深层培养黑曲霉生产酸性蛋白酶的研究I．酸性蛋白酶产生菌的筛选及其培养条件

用5种培养基,从120株霉菌中筛得5株产生酸性蛋白酶的黑曲霉及其突变株。对影响这些菌株生产酸性蛋白酶的各种因素的研究结果表明,黑曲霉生产酸性蛋白酶需要高浓度的氮源,特别是无机氮,这与其他微生物蛋白酶的生产有所不同。另外,CaCl2,、胨、豆饼粉、蚕蛹粉、鱼粉的石灰水解液均能促进酸性蛋白酶的生产。磷酸盐、微量的Cu++、Fe++、Mn++、Ni++、于产酶略有促进作用。培养基中固形物的浓度、通气量、起始pH、种子培养条件以及种龄、种量等都对产酶有明显的影响。     

嗜热菌Anoxybacillus sp．DL3产蛋白酶条件及其酶学性质研究

目的：对Anoxybacillussp．DL3的产蛋白酶条件及其酶学性质进行研究,为下一步进行蛋白酶基因的克隆、表达提供依据。方法：应用常规方法液体培养细菌,研究温度、pH、培养基中碳源、氮源对菌株产蛋白酶的影响,硫酸铵盐析的方法提取酶液,并采用Folin法测酶活性。用紫外分光光度计在OD680hi／1测吸光值。并对提取的蛋白酶液进行酶的最适温度、pH以及酶的热稳定性和pH稳定性研究,向酶液中添加金属离子和EDTA、PMSF,研究其对酶活性的影响。结果：在培养基初始pH是6．5,培养温度为40℃时菌株产酶酶活性最大;培养基中以乳糖为碳源,酵母膏和硫酸铵为氮源,碳源与氮源的比例为1：2时,酶活最大。酶学性质研究结果显示：该酶的最适反应温度是55℃,最适反应pH是7．0;在50℃保温20min-80min内,酶活力下降幅度较小。60℃保温60min后,仍保持约60％的酶活。70℃保温60min后,残余酶活为30％。该酶在pH为6．0～8．0范围内,相对酶活差别不是很大,下降趋势大致相同。在强碱条件下,相对酶活下降很明显。Fe2＋、Cu2＋和Hg2＋对酶活性有明显的抑制作用;Ca2＋、Mg^2＋、Mn2＋等金属离子对酶活性有明显的促进作用;乙二胺四乙酸（EDTA）和苯甲基磺酰氟（PMSF）对酶活性也有一定抑制作用。结论：Anoxybacillussp．DL3所产的蛋白酶为嗜热中性蛋白酶,此酶具有较好的热稳定性和pH耐受性,该菌株具有进一步开发、利用的价值。     

宇佐美曲霉L336酸性蛋白酶的动力学性质

L336酸性蛋白酶的分子量为54000,等电点为3．8±0．2。在pH2．5,40℃条件下,酶对酪蛋白、牛血清白蛋白和牛血红蛋白的Km值分别为0．263g／L、0．278g／L和0．415g／L,Vmax分别为2075、1550和2793μgTyr／min、mL,酪蛋白为最适底物。在pH2．0～5．0、40℃以下时酶的稳定性最好。此外,还研究了金属离子对酶活性的影响。     

嗜碱性短小芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究III．酶的性质及应用

本文对嗜碱性短小芽孢杆菌(Alkaliphilic Bacillus pumilus)B45菌株产生的碱性蛋白酶性质进行了研究。该酶对酪蛋白水解的最适pH为10．0—10．5,在PH7-l0之间稳定,最适反应温度为45℃,稳定性较好。最适底物浓度为1％。四硬酸钠、氯化钙对酶有激活作用,三聚磷酸钠及碳酸钠在常温下对酶话力无影响,而在40℃时对活力略有抑制,加入0．2g／LCaCl2可以保护酶的活性。B 45蛋白酶对血、奶污布的去污效果明显,其去污力比一般洗衣粉高10-13倍。     

黑曲霉SL2-111复合酶固体发酵工艺研究

以酸性蛋白酶酶活为响应值,采用单因素搜索和正交试验对黑曲霉（Aspergillus niger）SL2－111固体发酵工艺进行优化,结果表明最适培养基的组成为：新鲜麸皮8．25g,米糠4．5g、豆饼粉1．5g、（NH4)2SO40.3g、K2HPO40．66g、CaCl20.075g、水8．6mL,pH5．5,变温培养,前30h28℃、后30h为23℃,培养时间为60h。采用最适培养基和优化工艺,在250mL三角瓶中进行验证实验,酸性蛋白酶酶活可达12586U/g,果胶酶和纤维素酶分别为16490U/g、9822U／g。     

宇佐美曲霉L336酸性蛋白酶的动力学性质*

L336酸性蛋白酶的分子量为54000,等电点为3．8±0．2。在pH2．5,40℃条件下,酶对酪蛋白、牛血清白蛋白和牛血红蛋白的Km值分别为0．263g／L、0．278g／L和0．415g／L,Vmax分别为2075、1550和2793μgTyr／min、mL,酪蛋白为最适底物。在pH2．0～5．0、40℃以下时酶的稳定性最好。此外,还研究了金属离子对酶活性的影响。     

短小芽孢杆菌碱性蛋白酶的提纯和性质的研究

由短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)209产生的胞外碱性蛋白酶的粗酶制剂(5×10 4u／g),经硼砂NaOH缓冲液抽提,硫酸铵沉淀,Sephadex G一25脱盐,DEAE-纤维素柱层析,冷冻干燥获得部分纯化的酶。纯酶的活力为199x10u/g,比活力提高2,6倍。此酶的最适pH8．5—9．0,在pH6一10之间稳定,因此是属于微碱性蛋白酶“’。最适温度为50℃,在50℃以下稳定,在60℃处理10分钟活力损失95％。0.003村c丑件的存在对酶的热稳定性和pH稳定性均有显著提高。Ag+,Cu2+,Fe2+,Hg+,Zn2+ 对酶有抑制作用;Mn2+有明显的激活作用;1×10-3M的PCMB,IAA,O-PTH,PMSF对活力无影响;1×10-3M EDTA对酶有30％的抑制作用;在40℃用NBS(1×10-4M)、DFP(2．5mM)对醢进行10分钟处理,酶活力完全损失。此酶能水解多种天然蛋白,如酪蛋白、血红蛋白、蛇毒蛋白等,不水解鱼精蛋白和溶菌酶。以酪蛋白为底物测得的km值为0．66×10-2g／ml。在pH7．3进行圆盘凝胶电泳,虽然呈现九条带,但均具有大小不等的蛋白酶活力。     

乳酸菌Enterococcuse faecalis TN-9低温蛋白酶的提纯及性质

对产自乳酸菌Enterococcuze fecalis TN-9的蛋白酶,进行了硫酸铵沉淀,DEAE—Sephadex A-25以及DEAE Cellulofine A-500离子交换层析的3步纯化和特性研究。纯化酶Native PAGE显示1条蛋白带。SDSPAGE和凝胶层析分子量分别为30ku及69ku。纯化酶最适作用温度为30℃,最适作用PH为7．5～8．0,在pH6．0～9．5和45℃以下条件下稳定,在0℃下显示了6．1％的相对活性,60℃以上热处理完全失去酶活。该酶被EDTA-2Na,Hg^2＋、Cu^2＋、Ni^2＋、Ag^2＋、Co^2＋及Pepstatin A不完全抑制。Zn^2＋对蛋白酶具有明显的激活作用。纯化酶作用于偶氮酪蛋白的Km和Vmax分别为0．098％和72mg／（h·mg）。该酶为N末端VGSEVTLKNS的明胶酶（Gelatinase）的一种,性质属于低温蛋白酶。     

棒曲霉Asp-195v产蛋白酶的酶学性质研究

对液体发酵的棒曲霉Asp-195v菌株所产蛋白酶的活力进行了研究,并通过分离纯化获得了电泳纯的酶蛋白。研究结果表明,该蛋白酶的最适反应温度为40℃,在30-50℃温度范围内相对活力可保持在70%以上;最适pH为7,pH稳定范围在4-8;Mn2+对该蛋白酶活力有明显的激活作用,K+、Ag+、Cu2+、Fe2+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Al3+和Fe3+离子则有明显的抑制作用,尤其是Hg2+和Pb2+对酶活的抑制作用更加强烈;其他试剂如葡萄糖、EDTA对酶活的抑制作用不明显,而蔗糖、SDS和Tween-20对酶活的抑制明显;以酪氨酸为底物采用双倒数作图法测得Vmax为30.40mmol/min,Km为97.53mmol/L。该酶的表观分子量为30.1kDa。     

蓖麻蚕核型多角体碱性蛋白酶的分离与性质

本文证明在蓖麻蚕核多角体中也存在着碱性蛋白酶,该酶在Na_2CO_3碱性溶液中能使多角体蛋白质降解,最适pH为11—12,最适温度约为40℃,在60℃以上严重失活,重金属Hg~(+2),Cu~(+2)离子对酶活性有较强的抑制作用,而Na~+,Mg~(+2)离子影响不大。本文采用ConA-Sepharose亲和层折一步分离了蓖麻蚕核多角体碱性蛋白酶,简化了分离过程。     

宇佐美曲霉酸性蛋白酶的研究II．537酸性蛋白酶提纯及性质

由字佐美曲霉(Aspergillus usamii)537产生的酸性蛋白酶粗酶制剂,通过硫酸铵饱和度为45--65％的分部沉淀、离子交换树脂脱色、Sephadex G 2 5脱盐、DEAE‘$ep“ad。‘A一25层析可得到比活为2037u,mg的纯酶,为原粗酶比活的12倍,在Davis凝胶电泳中得到一条带。     

地衣芽孢杆菌JF-UN122碱性蛋白酶的分离纯化与性质

地衣芽孢杆菌JF—UN122的发酵液,以硫酸铵分段盐析得粗酶,再经DEAE—Sephadex A—50吸附色素、CM—Sephadex C-50离子交换及Sephadex G—75柱层析等步骤获得电泳纯的碱性蛋白酶。SDS-PAGE测得其分子量为31．6KDa。以酪蛋白为底物时,酶的Km为5．26μg／min,Vm为20．8μg／min。酶的最适pH为9．0,最适温度为55℃,pH5～11,55℃以下酶较稳定,对1mol／LH2O2具有一定的耐氧化性。PMSF对酶抑制,二硫苏糖醇(DTT)有保护作用,钙离子、EDTA、SDS、尿素等对酶无明显影响。     

嗜热芽孢杆菌XJT—9503高温中性蛋白酶的研究 Ⅱ.酶的提纯及酶学特性研究

嗜热芽孢杆菌XJT—9503菌的发酵液经硫酸铵和丙酮分级沉淀分离纯化得到聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的高温中性蛋白酶制品。SDS—PAGE测得酶分子量为3000。当以酪蛋白为底物时,酶反应最适温度为65℃,最适pH为7．在PH6．5—9范围内稳定。在65℃、0、02MpH7．5的磷酸缓冲液中的半衰期为54min。金属离子铜、汞、铝强烈抑制酶活,钙离子,镁离子对酶活有促进作用。     

蚕丝脱胶问题的研究III．S114蛋白酶对绢纺原料脱胶的应用

本文以木薯茧及桑蚕茧为底物,对蛋白酶的基本性质进行了研究,证明水解木薯茧丝胶最适pH为7—8,最适温度为55℃,在浴比为1：15的条件下最适酶用量为3—5u/ml,酶在45℃、60分钟内活力基本稳定,经蛋白酶水解后丝纤维强度不受影响,证明S114中性蛋白酶可以应用于木薯茧绢纺原料的脱胶,     

产低温蛋白酶极地菌株的筛选及Pseudoalteromonas sp. QI-1产蛋白酶粗酶性质

通过酪蛋白平板法从实验室极地微生物资源库中筛选到130株在低温条件(4℃)下具有蛋白酶活性的菌株,并对部分酪蛋白水解圈较大的菌株进行了酶活测定和系统发育分析。发现酶活较高的8株菌分别属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、科尔韦尔氏菌属(Colwellia)、希瓦氏菌属(Shewanella)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)。选择低温蛋白酶活性较高的菌株Pseudoalteromonas sp.QI-1为研究对象,以酪蛋白为反应底物对其所产低温蛋白酶粗酶酶性质进行初步研究。结果表明:QI-1低温蛋白酶酶活最适反应温度为40℃,在0℃时保持10%的相对酶活,酶活最适反应pH为10.0;其催化作用不需要金属离子的参与;热稳定性极差,在60℃放置15 min即完全失活。     

固氮鱼腥藻的蛋白水解酶及其部分性质的研究

应用溶菌酶处理,超声破碎细胞,通过差异离心和解离剂处理,将细胞的不同部分分开。以水解α-酪蛋白反应检测蛋白水解酶活性,结果表明,在细胞的可溶部分、内细胞质膜、外膜及胞浆周围区均存在蛋白水解酶活性。异形胞可溶部分的蛋白酶活比营养细胞可溶的蛋白酶活高4—5倍。在固氮条件下,营养细胞可溶性蛋白酶反应最适温度为50—55℃,65℃时,酶活迅速下降。有Ca^2 5mmol／l时,蛋白酶在60℃稳定,无Ca^2 存在下,酶液在60℃预处理10分钟,酶活性丧失80％以上。酶反应的最适pH为8—10。而且氮饥饿之后,培养基的pH值对细胞蛋白酶活水平有明显影响,氮饥饿24小时内,蛋白酶活迅速增加,但在碱性条件下,酶活水平比在中性条件下要高得多。邻菲哕啉对蛋白酶活性有严重的抑制,EDTA仅有轻微抑制,而PMSF对细胞蛋白酶活的抑制作用,与细胞氮饥饿时间有关。     

有机磷农药在水生态系中生物净化机理研究——1.对硫磷的酶解

从氧化塘系统中分离出能降解对硫磷的细菌Pseudomonas sp.代号CTP-01,能将对硫磷分解成对硝基酚和二乙基硫代磷酸酯,并进一步分解对硝基酚。在有Cu++存在的情况下,酶比活可以达到1×104毫微克分子/毫克蛋白/分钟,Cu++对酶有激活作用,并对温度和pH影响有保护作用。对硫磷水解酶反应最适温度为40—50℃,超过50℃活性急剧降低,80℃完全失活。 CTP-01的对硫磷水解酶大部分是同膜片结合状态存在,超声破碎的无细胞酶制剂中,只有37.2%的活力存在于可溶性蛋白部分。       

烟管菌漆酶的分离纯化及部分酶学性质研究

烟管菌Bjerkandera adusta WZFF．W-Y11漆酶粗酶液经过丙酮分级沉淀、DEAE-Cellulose离子交换层析、Sephadex G-100凝胶过滤,得到了三种电泳纯的漆酶同工酶,总酶活回收率达到65．5％,其中LacA平均纯化了29．2倍,LacB纯化了5．1倍,LacC纯化了18．5倍;三种同工酶的分子量分别为LacA：68．7kDa、LacB：80．2kDa、LacC：77．2kDa。LacA、LacC氧化愈创木酚的Km,大于氧化ABTS的Km,最适作用温度在45．70℃,最适反应pH3．0-5．5,65℃时LacC比LacA稳定,LacC在pH3．5—6．0稳定,LacA在pH5．0-9．0稳定,A1^3对LacA、LacC的酶活有促进作用,C1、Fe^3＋、Hg^2＋抑制LacA、LacC的酶活,Cu^2＋抑制LacC的酶活,而对LacA的活性没有明显影响。     

草鱼肠道肝胰脏蛋白酶活性初步研究

对不同种类不同蛋白质水平的饲料与草鱼肠道、肝胰脏蛋白酶活性之间的关系,对草鱼前、中和后肠蛋白酶活性的差异,以及这些酶的最适酪蛋白浓度和最适pH值进行了测定研究。草鱼肠道和肝胰脏蛋白酶活性在饲料含蛋白质32—40％的范围内随着蛋白质含量的增加而升高。肝胰脏蛋白酶活性要比肠道稍高些。饲草草鱼肝胰脏蛋白酶比活为每毫克酶蛋白每分钟产生332．5微克酪氨酸,肠道蛋白酶比活为260．0微克酪氨酸。草鱼肠道蛋白酶活性以后肠较高,前、中肠次之。在pH4—9范围内,以酪蛋白作为底物,草鱼肠道、肝胰脏蛋白酶最大活性分别在pH6．5和pH7．0。在酪蛋白实际浓度为83．33—333．33微克／毫升范围内,肠道和肝胰脏蛋白酶最适酪蛋白浓度分别为166．67微克／毫升和208．33微克／毫升。     

产低温碱性蛋白酶海洋适冷菌SY的筛选

从连云港海域、港口、远洋捕捞船及鱼市等地采集的海水和各类海鱼、贝类等样品中分离到217株产蛋白酶的细菌,并从中得到1株产低温碱性蛋白酶的海洋适冷细菌—SY。研究表明,该菌株最适生长温度和最适产酶温度均在15℃左右,0℃下仍可生长;具有一定的耐盐性和嗜盐性,无盐条件不能生长,在3%的NaCl盐浓度时,生长达到最高峰;最适生长和最适产酶pH均为8.0;SY菌所产的蛋白酶可能为一种丝氨酸蛋白酶,酶最适作用温度为50℃,最适作用pH为9.0;酶的热稳定性差,50℃保温20min,酶活下降40%。