小鼠胚泡着床期子宫内膜LongSAGE基因文库构建

按照LongSAGE文库构建原理,先后经子宫内膜总RNA提取、cDNA合成、130bp双标签的产生、PCR扩增、34bp双标签形成、连接成串联体、与载体连接、转化大肠杆菌等相关步骤构建小鼠胚泡着床期子宫内膜LongSAGE基因文库。经证实所构建文库的阳性克隆率达100%,克隆中插入的串联体长度介于400￣500bp之间,成功构建了小鼠胚泡着床期子宫内膜LongSAGE基因文库。     

双专一性抗体介导的纤溶作用

用双功能团试剂将抗尿激酶单克隆抗体Ｎ３４的ＩｇＧ和抗人活经血小板α－颗粒膜蛋白ＧＭＰ－１４０单克隆抗体ＳＺ－５１的Ｆ,ａｂ片段通过二硫键共价偶联,偶联的抗体保留了对各自抗原的亲和性。这种对尿再生产血栓同时具有亲和活性的双专一性抗体（Ｎ３４－ＳＺ－５１）提高低分子量尿激酶的溶栓效率３８倍,且对血浆中纤维蛋白原的含量基本上影响。     

高分子量和低分子量尿激酶的分离纯化及动力学性质研究

人尿激酶粗品经苯甲脒亲和柱纯化和Ｐｒｏｔｅｉｎ－ＰａｋＳＰ柱分离后,得到两种分子量的尿激酶（ＵＫ）,即高分子量尿激酶（ＨＵＫ）和低分子量尿激酶（ＬＵＫ）,采用民斯亮蓝法测定蛋白质浓度,纤维蛋白板法测定活力,测得ＨＵＫ比活为２．９×１０＾５ＩＵ／ｍｇ蛋白,ＬＵＫ为３．５１０＾５ＩＵ／ｍｇ蛋白,活力回收为７０％以上,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定,ＨＵＫ和ＬＵＫ均呈单一条带,分子量分别为５４ｋＤ和３３ｋＤ,Ｈ     

霍乱弧菌脂多糖基因在大肠杆菌中的克隆

利用柯斯质粒pHC 79为载体,构建了霍乱弧菌178(埃尔托生物型,小川血清型)染色体基因文库。经血清凝集试验及菌落固相ELISA检测,从基因文库中筛选到13株能够表达霍乱弧菌脂多糖O抗原的阳性克隆。经热酚水法从转化于中提取并纯化的脂多糖能与霍乱弧菌抗血清发生特异性结合。针对重组柯斯质粒PMM—VO 38进行了多种酶切分析,测定其分子量为46kb。     

基因库构建

924350由可变基因文库产生抗体的细胞筛选法:存储库的收集[英〕/Hawkins,R.E.…/Eur.J.Im-munol一1992,22(3)一567~570〔译自DBA,1992,11(11),92一06028」 用(4一羚基一3一硝基苯酚)乙酸(NP)一家禽势球蛋白免疫小鼠,初次免疫后7天收集脾细胞。由用抗原包被磁性珠粒筛选的细胞DNA制备重链可变(VH)基因文库,再由未筛选细胞的DNA或mRNA制备基因文库。VH基因文库与V一入一1基因结合,该基因以Fv片段形式在大肠杆菌中表达,并通过结合(4一经基一3一碘一5一硝基苯酚)乙酸一家畜血清清蛋白而进行筛选。抗原结合克隆的频率,筛选细胞DNA或…     

高分子量和低分子量尿激酶的分离纯化及动力学性质研究

人尿激酶粗品经苯甲脒亲和柱纯化和Protein-PahSP柱分离后,得到两种分子量的尿激酶（UK）,即高分子量尿激酶（HUK）和低分子量尿激酶（LUK）．采用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度,纤维蛋白平板法测定活力,测得HUK比活为2.9×105IU／mg蛋白,LUK为3.5×105IU／mg蛋白,活力回收为70％以上．经SDS-PAGE鉴定,HUK和LUK均是单一条带,分子量分别为54kD和33kD．HUK和LUK水解显色底物S2444的动力学常数,分别测得HUK的Km为64μmol/L,Kcat为15s-1,LUK的Km为49μmol／L,kcat为13s-1,LUK的催化效率（Kcat／Km）稍高于HUK．     

粪产碱菌(Alcaligenes faecalix)基因文库的构建和nifH基因同源顺序的克隆

采用λ噬菌体置换型载体EMBL4,构建了Alcaligenes faecalis A-15 H1菌株总DNA的基因文库。用Sau3AⅠ限制酶完成部分酶切,取13—20kb大小的片段进行克隆。载体DNA经BamHⅠ和SaiⅠ完全双酶切,左右臂“退火”形成左右臂载体分子后再与外源片段连接。左右臂载体分子与外源片段按照1:1的分子比进行体外连接。用E.coli BHB2688和E.coli BHB2690制备的包装抽提物进行体外包装,所得基因文库效价测定为1.2×10~6 pfu,远远超过理论上所需的库容量。以nif H基因作为探针,经3轮噬菌斑原位杂交,从基因文库中筛选出含有其同源顺序的克隆,并得到了梯度点杂交的验证。对所得重组噬菌体克隆之一进行Southern转移杂交,结果证实,其3.5kb的EcoRⅠ酶切片段为nif H阳性杂交条带。将其克隆到质粒pUC19 DNA上后,转入受体菌JM101中。再次经Southern转移杂交,证明所得重组质粒克隆(pAFH)含有粪产碱菌中的与nifH基因有同源顺序的片段。     

国际稻IR_(26)核基因组基因文库建成

基因文库是遗传工程的一种新技术。目前国内外在人类与动物中已经建成了多种基因文库,但在植物中则建成的还很少,水稻更尚未见报导。一般建造基因文库常用一种λ噬菌体的缺陷型Charon4A作为载体,我们则采用了近年来由Collins等所创造、运载量较大而操作却比较简便的一种新型杂种质粒——科斯质粒(Cosmid)作为载体,首次建成了带有多种抗病基因的国际水稻IR_(26)。核基因组基因文库。     

新型溶血栓剂——低分子量单链尿激酶

尿激酶是由人肾合成人尿释放的一种血纤溶酶原激活剂(Plasminogen Activator)。尿激酶以多种分子形式存在,主要有三种,一种是高分子量双链尿激酶,它的分子量为54000道尔顿,由A、B两条肽链组成,A、B二链由二硫键相连。     

国际稻IR_(26)核基因组基因文库建成

基因文库是遗传工程的一种新技术。目前国内外在人类与动物中已经建成了多种基因文库,但在植物中则建成的还很少,水稻更尚未见报导。一般建造基因文库常用一种λ噬菌体的缺陷型Charon4A作为载体,我们则采用了近年来由Collins等所创造、运载量较大而操作却比较简便的一种新型杂种质粒——科斯质粒(Cosmid)作为载体,首次建成了带有多种抗病基因的国际水稻IR_(26)。核基因组基因文库。