人凝血因子Ⅶ cDNA基因的克隆与鉴定

目的:克隆并鉴定人凝血因子ⅦcDNA基因。方法:采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法,从人胎肝总RNA中扩增人凝血因子ⅦcDNA基因,将其克隆入pGEM-T载体,对阳性克隆进行序列测定和分析。结果:经RT-PCR扩增和克隆,获得了人凝血因子ⅦcDNA基因,经序列分析表明,所克隆的基因序列正确。结论:本试验成功克隆了人凝血因子ⅦcDNA基因,为重组人凝血因子Ⅶ的研究奠定了基础。     

MAPPING重组噬菌体中插入片段的“分/合”策略

随着胚胎干细胞基因打靶技术不断推广应用,如何有效地从小鼠基因组DNA文库中筛选得到基因组DNA并进行结构分析(如限制性内切酶酶切图谱分析,即mapping等)已成为一个被普遍关心的问题.设计应用了“分/合”的策略,即先对重组噬菌体插入片段制备一套亚克隆,在对亚克隆进行详细的mapping的基础上,再对完整的大分子噬菌体DNA进行酶切分析,将两者相结合,可以分析得到完整的酶切图谱.应用此策略,简便准确地对所克隆的含有小鼠凝血因子IX基因组DNA的大分子插入片段进行了限制性内切酶酶切图谱分析,结果得到了DNA印迹等的验证.     

一种新的广谱寄主的DNA克隆技术—PRK290与PRK2013双载体系统介绍

近年来,一种用于DNA克隆的双载体系统发展十分迅速。这种系统有许多优点,特别是它广谱寄主的特性,是我们过去常用的一些载体系统所不具有的。在实际应用中,它已显示出作为一种有效的多用途的DNA克隆载体的潜力。这就是以PRK290质粒为克隆载体、以PRK2013质粒为帮助质粒(helper Plasmid)可转移进各种革兰氏阴性菌的双载系统。     

凝血因子Ⅷ

人凝血因子Ⅷ(抗血友病因子)是凝血内部级联途径(intrinsic clottingcascade)中起重要作用的血浆糖蛋白。A型血友病或称古典血友病是由于不正常的凝血因子Ⅷ引起的,10万名男性中发病率约为10—20人。近十年来,人们关于凝血因子Ⅷ,特别是它的基因和蛋白分子结构方面的知识日益增加。这篇综述总结了人凝血因子Ⅷ的结构和基因的分子克隆以及血友病的遗传诊断及治疗方面的新进展。     

牛疱疹病毒Ⅳ型(DN-599株)DNA的分子克隆

从感染的MDBK(牛肾)细胞中直接抽提出牛疱疹病毒IV型(BHV-4)DNA。分别经限制性内切酶EcoRⅠ,HindⅢ或BamHI消化后,用鸟枪法和选择法将病毒DNA片段克隆到质粒pBR322和pUC9的相应位点中,构建了三组病毒DNA基因库。阳性克隆是用光生物素标记的病毒DNA和牛胸腺细胞DNA与各重组质粒DNA杂交而筛选的。总共克隆了病毒基因组的94％,其中用EcoRI克隆了83.4％,BamHI克隆了63.4％,HindIlI克隆了45％。     

PCR筛选BAC文库和直接BAC末端测序方法的建立

建立了一种用PCR方法筛选富含高度重复序列的大麦BAC DNA 文库和直接对 BAC DNA进行末端测序的方法.用PCR技术进行大麦BAC DNA 文库(含816个平板,每个平板含384个克隆)的筛选分4步进行.在实验中,建立了两个水平的BAC DNA池(一级池和二级池).一个二级池由一个平板(含有384个克隆)的DNA 组成,一个一级池由连续10个稀释100倍的二级池的DNA混合而成(如1～10,11～20等),共82个一级池.BAC DNA 文库筛选的第一步是对82个一级池的筛选.得到阳性一级池后(如2号一级池),对其所含的10个二级池(从11～20)进行第二步筛选.得到阳性二级池后,培养相应的阳性平板的所有克隆(384个),从头开始(左上侧),每相邻的4个克隆为一组,在96孔板上(4 X 96=384) 进行第三轮PCR反应;之后对筛选结果为阳性的4个克隆分别进行菌落 PCR(第四轮)得到单一阳性克隆.根据BAC DNA Hind III 酶切指纹图谱,对同一引物筛选的BACs进行重叠群作图(Contig).对代表contig 的两端的BAC DNA直接进行末端测序并对测序结果Blast,以检测其在大麦中是否属于单拷贝序列.根据测序和Blast结果设计引物,用中国春附加系(附加大麦染色体)对来自BAC克隆的引物进行染色体定位并用分离群体进行遗传学作图,以确定是否可以用作下一步的染色体步行.     

疫苗

综述了重组DNA技术在疫苗的研究和发展上的应用。专题包括:(A)编码抗原决定簇的基因克隆,(i)抗原鉴定,(ii)抗原墓因的克隆,(iii)克隆DNA分子的特性,(iv)克隆DNA体外操作,和(V)衍生自抗原的合成肤的生产;(B)抗病原     

Ⅰ型马立克氏病病毒pp38和pp24基因的真核共表达

本研究将Ⅰ型超强毒MDVMd11株的pp38和pp24完整基因分别克隆到真核双表达载体pBudCE4.1中,在脂质体作用下将阳性克隆DNA转染CEF,通过间接免疫荧光试验(IFA)用单克隆抗体H19和鼠抗GST-pp24血清分别检测到了pp38和pp24基因的单独表达。然后将MDVMd11株的pp38和pp24完整基因同时克隆到载体pBudCE4.1中,在脂质体作用下将阳性克隆DNA转染CEF,通过IFA检测和用抗pp24多克隆血清进行West-ern-blotting试验检测到了PP38和PP24磷蛋白的共表达。     

Ⅰ型马立克氏病病毒pp38和pp24基因的真核共表达

本研究将Ⅰ型超强毒MDV Md11株的pp38和pp24完整基因分别克隆到真核双表达载体pBudCE4.1中,在脂质体作用下将阳性克隆DNA转染CEF,通过间接免疫荧光试验(IFA)用单克隆抗体H19和鼠抗GST-pp24血清分别检测到了pp38和pp24基因的单独表达.然后将MDV Md11株的pp38和pp24完整基因同时克隆到载体pBudCE4.1中,在脂质体作用下将阳性克隆DNA转染CEF,通过IFA检测和用抗pp24多克隆血清进行Western-blotting试验检测到了PP38和PP24磷蛋白的共表达.     

谁将克隆染色体?

美国Genentech公司和遗传研究所公司的两个研究小组已能分离和克隆编码凝血系统主要成分之一的人凝血因子Ⅷ的基因,分析了它的核苷酸序列,推测了由氨基酸合成相应的大蛋白质分子的方式,甚至设计了大量制造凝血因子Ⅷ的系统。这在技术上是一大成功,但也留下了一些重要问题尚待回答。     

大鼠肝脏半乳糖凝聚素-3 cDNA分子多样性分析

半乳糖凝聚素-3(Galectin-3,Gal-3)是一种多功能蛋白,参与机体内的多种生命活动过程。为分析大鼠Rattus norvegicus gal-3 c DNA分子多样性,在分析Gen Bank注册的大鼠gal-3 c DNA序列的同时,从三只不同大鼠个体的肝脏第一链c DNA,共计9个独立实验中克隆gal-3开放阅读框OFR(Open reading frame)。分析结果表明,在已注册的序列中存在1个单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)。本实验从1-3号大鼠肝脏分别获得118、95和120个克隆,新发现1处缺失和5处SNP,共克隆17个不同的gal-3 ORF,其中仅1个克隆与已报告大鼠gal-3 c DNA的ORF完全相同。从1号和3号个体肝脏中分别克隆11和14个不同的gal-3 ORF,揭示大鼠gal-3 c DNA存在个体水平的分子多样性。     

人巨细胞病毒IE基因调节子特异DNA结合蛋白cDNA的克隆和鉴定

本文利用人巨细胞病毒(HCMV)IE基因调节子中特异DNA片段作为探针,自人Hela细胞cDNA表达库中筛选并分离出两个编码能与该探针结合的DNA结合蛋白cDNA克隆(DJ-1和EH-2)。其中EH-2编码的蛋白具有明显的DNA结合序列特异性。比较DJ-1和EH-2克隆在HCMV戚染不容性和可容性畸胎瘤细胞中mRNA表达水平,未见明显差异。DJ-1和EH-2克隆可能涉及IE基因表达调控过程。     

牛不同供体核克隆囊胚Xist基因DNA甲基化程度的比较研究

利用亚硫酸氢盐测序法分析Holstein奶牛胎儿成纤维细胞(FFB)和输卵管上皮细胞(FOV)来源的克隆囊胚Xist基因DNA甲基化状况,以体外受精囊胚(IVF)和供体细胞作对照.克隆囊胚Xist基因处于较低程度的DNA甲基化状态,其中,FFB来源的克隆囊胚Xist基因DNA甲基化程度为43%,而FOV来源的克隆囊胚仅为17%.在体外受精囊胚中,Xist基因DNA甲基化处于中等状态,为49%.然而,在体细胞中,Xist基因的甲基化程度较高,FFB为66%,FOV为63%.这些结果说明,Xist基因DNA甲基化是可以被重编程的,所检测的CpG岛可能调节Xist基因的表达.结合已发表的实验数据,在同一个体中,FFB来源的克隆囊胚发育率比FOV的低,但其克隆牛胎儿的妊娠率和产犊率比FOV的高,这暗示不同供体核克隆囊胚的重编程是有差异的,并可能影响到胚胎及个体的发育.     

S1核酸酶作用与微环DNA分子的克隆策略

米曲霉来源的S1 核酸酶具有降解单链DNA或RNA的作用。在适当的条件下 ,该酶能将不同的环形DNA分子从超螺旋转变成开环和线形结构 ,对质粒pUC19的实验证明 ,S1 核酸酶的这种转变作用与加入的酶量呈正相关。在 2 5 μL总反应体积中 ,按 10 0ngDNA加入 5u至 17u的S1 核酸酶 ,能获得较高比例的线形DNA。由于微环DNA分子太小 ,单酶切位点的出现率较低 ,很难用常规方式进行克隆 ,以S1 核酸酶进行线形化是微环DNA克隆的途径。pC3是已知最小的真核生物线粒体DNA类质粒 (5 37bp) ,经S1 核酸酶线形化后 ,成功地克隆到pMD18 T载体上。     

cosmid克隆筛选的体内同源重组法——一个含有小鼠t复合体连锁DNA顺序的cosmid克隆的分离

一个从cosmid分子克隆库中筛选特别基因顺序的遗传学方法——体内同源重组(invlvo homologous recombination)法。即使探针DNA与分子克隆库中带有与探针同源顺序的克隆发生体内重组,然后以遗传学方法进行筛选。cosmid分子克隆库构建在rec宿主细胞内,经体内包装(in vivo Packaging)成λ噬菌体颗粒,把该噬菌体颗粒转入带有探针DNA的rec~+细胞内,探针是已被克隆在与cosmid载体没有同源顺序的质粒(如PUC8或PUC9)内的。经过一段时间(1—3小时),待重组发生后,把cosmid进行体内包装。此时探针DNA连同质粒已整合入cosmid基因组内,因此它带有原为两个载体所分别带有的双重抗性——Amp~r(氨苄青霉素,PUC8或PUC9)和Kan~r(卡那霉素,cosmid)。这种双重抗性菌落可在含有这2种抗菌素的培养平皿上选出,该重组cosmid借助于λ切除酶的作用将已被整合的探针质粒重新切除,再经体内包装后,该cosmid被还原并纯化,然后可用一含有Xgal的培皿识别和选出。本文用此法以有关DNA探针从cosmid分子克隆库中分离得到含有与小鼠t复合体连锁的基因组顺序的克隆,并对该克隆作了物理图谱分析。     

人凝血因子Ⅷ基因克隆可在哺乳动物细胞株中表达

最近,美国的Genentech与Genetics Institute的二组科学家同时成功地克隆了凝血因子Ⅷ∶C的DNA,并使其在哺乳类细胞株中表达产生有活性的因子Ⅷ∶C。他们根据已纯化的来源于猪或人因子Ⅷ∶C的一小片段氨基酸序列,合成出寡核苷酸探针,用此探针从基因库中找出了因子Ⅷ的基因,并已弄清楚这段基因总长为186000bp,共有长度为69～3106bp不等的26个外显子,整个基因约占X染色体的0.1%。他们分别利用人的T细胞杂交瘤株或人肝获得了cDNA克隆,并根据cDNA的序列分析推断出成熟蛋白的2332个氨基酸序列。结果显示,多肽链中有与凝血因子V结构同源的区域以及与血浆铜兰蛋白结     

编码酵母丙氨酸tRNA两个半分子的DNA的克隆

用DNA合成仪合成寡聚脱氧核苷酸。用T4-DNA连接酶把这些寡聚脱氧核苷酸重组成双链DNA。这两个双链DNA的上游是T7-启动子,下游分别编码酵母丙氨酸tRNA的5′半分子(1-35位核苷酸)和3′半分子(35-76位核苷酸)。再把这两个双链DNA克隆到PUC 12质粒中。经点杂交筛选和DNA顺序测定证明克隆是成功的。     

人R_O蛋白(60kD)编码序列的PCR产物在E.coli中的克隆与表达

通过聚合酶链反应 ( PCR)自人脾 c DNA扩增 RO 蛋白 ( 60 k D)编码 DNA片段 .将该片段定向插入麦芽糖结合蛋白 ( MBP)融合系统的 p MALTM- c载体中并转化 E.coli ( DH5α) ,通过酶联免疫印迹 ( IBT)筛选出具有 RO 抗原性的阳性克隆 .绝大部分阳性克隆表达完整的 RO 融合蛋白 ( 1 0 0k D) .但在传代过程中表达水平很快降低 ;少数阳性克隆虽然表达非完整 RO 融合蛋白 (分子量 <80k D) ,但表达水平却高而且稳定 .同时保留了很强的 RO 抗原性 .产生非完整融合蛋白的一个原因是 ,PCR碱基错配引起 RO 编码 DNA的序列缺失 ;另一原因是融合蛋白在表达过程中被降解     

人们对由DNA引起的癌症的恐惧在增长

Cancer Research Campaign公司(英国格拉斯哥)的研究者已经发现人癌的裸露DNA能在活的动物中激发肿瘤,他们认为这是DNA引起癌症的第一个证据.巴斯德研究所(法国巴黎)的某些科学家莫名奇妙地患有罕见的癌症,这激发了人们的研究兴趣.格拉斯哥的研究者在小鼠的背部使用了一个克隆的、突变的ras致癌基因的纯DNA序列.几周内小鼠的皮肤上就开始出现暗斑,几个月后在血管和淋巴管的内层形成了内皮     

pcDNA3．1表达载体转染对细胞生长的影响

为了探讨真核表达载体转染对细胞生长的影响,通过脂质体介导将pcDNA3.1( )表达载体DNA转染鼻咽癌细胞系HNE1,G418筛选后,Southern杂交鉴定稳定表达细胞株,以HNE1细胞为对照,观察pcDNA3.1( ）／HNE1克隆细胞的生物学特性;结果显示,在pcDNA3.1( )/HNE1阳性克隆中,一株细胞克隆培养过程中发生自溶性死亡,一株细胞生长明显受到抑制,另一株细胞生长无明显影响,揭示在宿主细胞中pcDNA3.1( )DNA与宿主基因组DNA发生了随机整合,从而表现不同的细胞生物学改变。