猪IGF-I基因荧光定量PCR标准曲线的建立

目的建立用荧光定量PCR方法检测猪IGF-Ⅰ基因表达量的标准曲线.方法根据自己克隆的猪IGF-Ⅰ(GenBankNo.DQ784687)基因mRNA序列,设计合成引物和探针,采用Taqman探针荧光定量RT-PCR的检测方法,构建检测猪IGF-Ⅰ基因表达量的标准曲线.结果由pMD-18TIGF-Ⅰ所构建的标准曲线线性关系良好(反应体系中含1×102～1×106拷贝猪IGF-Ⅰ基因分子时,扩增反应Ct值与拷贝数的对数呈线性关系)、灵敏度高(可检测出低于10个拷贝/μL的样品)、特异性强、准确可靠.结论成功构建了用荧光定量RT-PCR方法检测猪IGF-Ⅰ基因表达量的标准曲线.     

猪IGF-Ⅰ基因荧光定量PCR标准曲线的建立

目的:建立用荧光定量PCR方法检测猪IGF-Ⅰ基因表达量的标准曲线。方法:根据自己克隆的猪IGF-Ⅰ(GenBankNo.DQ784687)基因mRNA序列,设计合成引物和探针,采用Taqman探针荧光定量RT-PCR的检测方法,构建检测猪IGF-Ⅰ基因表达量的标准曲线。结果:由pMD-18T IGF-Ⅰ所构建的标准曲线线性关系良好(反应体系中含1×102~1×106拷贝猪IGF-Ⅰ基因分子时,扩增反应Ct值与拷贝数的对数呈线性关系)、灵敏度高(可检测出低于10个拷贝/μL的样品)、特异性强、准确可靠。结论:成功构建了用荧光定量RT-PCR方法检测猪IGF-Ⅰ基因表达量的标准曲线。     

转基因大豆、玉米、油菜和水稻品系特异性检测质粒标准分子的快速构建及应用

本文采用重叠延伸PCR技术快速构建了转基因大豆GTS40-3-2、玉米NK603、油菜RT73和水稻TT51-1的4种品系作物的质粒标准分子.经快速PCR鉴定及测序分析验证后,将构建的阳性质粒标准分子应用于实时荧光定量PCR标准曲线的构建,并建立其相应的荧光定量PCR检测体系,同时对该体系的扩增效率、精确度、灵敏度等指标进行了评估. 结果显示,建立的实时荧光定量PCR检测体系中,目标序列的扩增效率均在97.434%~101.479%正常范围内（R2≥0.995）,定量极限为20 copies,表明我们已成功构建了这4种转基因作物的品系质粒标准分子,并能有效应用于实时荧光定量PCR标准曲线的构建.     

RT-PCR检测毕赤酵母外源β-甘露聚糖酶基因拷贝数

利用荧光定量PCR方法检测毕赤酵母外源β-甘露聚糖酶基因(man)拷贝数。以毕赤酵母中高度保守基因三磷酸甘油醛脱氢酶基因(gap)为内参基因,分别构建含有gap和man的克隆质粒,进行RT-PCR反应构建gap和man双标准曲线;获得的双标准曲线具有良好的重复性,其相关系数(R2)均为0.999,其扩增效率分别为105.1%和102.2%。提取含有外源man基因的毕赤酵母基因组进行RT-PCR检测,通过双标准曲线计算出外源man基因的拷贝数。结果显示:预先经过博莱霉素(Zeoicn)抗性筛选得到的10株毕赤酵母重组菌株中含有1、2、3、4、5和7个不等拷贝的β-甘露聚糖酶基因。结果表明该方法能够高效快速筛选和鉴定出含有不同外源β-甘露聚糖酶基因拷贝数的毕赤酵母重组菌株。     

汉坦病毒S基因的克隆及体外转录

目的:通过基因克隆和体外转录,获得汉坦病毒汉滩型76118株及汉城型R22株S基因的RNA全长cRNA,为汉坦病毒病原学检测提供阳性定量标准品。方法:设计汉滩型76118株和汉城型R22株S基因克隆引物,PCR获得相应片段,分别克隆至含双启动子的PCRⅡ载体中,测序鉴定无误后,重组质粒分别经内切酶SpeⅠ、SacⅠ线性化,用T7 RNA聚合酶进行体外转录,产物经DNase处理、纯化后测定浓度,经RT-PCR验证。结果:获得汉滩型76118株及汉城型R22株S基因的cRNA片段,并可准确定量其拷贝数,76118株和R22株的质量浓度分别为80、17.58 ng/μL。结论:获得的cRNA样品可作为汉坦病毒核酸快速检测方法的阳性定量标准品。     

实时荧光定量PCR检测凡纳滨对虾proPO基因标准曲线构建

酚氧化酶原(proPO)系统属于一种酶联级系统,在凡纳滨对虾抵抗病原菌侵袭过程中具有重要作用。Real-time PCR检测技术已经成为国际上检测基因表达通用的方法,能对低丰度mRNA水平进行定量,可在体外对细胞活性进行评估,选择该方法进行外界环境因子胁迫下的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)组织proPO表达分析。在实时荧光定量PCR中,标准曲线法是最为简单、准确的定量方法。为了快速、准确的定量proPO基因在逆境下的表达水平,构建了正确、可靠的proPO基因表达标准品质粒和标准曲线。结果表明,该法所构建的标准曲线能够保证数据的精确性,满足实时荧光定量试验的要求,完全可以作为proPO基因荧光定量检测的参照标准。     

水稻赤霉素代谢关键酶基因表达的检测分析

赤霉素(GA)与水稻矮化突变体的产生有密切的关系.根据GenBank数据库中水稻赤霉素代谢关键酶基因的cDNA序列,在保守序列区域设计引物,经过反应条件优化,建立了相对定量RT-PCR双标准曲线检测方法,并对中9B及其体细胞无性系矮化突变体SV9B的相关基因表达情况进行了检测.结果表明,该方法设计的引物特异性强,所构建的标准曲线相关性好,实验具有很高的可信度,可以应用于水稻赤霉素相关突变体的研究.     

竞争RT-PCR法定量检测多药耐药基因的表达

由MDR1过度表达所介导的多药耐药性存在于多种肿瘤组织中,是降低化疗效果的主要原因之一,其耐受化疗药物的程度与MDR1的表达量呈正相关.准确测定MDR1的表达量在临床化疗过程中有重要的指导意义.建立了竞争RT-PCR定量检测MDR1表达的方法.首先构建含MDR1 cDNA片段的质粒,其携带的cDNA和靶cDNA有相同的引物结合区,但和靶cDNA长度上有区别（少58 bp）.把该cDNA在体外转录出的cRNA作为竞争PCR的内参照,该cRNA与靶RNA在同一体系内进行反转录和PCR过程,二者的PCR产物因长度不同可经电泳区分开.分析电泳结果,由已知的cRNA内参的量可计算出靶RNA的量,从而得到MDR1基因的绝对表达量.该方法具有灵敏、可靠、准确等优点.     

一个新的白血病相关基因LRP16全长cDNA的克隆、序列分析及表达特征

 克隆一个与白血病复发相关基因 (LRP1 6)的全长 c DNA序列 ,对其进行染色体定位、组织表达谱分析 ,并对该基因编码蛋白质进行原核表达 .首先用获得的一段 3kb DNA片段在 NCBI提供的 h ESTs数据库中进行电子杂交并对重叠克隆片段组装 ,再设计引物进行 c DNA末端快速扩增(RACE技术 ) .采用 Northern印迹方法进行组织表达分析 .以高通量基因组序列 (HTGS)数据库为基础进行染色体定位 .对构建的克隆菌用 IPTG诱导重组蛋白表达后进行 SDS- PAGE,同时对重组体测序确证 .钓取了该基因全长 c DNA、推导所编码的氨基酸序列 ,并将该基因定位于染色体1 1 q1 2 .2 .原核表达筛选获得了该基因重组子的一个缺失体 .对 LRP1 6基因全长 c DNA的序列分析提示 ,该基因可能编码两种 N端不同的蛋白质 ,且该基因的转录本可能存在一种丰度较低的剪接体 .     

基于URA3基因快速构建表达载体及其在里氏木霉的应用

【背景】表达载体是基因工程必不可少的工具,对于真菌如里氏木霉(Trichoderma reesei)等,由于缺乏商品化的表达载体,使其基因工程蛋白表达既复杂又费时而难以开展。【目的】建立一种利用URA3序列快速构建表达载体的方法,解决真菌研究中难以简单、高效和快速构建表达载体的难题。【方法】基于URA3基因的序列,利用其启动子上游5′端序列和终止子下游3′端序列构建同源重组臂,通过同源重组臂定向同源重组到宿主基因组上,利用强启动子和终止子替换URA3基因,从而实现外源基因的表达。根据此方法构建pTRUC表达载体,将红色荧光蛋白基因mCherry克隆到该表达载体上,转化里氏木霉中并验证m Cherry的表达。【结果】阳性转化子在荧光显微镜下观察到强的红色荧光信号,在基因组PCR中检测到mCherry,Westernblotting结果表明红色荧光蛋白m Cherry能在里氏木霉中表达,以上结果说明该载体构建成功,使外源基因mCherry在里氏木霉中正确表达。【结论】基于URA3基因的快速构建表达载体及其构建方法切实可行,将成为推动真核表达系统表达异源蛋白的有力工具。     

cRNA target preparation for microarrays: comparison of gene expression profiles generated with different amplification procedures

Microarray technology has become a standard tool for generation of gene expression profiles to explore human disease processes. Being able to start from minute amounts of RNA extends the fields of application to core needle biopsies, laser capture microdissected cells, and flow-sorted cells. Several RNA amplification methods have been developed, but no extensive comparability and concordance studies of gene expression profiles are available. Different amplification methods may produce differences in gene expression patterns. Therefore, we compared profiles processed by a standard microarray protocol with three different types of RNA amplification: (i) two rounds of linear target amplification, (ii) random amplification, and (iii) amplification based on a template switching mechanism. The latter two methods accomplish target amplification in a nonlinear way using PCR technology. Starting from as little as 50 ng of total RNA, the yield of labeled cRNA was sufficient for hybridization to Affymetrix HG-U133A GeneChip array using the respective methods. Replicate experiments were highly reproducible for each method. In comparison with the standard protocol, all three approaches are less sensitive and introduced a minor but clearly detectable bias of the detection call. In conclusion, the three amplification protocols used are applicable for GeneChip analysis of small tissue samples.     

戊型肝炎病毒荧光定量RT-PCR快速检测技术的建立和初步应用

利用DNAMAN软件对GenBank登录的戊型肝炎病毒四个主要基因型代表株的序列进行分析, 选择其高度保守的ORF2区域设计合成引物和探针, 并用包含有扩增区域的核苷酸片段进行体外转录制备标准品cRNA。在对荧光定量RT-PCR的反应条件优化的基础上, 建立了适用于戊型肝炎病毒主要基因型检测的荧光定量RT-PCR检测技术。该检测技术可以有效检测I型和IV型戊型肝炎阳性病料, 而对猪的其它几种疫病阳性病料则为阴性结果, 证实本技术的特异性强、可靠性好。对阳性标准品的检测结果表明, 所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR灵敏度可达2.0×101拷贝/反应, 相比于巢式RT-PCR方法, 其灵敏度高10~100倍以上。在对54份临床样品的检测中, 进一步证实了该方法快速、灵敏且重复性好, 可满足戊型肝炎病毒早期快速诊断的需要。     

Rapid detection of virulence <Emphasis Type="Italic">stx</Emphasis>2 gene of Enterohemorrhagic <Emphasis Type="Italic">Escherichia coli</Emphasis> using two-step ultra-rapid real-time PCR

A rapid detection method for Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), which has the virulent stx2 gene, was developed using a two-step, ultra-rapid real-time (URRT) PCR. URRT PCR was designed to detect the stx2 gene using a microchip-based, real-time PCR system, GenSpector TMC-1000, which only has a 6 μl total reaction volume with an extremely short denaturation step and combined annealing/extension step (1 and 3 s, respectively) for each cycle. Specific primers for the stx2 gene were designed to amplify a 100 bp region known for genetic stability among the various EHEC strains. Using the URRT PCR method, stx2 gene could be detected in 7 min 8 s including melting point (Tm) analysis. The detection limit for the stx2 gene for URRT-PCR was estimated to be 3 c.f.u./PCR with the amplification product having a consistent Tm of 85.2 ± 0.4°C. This method was tested for the various applications relevant to the different EHEC strains and was useful for the rapid detection of stx2-carrying EHEC strains.     

戊型肝炎病毒荧光定量RT-PCR快速检测技术的建立和初步应用

利用DNAMAN软件对GenBank登录的戊型肝炎病毒四个主要基因型代表株的序列进行分析, 选择其高度保守的ORF2区域设计合成引物和探针, 并用包含有扩增区域的核苷酸片段进行体外转录制备标准品cRNA。在对荧光定量RT-PCR的反应条件优化的基础上, 建立了适用于戊型肝炎病毒主要基因型检测的荧光定量RT-PCR检测技术。该检测技术可以有效检测I型和IV型戊型肝炎阳性病料, 而对猪的其它几种疫病阳性病料则为阴性结果, 证实本技术的特异性强、可靠性好。对阳性标准品的检测结果表明, 所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR灵敏度可达2.0×101拷贝/反应, 相比于巢式RT-PCR方法, 其灵敏度高10~100倍以上。在对54份临床样品的检测中, 进一步证实了该方法快速、灵敏且重复性好, 可满足戊型肝炎病毒早期快速诊断的需要。     

A Simple and Rapid Method for Detection of the 1069Gln Mutation in Wilson Disease

A simple and rapid method for detecting the 1069Gln mutation in gene ATP7B based on a PCR specific for this allele has been developed. The 1069Gln mutation is the main cause of Wilson disease (WD) in Russia and accounts for approximately 40% of all mutant alleles of gene ATP7B. Therefore, the method proposed makes the postnatal and prenatal diagnosis of Wilson disease in Russia considerably more rapid and less expensive.