胸腺肤α1-Spl DnaX内含肤融合蛋白的切割动力学研究

目的:研究胸腺肤α1(Tal)与Spl DnaX内含肤融合蛋白AS的体外切割动力学.方法:构建Tαl和SplDnaX内含肤的融合表达载体pET-AS,转化大肠杆菌BL21(DE3),经乳糖诱导获得可溶性表达的融合蛋白AS,用镍亲和层析纯化该蛋白;综合评价温度、β-巯基乙醇(β-ME)浓度和诱导切割时间对Spl DnaX内含肤介导融合蛋白AS自切割释放Tα1的影响.结果:在大肠杆菌中诱导表达了融合蛋白AS,经镍柱纯化获得该蛋白;随着温度升高和β-ME浓度增加,诱导切割时间延长,Spl DnaX内含肤介导的切割率逐渐增大;最终采用300mmol/L β-ME切割24 h,融合蛋白的硫解切割率大于90%.结论:通过对Spl DnaX内含肤的诱导切割条件进行摸索,确定了最适宜的切割条件,为利用该方法制备Tαl和其他小分子多肤提供了技术基础.     

一步加热法和溴化氰切割生产胸腺肽α1

胸腺肽α1是一种已经商业化的化学合成多肽,它具有广泛免疫增强和抗肿瘤作用.随着越来越多的临床治疗作用的发现,胸腺肽α1的大量和低价生产逐渐引起人们的重视.我们通过一种新的重组和纯化技术来生产多肽胸腺肽α1,首先通过基因重组的方法在大肠杆菌中表达了四串体的胸腺肽α1,然后使用一步加热的方法将四串体的胸腺肽α1纯化.随后,使用溴化氰在50%～70%三氟乙酸溶剂中将四串体的胸腺肽α1切割成单体.使用高效液相色谱法将胸腺肽α1单体提纯后,其纯度可达到98%以上.最后,利用胸腺肽α1能刺激淋巴细胞增殖的原理证实经我们的方法得到的重组胸腺肽α1,与商业化的胸腺肽α1 (Zadaxin?)具有相似的生物活性.我们通过基因重组、加热纯化、合适的切割成功获得了与商业化的胸腺肽α1相似生物活性的重组胸腺肽α1.     

内含肽介导的蛋白连接技术及其应用

内含肽介导的蛋白质剪接是一种自发的翻译后事件,内含肽可介导其自身从前体蛋白上切除,同时将其两侧的外显肽连接起来.在过去10多年中,基于蛋白质剪接原理发展出的蛋白连接技术被广泛的用于蛋白质工程的研究中.这些技术打破了化学合成方法中对目标物大小的限制,有助于化学和生物学的研究.针对近年由蛋白质连接演化出来的新技术及其应用做简要的阐述.     

化学切割重组融合蛋白制备人胸腺肽β_4

目的：在大肠杆菌中表达人胸腺肽β4（Tβ4）的融合蛋白,通过CDAP介导的化学切割将融合部分切除,获得人Tβ4。方法：分别以质粒pET-Tβ4和pET-L12为模板,扩增Tβ4和核糖体亚基蛋白L12的基因片段,再以这2段基因为模板进行重叠PCR,并在连接处引入一个半胱氨酸（Cys）密码子,将得到的融合蛋白Tβ4-Cys-L12基因片段与pET-22b载体连接,构建表达质粒,将其与N-末端乙酰转移酶质粒共转化至大肠杆菌BL21（DE3）并共表达,获得N端乙酰化修饰的融合蛋白Tβ4-Cys-L12;利用CDAP氰基化Cys的巯基,于pH10.0条件下在Cys残基N端完成切割,分离纯化获得Tβ4。结果：质谱分析目的产物相对分子质量为4962.70,与天然Tβ4一致,表明获得了Tβ4。结论：CDAP介导的化学法可以有效切割融合蛋白获得Tβ4,建立了一套Tβ4的生物制备方法。     

基因串联原核高效表达胸腺肽α1

人工合成含有SD序列、胸腺肽α1(Tα1)基因、纯化标签和酶切位点的DNA序列作为构建元件,利用同尾酶将其依次克隆到pET-32a(+)中,得到含有1-8个不同重复数目的含SD序列基因的串联表达载体,利用PCR初步鉴定和进一步的测序证实序列完全正确。进而利用lacZ基因作为指示基因,将带有SD序列的lacZ基因克隆到不同Tα1基因串数载体末尾,利用蓝白斑实验验证启动子后不同SD序列的效率,证实串联载体中的各个SD序列均能有效启动翻译。在此基础上对各串表达载体进行摇瓶发酵,SDS-PAGE电泳检测证实各串均可正确表达Tα1,且为可溶性表达。本文为小肽原核高效表达提出了新方法,有望成为小肽高效表达的新途径。     

胸腺素α1与复合α干扰素融合蛋白的表达及其生物学活性

实验旨在获得具有双重生物学活性的重组胸腺素α1(Thymosin alphal,TM-α1)与复合α干扰素(IFNα-con)融合蛋白.选择大肠杆菌偏爱的密码子.将合成的TM-α1与IFNα-con编码序列构成的融和基因克隆至大肠杆菌表达载体pET-22b( )、在宿主茵BL21(DE3)-Codon plus-RP-X中成功表达了可溶性融合蛋白(TM-α1.IFN-con).表达量占总蛋白的20%以上.通过硫酸铵沉淀、疏水层析,阴离子交换层析、阳离子交换层析,分子筛层析后,产品纯度达到96%以上.采用细胞病变抑制法测定融合蛋白的抗病毒活性,采用细胞增殖实验检测融合蛋白对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响.结果表明.融合蛋白的抗病毒活性优于市售的IFNα1b和IFNα2a.对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响与市售的合成胸腺素α1相同.已有研究证实.该融合蛋白具有良好的体外抗HBV作用.其体外抗HBV活性比联合应用TM-α1和干扰素α强,且细胞毒性明显低于联合应用TM-α1和干扰素α,以上结果表明,通过大肠杆菌表达的可溶性融合蛋白(TM-α1.IFN-con).既具有良好的干扰素α抗病毒作用.也具有胸腺素α1促淋巴细胞增殖作用.     

拉米夫定联合胸腺肽α1治疗慢性乙型肝炎的疗效观察

目的：探讨拉米夫定（LAM）联合胸腺肽α1（Tα1）治疗慢性乙型肝炎的长期疗效和安全性.方法：72例慢性乙肝患者（HBV-DNA和HBeAg均阳性）,按1：1随机分配进入联合治疗组（LAM＋Tα1组）和单用拉米夫定组（LAM组）.结果：治疗1年时LAM＋Tα1组HBeAg血清转换率（44.4%,16/36例）明显高于LAM组（5.6%,2/36例）,P〈0.01.停药1年后,持续的HBeAg血清转换率分别为36.1%（13/36例）和8.3%（3/36例）,P〈0.01.治疗过程中及停药后,两组HBV-DNA水平均明显下降,但两组的HBV-DNA转阴率相仿.治疗后1年ALT复常率联合治疗组与拉米夫定组相似,分别为75%（27/36例）和66.7%（24/36例）、随访1年时ALT复常率联合治疗组明显高于拉米夫定组,分别为58.3%（21/36例）和16.7%（6/36例）.在治疗过程中,未发现严重的不良反应.结论：LAM联合Tα1治疗慢性乙肝,不良反应少,疗效优于单一LAM用药组.     

融合蛋白连接肽的研究进展

融合蛋白是将两个或多个基因的编码区首尾连接,由同一调控序列控制构成的基因表达产物。对于有连接肽的融合蛋白,连接肽的设计在其中起着决定性的作用。该文从连接肽的设计、构建、分类、功能以及用连接肽构建融合蛋白时出现的问题和问题的解决等几个方面作了综述。     

干扰素-α1b单用及联合胸腺肽α1治疗慢性乙型肝炎疗效观察

我院自1997年初开始使用胸腺肽α1(Tα1)联合干扰素-α1b(IFN-α1 b)治疗慢性乙型肝炎(CHB)患者,取得满意疗效,现报告如下.     

断裂型内含肽在蛋白生产和生物工程中的应用

蛋白反式剪接是蛋白翻译后修饰的一种特殊机制,这一反应由断裂型内含肽自我催化完成,不需要酶和其他因子参与。与常规顺式的蛋白剪接不同的是,反式剪接是基于断裂型内含肽由N端和C端这两段多肽的高亲和力,精准地构建成一个具有剪接活性的内含肽蛋白质。反式剪接已被发展成新的生物技术应用于生产环化蛋白、构建蛋白定点与定时表达的载体和转基因植物,以及改造cDNA文库技术等。     

通过断裂内含肽介导的反式剪接合成大的蛋白

大肠杆菌难以表达大的蛋白,毒性蛋白以及膜蛋白,“Npu DnaE内含肽表达系统“使这些蛋白的表达成为可能。该系统的基本原理是：在特定位点处将目标基因（编码T7 RNA聚合酶的基因）断裂成两部分,然后分别与Npu DnaE内含肽的N端,C端片段融合,两种融合基因分别表达纯化,在体外将两种融合蛋白等摩尔比混合即可产生有功能的T7 RNA聚合酶。理论上,该体系也可用于合成其他大的蛋白,毒性蛋白或膜蛋白。     

人工合成胸腺肽α1对正常小鼠和免疫抑制荷瘤小鼠的免疫调节作用

目的:本研究通过对正常小鼠和免疫抑制荷瘤小鼠皮下注射人工合成胸腺肽α1 (sTα1).方法:检测各组小鼠淋巴细胞亚群比率、T淋巴细胞增殖数量和脾细胞细胞因子的表达水平三个指标,来判定sTα1对小鼠免疫功能的影响.结果:sTα1可提高小鼠外周血CD4+T细胞比率、降低CD8+T细胞比率,使CD4+/CD8+的T细胞比率增加.sTα1能明显加强正常小鼠、环丙酰胺(CTX)免疫抑制小鼠和荷瘤+CTX免疫抑制小鼠的脾淋巴细胞的增殖(P＜0.5),明显促进正常小鼠及各免疫抑制组小鼠脾细胞细胞因子mIL-2和mIFNγ释放(P＜0.5).结论:sTα1可促进T细胞的快速成熟,活化T细胞,纠正了荷瘤和化疗药物产生的免疫抑制作用,有效刺激免疫系统,促进Th1型细胞免疫反应.     

内含肽介导的生物学效应及其应用

蛋白质翻译产物在成熟过程中剪切释放出来的一段氨基酸序列称为“intein”---即内含肽。它与前体蛋白以框内融合的形式共同翻译,并内嵌于前体蛋白序列中。内含肽的解离以及内含肽两侧氨基酸序列的连接是在内含肽自身催化作用下完成的。本文将从内含肽的发现、结构特征和作用机理等方面对这种具有特殊意义的蛋白质成熟机制进行较为全面的论述,同时介绍了近年来发展起来的以内含肽介导的蛋白质剪接为基础的蛋白质纯化和改造技术。     

新型断裂内含肽介导的可控性C端断裂

内含肽介导的蛋白质断裂被广泛地应用于蛋白质纯化、连接和环化. 但目前的方法都是用传统的连续的内含肽来介导蛋白质断裂反应,因而往往存在自发性断裂、产率低等问题. 本实验选择3个S1型新型断裂内含肽Ter ThyX、Ssp GryB和Rma DnaB来实现蛋白质断裂反应的可控性. 在可控性C端断裂反应中,S1型断裂内含肽的C端片段（IC ）与硫氧还蛋白（T）融合作为前体蛋白,加入化学合成的Ssp DnaB S1型断裂内含肽 的N端小肽与二硫苏糖醇（DTT）共同诱导C端断裂反应.结果表明,该小肽可以诱导这 3个不同的S1型断裂内含肽的前体蛋白发生C端断裂反应. 该方法为利用内含肽C端断 裂介导的蛋白质纯化提供了更多的选择,并为内含肽的结构与功能的关系研究提供-有用的线索.     

乳糖代替IPTG诱导重组人胸腺肽α1在大肠杆菌中的表达

研究以乳糖代替IPTG作为诱导剂诱导重组人胸腺肽α1表达的可行性,对乳糖诱导的时机、乳糖浓度、诱导持续时间以及其它诱导条件进行研究,确定了乳糖诱导的最佳条件。结果表明,乳糖能有效地诱导重组人胸腺肽α1的表达,并且目的蛋白的表达量略高于IPTG的诱导量。     

抗α2δ1抗体/NanoLuc融合蛋白的制备及其特性初步验证

肿瘤干细胞的存在被认为是肿瘤耐药和复发转移的根本原因,因此研发肿瘤干细胞的活体标记示踪技术动态监测该类细胞的存在具有重要的科学价值。实验室前期发现电压门控钙离子通道α2δ1亚基是肝细胞癌干细胞的特异表面标志物,文中研究探讨利用针对α2δ1的单克隆抗体1B50-1的单链可变域与新型荧光素酶NanoLuc形成融合蛋白1B50-1scFv-NanoLuc,在体外验证其对α2δ1阳性肝癌细胞结合的特性和荧光素酶活性。1B50-1scFv和NanoLuc序列通过重叠PCR技术扩增获得1B50-1scFv-NanoLuc的融合片段,并在C端添加Flag标签肽 (命名为1B50-1scFv-NanoLucFlag),然后采用常规DNA克隆技术将融合片段克隆到真核表达载体。利用聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine,PEI) 将1B50-1scFv-NanoLucFlag真核表达载体转染至悬浮型人胚肾293细胞 (FreeStyle 293F)。蛋白免疫印记实验证明融合蛋白在FreeStyle 293F细胞培养上清中表达,其分子量约为50 kDa。融合蛋白经ANTI-FLAG? M2亲和层析柱纯化后,经流式细胞仪法测定融合蛋白1B50-1scFv-NanoLucFlag对高表达α2δ1的Hep-12肝癌细胞具有高亲和活性。进一步,1B50-1scFv-NanoLucFlag与高表达α2δ1的肝癌细胞结合后显示出强的荧光素酶活性。这些结果表明融合蛋白1B50-1scFv-NanoLucFlag可用于α2δ1阳性肝癌干细胞的标记并可通过荧光素酶化学发光法进行示踪。     

晚期胃癌患者化疗中胸腺肽α1治疗疗效的临床研究

目的：探讨应用流式细胞仪（FCM）检测胃癌患者外周血免疫指标,以评价胸腺肽α1联合化疗对胃癌患者免疫功能的影响。方法：70例胃癌患者随机分为用药组和对照组。用药组35例采用胸腺肽α1＋化疗,对照组35例单用化疗,两组化疗方案相同。胸腺肽α1每次1.6mg,每周2次,连续4周（共8针）。28天为一疗程,共用2个疗程。采用FCM检测两组患者化疗前后外周血CD4、CD8、CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋免疫指标。结果：用药组CD4、CD8、CD3＋CD4＋、CD4/CD8均高于化疗前和对照组化疗后水平,均具有统计学意义（P〈0.05）。结论：胸腺肽α1配合化疗能提高患者的免疫功能,用FCM检测外周血免疫指标为临床观察肿瘤患者的免疫状态提供有效的依据。     

多种S1断裂内含肽的体内交叉反应

断裂内含肽含有两个独立分离的多肽片段(N端内含肽和C端内含肽),它催化蛋白质反式剪接反应,在蛋白质研究与蛋白质工程中已得到诸多实际应用.在蛋白质反式剪接过程中,内含肽的N端内含肽和C端内含肽通过结构互补特异性地非共价组合.然而,Ssp DnaX S1型断裂内含肽的较大C端内含肽片段近来被发现能够与源自其它内含肽的N端内含肽片段交叉反应,表明蛋白质内含子Ssp DnaX具有结构杂交特征.本研究对另外2种S1型内含肽Rma DnaB和Ssp GyrB的较大C端内含肽与不同S1型断裂内含肽的N 端内含肽交叉反应活性进行分析检测.目的是探讨S1型断裂内含肽的结构杂交特征是否具有普遍性.结果发现,Rma DnaB的S1 C端内含肽能够与Ssp GyrB的S1 N端内含肽交叉反应,却不能与Ssp DnaX的S1 N端内含肽交叉反应;与此相似,Ssp GyrB的S1 C端内含肽能够与Rma DnaB的 S1 N端内含肽交叉反应,却不能与Ssp DnaX的S1 N端内含肽交叉反应.此外,某些交叉反应表现出温度依赖性.这些结果对于内含肽的结构 功能关系以及S1型断裂内含肽的应用研究具有重要的意义.