RNA病毒遗传重组研究进展

RNA病毒是以RNA作为遗传物质的病毒。RNA病毒的基因组经历着快速的进化,呈现高度的遗传多样性,单个RNA病毒的子代常包含相似而不相同的病毒[1]。RNA病毒基因组高度的遗传变异性主要原因有[2]:①突变:病毒进入宿主细胞后,由RNA复制酶(依赖于RNA的RNA聚合酶,RdRp)催化RNA的复制。     

重组西尼罗病毒NS5融合蛋白依赖RNA的RNA聚合酶特性鉴定

西尼罗病毒(West Nile virus, WNV)非结构蛋白NS5是病毒基因组复制的关键蛋白.以病毒全长cDNA克隆为模板,PCR扩增获得NS5的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)活性区（NS5pol）及该蛋白完整的编码序列（NS5F）,分别克隆于原核表达载体pET-28a 并转化至大肠杆菌E.coliBL21（DE3）中诱导表达.表达的可溶性重组蛋白经Ni柱亲和层析纯化后进行SDS-PAGE和Western印迹鉴定.结果显示,二者均为病毒特异蛋白,且纯度均在90%以上.进一步的体外RdRp分析及EMSA的结果表明,NS5pol和NSF5均有较高的RdRp活性,且该活性具有RNA模板序列和二级结构的特异性.获得的具有RdRp活性的NS5pol和NS5F为西尼罗病毒基因组复制相关元件的研究奠定了基础.     

RNA病毒基因组和转录复制多样性的分子基础

自然界中RNA病毒的种类和数量比DNA病毒多得多,根据基因组类型,RNA病毒可分为多种类型,许多研究者认为,存在于古细菌Myxobacteria中,仅仅有一个逆转录酶基因的反转子（Retron)可能是所有病毒的祖先,进化的模式如下,反转子→反座子→反转录转座子→反转录病毒→副反转录病毒→DNA病毒,RNA病毒转录。／复制在很多特征上与DNA病毒迥然不同,依赖于RNA的RNA聚合酶是RNA病转录／复制的主要催化剂,RNA病毒基因组转录和复制都从3'端poly(A)或类tRNA结构或其他结构起始,内部终止是转录,通读到5'末端终止是复制,RNA病毒的模板有正链病毒（RNA模板,负链病毒RNA模板和全长正负链反基因组RNA模板,RNA模板的选择调控机制非常复杂,目前知之甚少,选择模板,RNA聚合酶与转录因子结合形成复制体是两种主要的调控方法,另外,5'UTR和3'UTR也可以调控RNA病毒的转录。     

棉铃虫5型质型多角体病毒RNA聚合酶的确定与功能机制研究

棉铃虫5型质型多角体病毒属于呼肠孤病毒科质型多角体病毒属,以重要农业害虫棉铃虫为其天然宿主,对棉铃虫的生物控制具有重要意义.本文对棉铃虫5型质型多角体病毒第3片段编码的蛋白的功能进行了初步研究.首先通过同源性对比,推测其所编码的蛋白可能行使RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)的功能.通过体外活性研究确定了该蛋白的RdRP活性,并确定了其保守活性位点GDD.随后以病毒基因组RNA和3′-OH封闭的病毒基因组RNA为模板,利用Northern blot方法研究该蛋白起始病毒基因组RNA合成的分子机制.结果表明,该病毒的RdRP主要通过引物非依赖的方式起始病毒基因组RNA的合成,并且该RdRP蛋白并不具有末端转移酶活性.最后,对RdRP行使功能的生化条件进行探索,发现RdRP功能的发挥需要二价金属离子Mg2+的存在.     

HCV NS5B蛋白对HCV RNA的模板特异性研究

在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中表达并纯化HCV的依赖于RNA的RNA多聚酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp,NS5B蛋白).以HCV正、负链RNA 3′末端的序列为模板,体外研究NS5B蛋白催化的RNA合成.结果显示,正链RNA在体外不能指导RNA合成,而负链RNA模板可以产生一条全长的正链RNA产物,表明NS5B对负链RNA具有模板特异性.NS5B对负链RNA的特异性在模板竞争性实验中得到进一步证实,正链RNA的存在和竞争对以负链为模板的RNA合成没有影响.这样,就合理解释了在HCV RNA复制时正链RNA的数量远比负链RNA多这一问题.同时,本实验的结果也为进一步研究病毒或其它细胞因子参与以正链RNA为模板进行的RNA合成,以及有关负链RNA模板特性的研究奠定了基础.     

RNA病毒RNA依赖的RNA聚合酶的结构与功能

RNA病毒一般传播迅速,给人类和自然造成巨大危害和威胁.许多RNA病毒的结构蛋白在基础研究和应用方面已日趋完善.相比之下,就非结构蛋白(NS)所做的研究较少,存在许多未知问题.在这些非结构蛋白中,病毒自身编码的RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)对病毒的复制起关键作用.对RdRP的研究不仅使对病毒RNA复制的机制更精细明了,且有可能提供新的抗病毒靶标和诊断试剂.本文对RdRP特别是动物RNA病毒RdRP的结果与功能作一综述.     

从茶尺蠖中分离到一株微小RNA病毒

从核型多角体病毒(NPV)感染致死的茶尺蠖幼虫尸体中分离到一株微小RNA病毒(EoPV)透射电镜观察纯化的病毒粒子为无囊膜、无表面特征、直径约26nm的球状颗粒。16％的SDS-PAGE显示它有两个分子量为31．5kDa和28．8kDa的衣壳蛋白，后者的含量是前者的2、5倍。3′端克隆序列分析表明EoPV基因组3′有poly(A)尾，编码RNA聚合酶(RdRp)，含有微小RNA病毒RNA聚合酶的八个保守基序，同源性分析表明它与榕透翅毒蛾微小RNA病毒(PnPV)亲缘关系最近。这些特点表明该病毒为一株新的微小RNA病毒。     

HCV NS5B蛋白对HCV RNA的模板特异性研究

在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中表达并纯化HCV的依赖于RNA的RNA多聚酶(RNAdependentRNApolymerase,RdRp,NS5B蛋白)。以HCV正、负链RNA3′末端的序列为模板,体外研究NS5B蛋白催化的RNA合成。结果显示,正链RNA在体外不能指导RNA合成,而负链RNA模板可以产生一条全长的正链RNA产物,表明NS5B对负链RNA具有模板特异性。NS5B对负链RNA的特异性在模板竞争性实验中得到进一步证实,正链RNA的存在和竞争对以负链为模板的RNA合成没有影响。这样,就合理解释了在HCVRNA复制时正链RNA的数量远比负链RNA多这一问题。同时,本实验的结果也为进一步研究病毒或其它细胞因子参与以正链RNA为模板进行的RNA合成,以及有关负链RNA模板特性的研究奠定了基础。     

RNA复制子疫苗

RNA复制子是自主复制的RNA,保留了病毒复制酶基因,而结构蛋白基因缺失,由外源抗原基因取代,复制酶可控制载体RNA在胞浆中高水平复制和外源基因的高水平表达。用于开发复制子的主要是单股正链RNA病毒,如甲病毒(辛德比斯病毒、塞姆利基森林病毒、委内瑞拉马脑炎病毒)、黄病毒(登革热病毒、昆津病毒)、小RNA病毒(脊髓灰质炎病毒、人鼻病毒)、副粘病毒(犬瘟热病毒)、杯状病毒(猫杯状病毒)。基于复制子的疫苗不会产生能复制的感染性病毒粒子,不可能与细胞基因组发生整合,但可诱导全身免疫和粘膜免疫以及MHCI限制性CTL反应,而不受体内已有载体抗体的干扰。目前已开发了大量基于复制子的疫苗和肿瘤的治疗性和预防性疫苗,并在很多疾病模型上取得成功,包括病毒(流感病毒、人免疫缺陷病毒、拉沙病毒、马尔堡病毒、呼吸道合胞体病毒、诺沃克样病毒、马动脉炎病毒等)肿瘤(人乳头瘤、癌胚抗原、B16肿瘤、小鼠黑素瘤等)、以及细菌毒素(肉毒杆菌毒素、葡萄球菌肠毒素、破伤风毒素等)。     

丙型肝炎病毒依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)研究进展

由于缺乏合适的HCV感染细胞模型,严重制约了HCV复制,特别是HCV复制的关键因子依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)的研究.对HCV序列比较分析并通过异源表达证明NS5B是HCV复制的RdRp.NS5B C端疏水性氨基酸区域以及NS5B与细胞膜形成复合体等影响NS5B溶解性.在合适的反应条件下NS5B可以多种RNA分子为模板催化RNA复制,特别是能有效复制HCV全长(+)RNA.高浓度GTP激活HCV RdRp活性.NS5B N/C端缺失突变和保守性A、B、C区中的点突变影响RdRp活性,但D区345位精氨酸突变为赖氨酸时RdRp活性明显升高.HCV RdRp的发现及其功能研究为HCV药物研究提供了新型靶标.     

流感病毒的分子生物学研究进展

流感病毒是分节段的负链RNA病毒,由RNA依赖的RNA聚合酶起始病毒的复制。流感病毒的特殊基因组结构和病毒蛋白的功能使其极易发生抗原转换和抗原漂移,这使得病毒能够逃避多种宿主的长效中和性免疫反应。本文从病毒结构、基因组及其编码蛋白质、病毒复制过程和病毒的易感宿主等几方面论述了流感病毒的分子生物学研究进展。     

利用小RNA深度测序技术检测灰飞虱病毒种类

灰飞虱是一种重要农业害虫,作为病毒介体,可以传播多种植物病毒引起水稻、小麦和玉米等粮食作物病毒病害。目前对于灰飞虱体内昆虫病毒种类尚缺乏系统认识,难以开展利用昆虫病毒防治灰飞虱相关研究工作。为挖掘灰飞虱体内昆虫病毒资源,本文通过小RNA深度测序技术对灰飞虱所携带的病毒种类进行分析鉴定。结果显示,测序数据比对得到13种病毒,涉及8个病毒科和2种未分类病毒。除占据优势的水稻条纹病毒外,其余均为专性寄生的昆虫病毒,包括5种正链RNA病毒、2种单链DNA病毒和5种双链DNA病毒。在这些病毒中,发现了一种与果蝇A病毒较相似的新病毒,克隆出其依赖RNA的RNA聚合酶(RdRP)基因1-1 932位核酸序列,经Blast比对和系统进化分析,在氨基酸序列中发现RdRP掌型亚结构域保守区呈现复制酶置换四体病毒科(Permutotetraviridae)病毒所具有的“C-A-B”排列样式,确定该病毒是一种新的类复制酶置换四体病毒,暂命名为Laodelphax striatellus permutotetra-like virus(LsPLV)。这是首次在半翅目昆虫中发现类复制酶置换四体病毒。本研究表明灰飞...     

我国诺如病毒易重组基因型GII.P12/GII.3毒株RNA聚合酶的表达与功能表征

[背景]诺如病毒是引起人类急性胃肠炎的主要食源性病原体.目 前尚无获批的诺如病毒疫苗和药物,诺如病毒RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)是当前抗诺如病毒药物开发的主要靶点.[目的]表达我国诺如病毒易重组基因型GII.P12/GII.3毒株的RdRp并系统地表征其复制特征.[方法]基于大肠杆菌系统表达并纯化得到高纯度可溶...     

野田村病毒RNA的复制机制

野田村病毒科Nodaviradae分为2个属,分别为主要感染昆虫的α野田村病毒属(Alphanodavirus)和主要感染鱼类的β野田村病毒属(Betanodavirus)。野田村病毒的基因组由2条单链正义RNA分子(RNA1和RNA2)所组成,RNA1编码蛋白A,即病毒负责复制病毒两条基因组的依赖RNA的RNA聚合酶催化亚基。RNA2编码衣壳前体蛋白α,此前体蛋白α先组装成原病毒粒子,再经历一次自我催化的成熟切割成2个病毒的衣壳蛋白β和γ,就成了成熟的有感染性的病毒粒子。在RNA复制过程中,从RNA1的3′末端会合成一个不被包装进病毒粒子的亚基因组RNA3。RNA1能在无RNA2的情况下自我复制,并持续地产生亚基因组RNA3,RNA3的合成采取的是提前终止机制。本文还介绍了野田村病毒复制的调节、非结构蛋白的功能和病毒复制在细胞内的定位。     

逆转录病毒基因组RNA的二聚作用

逆转录病毒科(Retroviridae)是一成员众多、易变异的RNA病毒科.在逆转录病毒复制周期内,所有逆转录病毒均将两拷贝的单股正链RNA带入病毒粒子[1,2].在此过程中,遗传物质--基因组RNA能顺利包装入病毒粒子是病毒复制与繁衍的关键,而基因组RNA通过二聚作用(Dimer-ization)形成二聚体(Dimer)是包装逆转录病毒的前提.     

草鱼呼肠孤病毒RNA聚合酶基因功能区在原核细胞中的表达

草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus)为我国分离、鉴定的第一株水生动物病毒.1983年,我国首次报道引起爆发性草鱼出血病的病原为草鱼出血病病毒[1,2],其后相继进行了系统的病毒形态学、生物学、生物化学及分子生物学特性等研究[3-8].自1979年Meyers T R等报道从水生动物中分离出第一株呼肠孤样病毒,迄今国际上已分离鉴定40余种水生呼肠孤病毒(aquareovirus).在这些分离株中,大多数毒株不能引起寄主的病理反应或仅表现出较弱的致病性.然而研究认为,GCRV为水生呼肠孤病毒中致病力最强的毒株[9].可见,以GCRV为模型,研究水生呼肠孤病毒的复制与致病机理具有一定的理论及实际意义.我们在对GCRV反应核心及体外转录研究中,已证实GCRV RNA聚合酶在病毒粒子中的存在及其位置[5];GCRV序列测定及定位结果显示,GCRV-VP2多肽为该病毒RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase RdRp)[6,7].为了探讨草鱼呼肠孤病毒的侵染与宿主的相关性及复制机制,我们首次进行了该病毒RNA聚合酶基因(GCRV-RdRp)功能区序列在原核细胞中的表达研究,并得到高效表达融合蛋白.这一结果将为该酶的活性及特性分析提供实验依据.下面报道本研究结果.     

草鱼呼肠孤病毒RNA聚合酶基因的表达与产物纯化

草鱼呼肠孤病毒是引起草鱼出血病的主要病原,隶属于呼肠孤病毒科水生呼肠孤病毒属。序列分析表明,GCRVS2片段长为3877核苷酸,编码一个分子量为138kDa的蛋白VP2,具有RNA聚合酶性质。为进一步了解该病毒RNA聚合酶特性,本研究在对GCRV RNA聚合酶基因(GCRV—RdRp)保守区(约1．5kb)重组质粒pR／RRp高效表达的基础上,分别构建了编码GCRV RNA聚合酶保守区N端与C端部分基因的pR／RRpN及pR／RRpC重组表达载体,并在原核细胞中获得成功表达。筛选的重组表达菌株经IPTG诱导培养,得到分子量分别为98kDa、103kDa的目的表达融合蛋白。Western blot分析表明,该表达产物与兔抗GCRV—VP2血清呈阳性反应。通过ProBond柱亲和层析,纯化了融合有6个组氨酸的重组表达产物,并获得约90％纯的目的蛋白。上述结果为GCRV RNA聚合酶特性分析提供了依据。     

中蜂囊状幼虫病毒RdRp基因dsRNA干扰的研究

中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)可以引起中蜂幼虫死亡,给中蜂的养殖造成严重的威胁。其RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)是病毒复制中必不可少的中心酶,控制着病毒的复制和翻译过程。本研究以CSBV RdRp基因为靶标,选取两个干扰区域RdRp-1和RdRp-2,并构建相应的dsRNA表达载体,获取dsRNA后进行RNAi实验,通过qRT-PCR检测CSBV RdRp基因的表达情况。实验结果显示:干扰片段RdRp-1不能显著下调RdRp基因的转录,而干扰片段RdRp-2可显著性下调RdRp表达并具有剂量依赖性,当添食2μg dsRdRp-2时,在72 h RdRp基因表达下调了85%,CSBV的衣壳蛋白VP1基因下调表达78%,幼虫死亡率降低60%,表明RdRp基因可以作为RNA干扰的靶标用于CSBV防治,本研究为后期在养蜂场进行蜜蜂病毒病的防治奠定了基础。     

东部马脑脊髓炎病毒的分子生物学进展

东部马脑脊髓炎病毒属虫媒病毒,能引起人和马发生急性脑炎。东马病毒为单股正链RNA病毒,可分为南美型和北美型,包括两个开放读码框架,分别编码结构蛋白（E1,E2,E2,C,6K）和非结构蛋白（nsp1,nsp2,nsp3,nsp4)。其中E1/E2包膜糖蛋白以异二聚体的形式病毒颗粒外刺突。非结构蛋白主要能与负链RNA的合成,近来,随着研究深入,病毒受体越来越受到广泛关注。本介绍东部马脑脊髓炎病毒结构、进化、复制、组装等方面的分子生物学进展。     

正链RNA病毒起始RNA合成分子机制的研究进展

正链RNA病毒大多是人类和动植物的重要病原体,如脊髓灰质炎病毒(PV)、口蹄疫病毒(FMDV)、丙型肝炎病毒(HCV)、登革热病毒(DEV)、西尼罗河病毒(WNV)以及严重急性呼吸综合症病毒(SARS)等,都给人类的健康以及动植物的生长带来严重危害,造成巨大的经济损失。病毒基因组RNA的复制是病毒生命周期中一个重要环节,目前在临床上应用的许多药物都是针对病毒基因组RNA的复制而设计的,