, 证明该抗体有较好的针对NS2蛋白的专一性, 可用于对NS2结构和功能的研究。同时, 将此编码序列克隆至果蝇细胞表达载体pAC, 得到重组质粒后转染果蝇S2细胞表达重组蛋白, 通过共聚焦显微镜用该抗体检测该蛋白在S2细胞中的亚细胞定位, 发现NS2蛋白主要定位于细胞质, 核内仅有少量分布。     

体外培养的小梁细胞表达水通道蛋白-1

目的观察体外培养条件下的牛眼小梁细胞(bovine trabecular meshwork cell,BTMC)是否表达水通道蛋白-1(Aquaporin-1,AQP-1)。方法采用免疫组织化学方法检测AQP-1在BTMC上的表达,并进行半定量分析。结果正常BTMC可见AQP-1蛋白表达,其灰度值为:167.94±1.18;阴性对照为:195.64±1.62,统计学分析其差异具有显著性(P<0.05)。结论在体外培养条件下,BTMC表达AQP-1,这有助于在体外条件下研究房水流出阻力、并探讨青光眼的药物治疗。     

小鼠cofilin2蛋白的原核表达及纯化

[目的]构建小鼠cofilin2原核表达载体并纯化表达产物。[方法]以胚胎期小鼠心脏组织的c DNA为模板PCR扩增cofilin2基因,经酶切连接表达载体PGEX-4T-1后转化入大肠杆菌E. coli BL21感受态细胞中,利用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达及优化,利用SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝R-250进行染色,检测GST-cofilin2的表达情况。通过谷胱甘肽树脂(Glutathione Resin)亲和层析进行纯化,最后通过Western Blot进行验证。[结果]PCR成功扩增cofilin2基因,双酶切及测序结果表明p GEX-4T-1-cofilin2原核表达载体构建成功,SDS-PAGE鉴定表明,在22℃、200μmol/L的IPTG能诱导出大量可溶性的GST-cofilin2蛋白,分子量为43 k Da。Western Blot验证得到纯化的GST-cofilin2。[结论]成功构建小鼠cofilin2原核表达载体,纯化得到的重组小鼠cofilin2蛋白可用于后续的生物学研究。     

HIV-1 CAP2NC蛋白的表达及体外自组装

构建并表达HIV-1 CAP2NC蛋白,探索其体外自组装条件。通过PCR技术扩增HIV-1(NL4-3毒株)CAP2NC基因片段,并将其连接到原核表达载体pTO-T7,获得重组质粒pTO-T7-CAP2NC,然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经疏水层析纯化后获得重组蛋白CAP2NC。SDS-PAGE结果表明,重组蛋白CAP2NC可在大肠杆菌可溶高效表达,经纯化后纯度约为95%。ELISA检测表明重组蛋白CAP2NC可被HIV-1衣壳蛋白特异性单克隆抗体识别,具有较好反应活性。重组蛋白透析后在非原性SDS-PAGE中呈现为多种聚体形式。分子筛排阻层析分析CAP2NC蛋白透析后可进行组装,负染电镜进一步观察显示CAP2NC蛋白在RNA存在条件下,可形成空心管状颗粒,其形态结构与HIV-1病毒衣壳体外自组装形成的类似。上述结果表明HIV-1 CAP2NC蛋白具有体外自组装的性质,为进一步在体外研究非成熟病毒样颗粒结构奠定基础。     

大鳞副泥鳅和泥鳅GNB2L1基因的克隆、表达及系统进化分析

由G蛋白β2亚基类似物1基因(GNB2L1)编码的蛋白激酶C受体(RACK1)是一个高度保守的锚定蛋白,属于WD40结构域蛋白家族成员,在细胞信号转导等生命过程中发挥着重要作用。本文采用RACE技术和基因克隆技术分别对大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)和泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)精巢组织的GNB2L1基因c DNA序列进行了克隆。序列分析表明,大鳞副泥鳅GNB2L1基因c DNA序列全长1 115 bp,开放阅读框(ORF)长965 bp,编码317个氨基酸;泥鳅GNB2L1基因c DNA序列的开放阅读框长965 bp,编码317个氨基酸;两种泥鳅GNB2L1基因编码的蛋白与其他鱼类的RACK1蛋白的同源性为94%~97%,且不同进化地位物种的GNB2L1基因均由8个外显子和7个内含子组成。以GNB2L1基因为标记基因,构建的鱼类系统发育树显示,大鳞副泥鳅和泥鳅在进化上的亲缘关系最近。RT-PCR结果显示,GNB2L1基因在大鳞副泥鳅成体各组织中均有表达,且在脑组织的表达量高于其他组织。以上结果表明,GNB2L1基因为一个进化保守基因,可能在大鳞副泥鳅的细胞活动中发挥着重要作用。     

AQP1真核表达载体的构建及其在FRT细胞的表达

目的：构建小鼠AQP1基因真核表达质粒并观察其在FRT细胞中的表达。方法：采用RT—PCR方法从小鼠肾脏组织的总cDNA中扩增出小鼠的AQP1基因,采用基因重组技术将AQP1的cDNA片段插入真核表达载体pCAGGS,构建小鼠AQP1的真核表达质粒,脂质体转染FRT细胞进行表达。结果：酶切和测序结果证实AQP1真核表达质粒构建成功,经脂质体转染FRT细胞后,免疫荧光检测证明AQPI蛋白在真核细胞中成功表达。结论：成功构建真核表达质粒pCAGGS—AQP1-myc,并在FRT细胞中得以表达。为进一步研究小鼠AQP1过表达时的功能及机制奠定了实验基础。     

茶树水通道蛋白基因的克隆与表达分析

从茶树中克隆了6个水通道蛋白(aquaporin,AQP)基因的cDNA全长序列,根据序列相似性和系统进化分析结果,分别命名为CsNIP1;1、CsNIP5;1、CsPIP2;1、CsPIP2;2、CsTIP1;1和CsTIP2;2。氨基酸序列特征分析表明,6个基因的编码氨基酸序列长度在250~301个氨基酸残基,分子量在25.186~30.728kD之间;均为疏水性蛋白,并都含有6个跨膜螺旋;6个基因均含有MIP蛋白家族的特征序列HF/I/VNPA/SI/L/VTI/FA/G和NPA(Asn-Pro-Ala)基序,以及类似沙漏状的跨膜三级结构。荧光定量PCR分析显示:这6个基因在根、茎、叶和花中均表达,且在根中的表达水平最高,表明它们与茶树根系的物质转运密切相关;CsAQPs基因的表达受ABA、高盐、干旱和低温胁迫的调控,表明它们可能参与茶树抗逆响应。     

线虫抗凝血蛋白c2的融合表达及其抗凝活性分析

目的:在大肠杆菌中表达硫氧还蛋白-线虫抗凝血蛋白c2(Trx-NAPc2)融合蛋白,并检测其抗凝活性。方法:将扩增的NAPc2基因经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后连接到表达载体pET-32a中,转化至大肠杆菌BL21(DE3),分别经IPTG和乳糖诱导表达;表达产物经镍琼脂糖凝胶FF纯化后,用体外凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(aPTT)试验检测抗凝血活性。结果:构建了pET-32a/NAPc2表达质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,表达产物主要以可溶形式存在,纯化的Trx-NAPc2融合蛋白能明显延长PT及aPTT。结论:在大肠杆菌中高效表达了具有生物活性的Trx-NAPc2融合蛋白,为进一步研究NAPc2的功能及应用奠定了基础。     

鳜传染性脾肾坏死病毒主要衣壳蛋白基因的原核表达

根据鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV)主要衣壳蛋白(Major Capsid protein, MCP)基因(mcp)序列设计引物,PCR扩增得到一长约1400bp的DNA片段, 将其克隆到pGEM-T Easy Vector.氨基酸亲水性分析表明,在150-250位氨基酸之间亲水性很高,可构成主要抗原决定簇及形成跨膜区.mcp基因经PCR改造后克隆至原核表达载体pBV220,构建表达MCP的大肠杆菌基因工程菌,该工程菌经42℃诱导,SDS-PAGE检测,在约50kDa处有一特异蛋白带,含量约为菌体总蛋白的23%.用纯化和复性后的蛋白免疫新西兰大白兔制备抗血清,Western-blotting分析显示,重组MCP制备的抗血清能与ISKNV MCP特异结合,说明表达产物具有与ISKNV MCP相似的抗原特性.     

鳜传染性脾肾坏死病毒主要衣壳蛋白基因的原核表达

根据鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)丰要衣壳蚩白(Major Capsid protein,MCP)基因(mcp)序列设计引物,PCR扩增得到一长约1400bp的DNA片段,将其克隆到pGEM-T Easy Vector。氨基酸亲水性分析表明,在150—250位氨基酸之间亲水性很高,可构成主要抗原决定簇及形成跨膜区。mcp基因经PCR改造后克隆至原核表达裁体pBV220,构建表达MCP的大肠杆菌基因工程菌,该工程菌经42℃诱导,SDS—PAGE检测,在约50kDa处有一特异蛋白带,含量约为菌体总蛋白的23％。用纯化和复性后的蛋白免疫新西兰大白兔制备抗血清,Western—blotting分忻显示,重组MCP制备的抗血清能与ISKNV MCP特异结合,说明表达产物具有与ISKNV MCP相似的抗原特性。     

HIV-1 Vpu蛋白的原核表达、鉴定和纯化

目的：克隆、表达、纯化人免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）Vpu蛋白,为其功能及免疫学研究奠定基础。方法：PCR扩增Vpu基因,纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得表达工程菌株,IPTG诱导蛋白表达,免疫印迹鉴定目的蛋白,亲和层析纯化蛋白。结果：构建了HIV-1Vpu蛋白的原核表达载体Vpu-pET32a,并在大肠杆菌中高效表达,目的蛋白呈可溶性形式存在,免疫印迹检测显示为目的蛋白,经Ni—NTAAgarose纯化获得了高纯度的目的蛋白。结论：在原核表达系统中表达了可溶性HIV-1Vpu蛋白,为进一步进行HIV-1Vpu蛋白的免疫原性和功能研究奠定了基础。     

sTACI-Fc-Myc重组质粒的构建、原核表达及活性鉴定

目的:构建s TACI-Fc-Myc重组质粒,并进行原核表达和纯化具有生物活性的融合蛋白。方法:通过PCR法获得s TACI-Fc-Myc重组片段,然后把融合基因片段与原核载体p ET28a连接在一起,并构建p ET28a-s TACI-Fc-Myc重组子,并转入BL21(DE3)中进行表达,用蛋白A凝胶亲和层析柱进行纯化及酶联免疫吸附剂(ELISA)法测定其生物学活性。结果:获得了s TACI-Fc-Myc重组质粒,且该质粒可以在BL21(DE3)中表达,亲和层析柱纯化后纯度可达到95%以上,与BAFF的结合活性具有剂量依赖性,浓度达到5 ng/μL时,两者的吸附达到饱和。结论:成功构建了s TACI-Fc-Myc原核表达载体,并使有生物学活性的融合蛋白在BL21(DE3)上获得了稳定表达,为进一步研究并筛选高活性BAFF拮抗肽奠定了基础。