TPO模拟肽与人IgG1 Fc片段的融合表达及其生物学特性研究

依据本室获得的人TPO模拟肽序列,合成了该模拟肽的DNA序列,分别连接至4种不同长度的人IgG1 Fc基因片段的5′端,并克隆至质粒表达载体pET28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选获得了4种重组工程菌,其中3种分别高效表达了3种不同长度的融合蛋白,而第4种工程菌未表达。表达的3种融合蛋白的分子量分别约为28kD、12kD和12kD,表达量约占菌体蛋白总量的30%左右,纯化获得了3种TPO模拟肽融合蛋白。3种融合蛋白均有较好的体外活性,维持TPO依赖细胞Ba/F3-mp1生长的EC50分别为：13、10、10 nmol/L。用血小板减少症小鼠动物模型,测定了它们的体内活性,3种融合蛋白均有升高血小板和缩短血小板恢复时间的功能,分别比TPO模拟肽活性提高了18、8、8倍;而对白细胞及红细胞无显著影响。分别用3种融合蛋白免疫BALB/c小鼠,均未刺激小鼠产生抗TPO模拟肽抗体,并显示了较好的应用潜力。      

TPO模拟肽与人IgG1 Fc片段的融合表达及其生物学特性研究

依据本室获得的人TPO模拟肽序列,合成了该模拟肽的DNA序列,分别连接至4种不同长度的人IgG1 Fc基因片段的5′端,并克隆至质粒表达载体pET28a( ),转化大肠杆菌BL21（DE3）,筛选获得了4种重组工程菌,其中3种分别高效表达了3种不同长度的融合蛋白,而第4种工程菌未表达,表达的3种融合蛋白的分子量分别约为28kD,12kD和12kD。表达量约占菌体蛋白总量的30％左右,纯化获得了3种TPO模拟肽融合蛋白,3种融合蛋白均有较好的体外活性,维持TPO依赖细胞Ba/F3-mp1生长的EC50分别为：13,10,10nmol/L,用血小板减少症小鼠动物模型,测定了它们的体内活性,3种融合蛋白均有升高血小板和缩短血小板恢复时间的功能,分别比TPO模拟肽活性提高了18,8,8倍,而对白细胞及红细胞无显著影响,分别用3种融合蛋白免疫BALB／c小鼠,均未刺激小鼠产生抗TPO模拟肽抗体,并显示了较好的应用潜力。     

美洲拟鲽抗菌肽Pleurocidin在大肠杆菌中的高效分泌表达及优化

为在大肠杆菌中分泌表达Pleurocidin,并提高融合蛋白的分泌效率,将Pleurocidin基因和Cherry DNA序列通过平末端连接融合,再将融合基因整合到p ET22b(+)载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3);乳糖诱导表达。成功构建含p ET22b(+)-CP重组质粒的基因工程菌,用乳糖诱导获得高效表达。在诱导16 h时加入甘氨酸可以显著提高融合蛋白Cherry-Pleurocidin的分泌效率。用稀盐酸水解融合蛋白的酸敏感位点,再进一步分离纯化即得到r-Pleurocidin,其对大肠杆菌DH5α和枯草芽孢杆菌BS168具有明显的抑菌活性。结果表明成功构建了高效表达Pleurocidin的大肠杆菌基因工程菌,获得有活性的r-Pleurocidin。     

Exendin-4的研究进展

Exendin-4是从希拉毒蜥唾液中分离的一种多肽激素,由39个氨基酸残基组成,与胰高血糖素样肽1（GLP-1）有53%的同源性.Exendin-4具有高度的组织特异性,仅在希拉毒蜥的唾液腺中表达.Exendin-4首先翻洋成N端多余45个氨基酸残基的前体,然后在激素原转化酶催化下分解产生具有生物活性的Exendin-4.Exendin-4的N端是一段不规则卷曲,第7～28氨基酸残基形成α螺旋,C端是不规则亲水片段.Exendin-4的受体是G蛋白,N端是激活受体信号转导途径的关键区域,中间部位和C端是受体结合域.Exendin-4与GLP-1类似,可提高胰岛素基因的转录水平,刺激胰岛素的释放,从而控制血糖浓度,但GLP-1的半衰期2分钟,Exendin-4半衰期却长达9.57小时,因而在治疗Ⅱ型糖尿病方面具有广阔的前景.     

hGH-双精氨酸C肽人胰岛素原基因的克隆表达及纯化研究

旨在提高基因重组人胰岛素在大肠杆菌中表达的稳定性及表达包涵体蛋白的复性水平.在人胰岛素原N端前融合人生长素N端的一段序列来充当前导肽,同时将C肽设计为两个精氨酸,分10段合成长链寡核苷酸链,利用重叠延伸PCR技术(SOE PCR)扩增得到该基因片段.与表达载体PET-30a连接,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达的融合蛋白采用Ni-NTA亲和层析纯化,纯化后的蛋白经复性、冻干等步骤后用胰蛋白酶,羧肽酶B双酶切再过DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱,收集洗脱峰.对制备所得的胰岛素用SDS-PAGE,Western blot进行性质鉴定,及皮下注射小鼠测定生物活性.结果显示,目的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了表达,表达产物以不溶性包涵体形式纯在,约占大肠杆菌总蛋白的30%.经Ni-NTA亲和层析得到的重组蛋白纯度为85%,DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换纯化得到单组分胰岛素.Western Blot显示制备所得的胰岛素具有胰岛素免疫原性,皮下给药注射小鼠活性测定表明具有明显的降血糖活性.获得了一种高效生产基因重组人胰岛素的方法,为研究胰岛素类似物奠定了前期基础同时也为今后探索胰岛素的非注射给药途径提供了原料.     

利用BglBrick方法进行HSA/Exendin-4长效融合蛋白的快速组装

目的：通过合成生物学的BglBrick方法快速构建不同种类HSA/ Exendin-4长效融合蛋白,为进行各HSA/Exendin-4融合蛋白生物学活性的筛选比较奠定基础。方法：选用酵母表达载体pPICZαA质粒,构建pPICZαA-E4和pPICZαA-HSA两种基础Brick表达载体,运用BglBrick方法,实现了不同数目Exendin-4分子在HSA的不同末端的快速组装。将构建出的10种HSA/Exendin-4融合蛋白,转入毕赤酵母菌KM71H中,用甲醇诱导目的蛋白的表达。结果：用BglBrick方法构建的HSA/Exendin-4融合蛋白在毕赤酵母中都成功诱导表达出相应的目的蛋白。结论：利用BglBrick方法能够实现HSA长效融合蛋白的快速组装。     

枯草杆菌DC-2纳豆激酶基因的克隆及其融合蛋白在E.coli中的表达

纳豆激酶是一种纤维蛋白溶解酶 ,有望开发成为新型的溶栓药物 .从中国豆豉中分离的具有较强纤溶活性的枯草杆菌DC 2中提取总DNA ,根据纳豆激酶 (NK)基因序列设计引物 ,用PCR法扩增NK基因 .序列分析表明 ,NK基因成熟肽编码区含有 82 5bp ,编码 2 75个氨基酸残基 ,与文献报道的序列分别有 93 4 %和 94 5 %同源性 .将NK基因插入载体pGEX 4T1构建表达质粒pGEX NK ,转化大肠杆菌JM10 9后 ,经 1mmol LIPTG诱导 4h ,发现大量NK融合蛋白表达 ,并形成包涵体 .SDS PAGE分析表明 ,NK融合蛋白作为包涵体的分子量为 5 3kD .凝胶自动扫描结果显示 ,NK融合蛋白约占菌体可溶性蛋白的 2 6 % .     

一种新型改良硫氧还蛋白融合表达体系的建立及cathelicidin家族Lf-CATH2的表达

通过改良硫氧还蛋白融合表达体系,原核表达cathelicidin家族抗菌肽Lf-CATH2。首先在Lf-CATH2基因上游加入凝血酶位点,并去除p ET32α载体的凝血酶序列和S标签序列,构建优化的Lf-CATH2-p ET32α-TS载体,于大肠杆菌中表达。产物融合蛋白经凝血酶切割释放Lf-CATH2,纯化后进行抗菌活性检测。结果表明改良的硫氧还蛋白融合表达体系显著提高酶切效率达37%,Lf-CATH2在新体系中获得了可溶性高表达,且保留了抗菌活性。因此该新型硫氧还蛋白融合表达体系,有望为cathelicidin家族及其他阳离子活性肽提供更好的原核表达载体工具。     

人胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的表达

目的：在巴斯德毕赤酵母中表达有降糖活性的人胰高血糖素样肽-1（hGLP-1）突变体（2Gly-hGLP-1）与人血清白蛋白（HSA）的融合蛋白。方法：为将GLP-1氨基酸序列第2位的丙氨酸（Ala）定点突变为甘氨酸（Gly）,根据毕赤酵母偏爱密码子合成编码2Gly-hGLP-1的基因;采用重叠PCR法拼接2Gly-hGLP-1和HSA的基因,使得2Gly-hGLP-1的C端与HSA的N端通过甘氨酸五肽接头连接;将该融合基因插入表达载体pPIC9构建为重组载体pPIC9/2Gly-hGLP-1-HSA,电击转化至毕赤酵母GS115细胞,通过表型筛选和诱导表达实验获得高效表达菌株;工程菌在5L发酵罐中培养后,对发酵产物进行分离纯化和生物学活性分析。结果：融合蛋白在5L发酵罐中的表达量约为200mg/L,经纯化后纯度可达95%以上;小鼠糖耐量实验表明该融合蛋白具有明显的控血糖活性。结论：在毕赤酵母中分泌表达的融合蛋白2Gly-hGLP-1-HSA具有降血糖活性。     

hK-Fc融合蛋白的改良、表达及其生物活性的分析

为了延长人激肽释放酶(hK)的血清半衰期,提高分泌蛋白的产率,制备了重组激肽释放酶-IgG1 Fc融合蛋白(hK'-Fc)。采用PCR扩增hK基因和IgG1的Fc序列,用鼠源信号肽序列替换hK基因原有的信号肽序列,构建改良型融合蛋白hK'-Fc以及天然型融合蛋白hK-Fc的表达载体,转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞,筛选稳定分泌融合蛋白的细胞株,通过Western blotting鉴定信号肽改造效果,利用Protein A+G亲合层析柱纯化融合蛋白,酶学实验检测融合蛋白的体外活性。结果表明:成功构建了pcDNA-hK'-Fc以及pcDNA-hK-Fc重组表达载体;获得了稳定表达融合蛋白的细胞株,产量达11mg/L以上;信号肽改造后融合蛋白的分泌效率提高约5～10倍;融合蛋白能水解其特异性的底物S-2266,具有生物学活性。本研究为进一步探讨融合蛋白的体内半衰期打下了坚实基础,也为研制治疗脑梗塞疗效更好的第二代hK蛋白和其他药用蛋白的改良提供新的线索。     

Expression and purification of exendin-4, a GLP-1 receptor agonist, in Escherichia coli

Exendin-4 is a 39 amino acid peptide isolated from salivary secretions of Gila monster (Heloderma suspectum). It shows 53% sequence similarity to glucagon-like peptide-1 (GLP-1), which is evaluated for the regulation of plasma glucose in type 2 diabetes. Exendin-4 is a potent and long-acting agonist of GLP-1 receptor. In the present study, the exendin-4 gene obtained by PCR with an enterokinase site at N-terminus and a termination codon at C-terminus was expressed in Escherichia coli strain BL21 (DE3) harboring pET32a(+). The fusion protein was purified by chromatography on Ni-NTA-agarose column. Recombinant exendin-4 was obtained by enterokinase cleavage of the fusion protein and subsequent purification. The yield of recombinant exendin-4 was 3.15mg/10g bacteria. The obtained recombinant exendin-4 shows glucose-lowering action in vivo.     

Purification and bioactivity of exendin-4, a peptide analogue of GLP-1, expressed in <Emphasis Type="Italic">Pichia pastoris</Emphasis>

Exendin-4, a peptide analogue of glucagon-like peptide-1 (GLP-1), has been developed for treatment of type 2 diabetes. Herein, the secretive exendin-4 fusion protein, expressed by methanol induction in Pichia pastoris system, was purified to homogeneity by chromatography followed by enterokinase cleavage of the fusion protein and subsequent purification of the recombinant exendin-4. Purity of the recombinant exendin-4 was 95.6%. Bioactivity assay revealed that it had glucose-lowering and insulin-releasing action in vivo.     

基因重组胰高血糖素样肽-1衍生多肽的表达和产物纯化与鉴定

为研究利用基因重组方法生产人胰高血糖素样肽-1（GLP-1）衍生多肽的最佳表达及纯化条件,选用大肠杆菌偏爱密码子,以含人GLP-1的质粒为模板,用PCR方法合成全长人GLP-1衍生多肽基因,并定向插入到高效表达载体pMFH中,用大肠杆菌BL21进行表达,融合蛋白经Ni-NTA柱纯化后,用C18 Sep-Pak 反相柱脱盐,然后融合蛋白经甲酸水解,水解产物经Ni-NTA柱和高效液相色谱（HPLC）纯化制备后,目的肽由质谱鉴定。 实验结果表明：利用载体pMFH在BL21中,GLP-1衍生物的最佳诱导表达温度为37℃、诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）的最佳浓度为0.6mmol/L,最佳诱导表达时间为6h;HPLC分析和制备GLP-1衍生物最佳条件为：流动相A(10% CNCH3∶90% H2O,0.1％TFA),流动相B(100% CNCH3,0.1% TFA),流速1ml／min,30 min线性梯度洗脱,B相至70%,检测波长280nm;质谱鉴定GLP-1衍生物的分子量为5.492kDa,与理论值相符合。在最佳表达及纯化条件下可得GLP-1衍生多肽的产量可达到11.6mg/L发酵产物,纯度≥98%。     

重组人胰高血糖素样肽-1的表达、纯化及其生物学活性

为获得重组人胰高血糖素样肽 1[recombinanthumanglucagon likepeptide 1(7～ 37) ,rhGLP 1]并研究其生物学活性 ,采用亚磷酸二酯法合成hGLP 1cDNA的 6个寡核苷酸片段 ,拼接成完整的hGLP 1cDNA ,构建重组质粒pGEX hGLP 1,转化大肠杆菌BL2 1(DE3)获得表达菌株 .高密度发酵培养的菌体超声破碎后 ,裂解液用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化得到GST融合蛋白 .经CNBr裂解、QAE SepharoseFF柱层析和脱盐 ,得到纯度大于 90 %的rhGLP 1,质谱测定分子量结果与理论值一致 .生物学活性分析表明 ,rhGLP 1具有明显的降血糖活性 .     

Cloning, expression, and purification of a highly immunogenic recombinant gonadotropin-releasing hormone (GnRH) chimeric peptide

To design an anti-gonadotropin-releasing hormone (GnRH) vaccine capable of eliciting strong immunogenicity, a gene fragment encoding a chimeric peptide was constructed using polymerase chain reaction and ligated into a novel expression vector for recombinant expression in a T7 RNA polymerase-based expression system. The chimeric peptide called GnRH3-hinge-MVP contained three linear repeats of GnRH (GnRH3), a fragment of the human IgG1 hinge region, and a T-cell epitope of measles virus protein (MVP). The expression plasmid contained the GnRH3-hinge-MVP construct ligated to its fusion partner (AnsB-C) via an unique acid labile Asp-Pro linker. The recombinant fusion protein was expressed in an inclusion body in Escherichia coli under IPTG or lactose induction and the target peptide was easily purified using washing of urea and ethanol precipitation. The target chimeric peptide was isolated from the fusion partner following acid hydrolysis and purified using DEAE-Sephacel chromatography. The purified GnRH3-hinge-MVP was determined to be highly homogeneous by IEF analysis and the N-terminal sequencing. Further, immunization of female mice with the recombinant chimeric peptide resulted in generation of high-titer antibodies specific for GnRH. The results showed that GnRH3-hinge-MVP could be considered as a candidate anti-GnRH vaccine.     

重组水蛭素相关肽Hi-lys的表达与纯化(英文)

为开发一种新的有临床应用价值的抗血栓药物,根据水蛭素保持抗凝活性的2 0肽片段,设计并构建了水蛭素相关肽(Hi lys)与天冬酰胺酶C端的融合表达系统.为方便目的肽与融合伙伴的分离,增加了富含带电序列的8肽(KRKRKKSR)及酸敏感的天冬氨酰 脯氨酸(Asp Pro)位点,获得了表达质粒pED P8 Hi lys.将其转化E .coliBL 2 1,玉米浆培养基(kanr)培养,乳糖诱导获得融合蛋白(AnsB C P8 Hi lys)的高效表达.通过细菌裂解、包涵体洗涤、尿素溶解、乙醇沉淀、酸水解和DEAE 纤维素5 2柱层析纯化获得目的肽Hi lys ,用凝血酶测定法测得其抗凝活性为5 0ATU mg .     

肾炎致病原重组受体相关蛋白的表达及纯化

用pGEX载体系统体外构建了Heymann肾炎致病原受体相关蛋白(RAP)重组表达质粒,经IPTG诱导,该质粒表达的融合蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达,其表达量达39．4％,经GST-Sephrose 4B亲和层析,得到了高度纯化,其诱导产生的抗体经蛋白质印迹法分析证明能识别肾皮质天然抗原44ku受体相关蛋白.RAP表达及纯化的成功为研究致病原病理性表型提供了有利条件．     

Exendin-4的固相化学合成及鉴定

Exendin-4是首个获准上市的肠促胰素类似物药物,可模拟人体自身激素GLP-1的功能,不仅改善血糖,还能促进胰岛β细胞新生、增殖,抑制β细胞凋亡,改善β细胞功能,促进胰岛素分泌,增加机体对胰岛素的敏感性。根据Exendin-4的潜在市场价值,以Fmoc固相合成策略为基础,NMP为反应溶剂,以HOBt/DIC为缩合剂,添加盖帽程序,优化合成工艺条件。肽树脂裂解采用TFA/Phenol/TIS裂解液,并应用高效液相色谱和四级杆-飞行时间串联质谱对其进行分析鉴定和纯化,最终获得Exendin-4,产率为21%,纯度为99.4%。活性测定结果显示,合成的Exendin-4显著提高胰岛瘤细胞的活性,并呈一定剂量依赖性。