Synthese von Phosphoenolpyruvat aus Pyruvat durch Extrakte aus Hydrogenomonas eutropha Stamm H 16

Zusammenfassung Zellfreie Extrakte aus Hydrogenomonas eutropha Stamm H 16 katalysieren die Biosynthese von Phosphoenolpyruvat aus Pyruvat und Adenosintriphosphat. Unter identischen Bedingungen erfolgte diese Synthese auch durch Extrakte aus Escherichia coli.Das Reaktionsprodukt Phosphoenolpyruvat wurde durch Papierchromatographie, durch Anwendung von radioaktivem Pyruvat und durch einen gekoppelten enzymatischen Test unter Einsatz eines gereinigten Präparates von 3-Desoxy-d-arabino-heptulosonsäure-7-phosphat Synthase, AMP wurde als zweites Produkt der PEP-Synthasereaktion nachgewiesen. Die Versuchsergebnisse lassen darauf schließen, daß der Stamm H 16 über ein Enzym verfügt, welches Pyruvat direkt phosphoryliert.

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Biosynthesis of phosphoenolpyruvate from pyruvate by extracts from Hydrogenomonas eutropha strain H 16

Summary Crude extracts from Hydrogenomonas eutropha strain H 16 catalyze the biosynthesis of phosphoenolpyruvate from pyruvate and adenosine triphosphate. Under identical conditions extracts from Escherichia coli synthesized phosphoenol-pyruvate from pyruvate also.The reaction product phosphoenolpyruvate has been identified by paper chromatography, by employing radioactive pyruvate and by a coupled enzyme assay, using a purified preparation of 3-deoxy-d-arabino-heptulonic acid-7-phosphate synthase. AMP has been found as the second product of the PEP-synthase reaction. From these results it is concluded that strain H 16 contains an enzyme phosphorylating pyruvate directly.

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Abkürzungen DAHP 3-Desoxy-d-arabino-heptulosonsäure-7-phosphat - DTT Dithiothreitol - PEP Phosphoenolpyruvat - P ortho-Phosphat - PP Pyrophosphat     

NADP- und NAD-spezifische Isocitrat-Dehydrogenase in Hydrogenomonas eutropha Stamm H 16

Zusammenfassung Aus einem Rohextrakt von Hydrogenomonas eutropha Stamm H16-Fructosezellen wurden eine NADP- und eine NAD-spezifische Isocitrat-Dehydrogenase teilweise gereinigt und getrennt. Beide Enzyme sind in ihrer Affinität zum Isocitrat und zu NADP bzw. NAD sehr ähnlich. Beide Enzyme werden durch ATP gehemmt, das NADP-abhängige Enzym wird außerdem durch AMP und ADP aktiviert. Das NAD-abhängige Enzym wird durch NADH₂ gehemmt. Beide Enzyme werden stark gehemmt, wenn Glyoxylat und Oxalacetat gemeinsam dem Reaktionsgemisch zugesetzt werden.

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NADP- and NAD-specific isocitrate dehydrogenase in Hydrogenomonas eutropha Strain H 16

Summary From crude extracts of fructose-grown cells of Hydrogenomonas eutropha strain H 16 both a NADP- and a NAD-specific isocitrate dehydrogenase have been separated and partially purified. With respect to their affinity for isocitrate and NADP or NAD, respectively, both enzymes are very similar. Both enzymes are inhibited by ATP, the NADP-dependent enzyme is activated by AMP and ADP in addition. The NAD-specific enzyme is inhibited by NADH₂. Both enzymes are highly inhibited if glyoxylate and oxalacetate are concomitantly added to the enzyme reaction mixture.

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Verwendete Abkürzungen CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid - DEAE Diäthylaminoäthyl - TCC Tricarbonsäurecyclus - Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan     

Harnsäureabbau und Biosynthese der Enzyme Uricase,Glyoxylatcarboligase und Urease bei Hydrogenomonas H 16

Zusammenfassung Die Veränderungen der Uricase-, Glyoxylatcarboligaseund Ureaseaktivität wurden in Hydrogenomonas H 16 Zellen während der Inkubation mit Harnsäure, Allantoin und in stickstoffreiem Fructosemedium untersucht.Übertragen in ein harnsäurehaltiges Medium stiegen die spezifische Aktivität von Uricase und Glyoxylatcarboligase innerhalb von 2–3 Std auf 35 bzw. 1000 mole Substrat/min/g Protein an und sanken wieder ab, nachdem das Substrat verbraucht worden war. Der Harnsäureabbau wurde durch Fructose schwach gefördert und durch zusätzlich verabreichte Ammoniumionen nicht beeinflußt.In Gegenwart von Allantoin wurde nur Glyoxylatcarboligase mit voller Syntheserate gebildet, während Uricase nur einen vorübergehenden schwachen Anstieg zeigte.Beim Harnsäureabbau wurden Harnstoff und Ammoniak im molaren Verhältnis von etwa 1:2 freigesetzt und im Medium angehäuft. Dabei wurde die Ammoniakbildung offenbar nicht durch Urease katalysiert.Urease wurde während des Wachstums mit Harnsäure und mit Allantoin nicht gebildet, bedingt durch die Anhäufung von Ammoniumionen. Eine ausgeprägte Ureasesynthese erfolgte dagegen unter N-Mangelbedingungen, ohne daß hierbei die Uricase-oder Glyoxylatcarboligaseaktivität anstieg. Diese Beobachtungen lassen erkennen, daß Urease im Gegensatz zu anderen am Harnsäureabbau beteiligten Enzymen nicht durch ihr Substrat induziert wird. Vielmehr unterliegt die Ureasebildung bei Hydrogenomonas H 16 ausschließlich der Kontrolle durch Repression, wobei Ammoniumionen als reprimierendes Substrat wirksam sind.

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Uric acid degradation and biosynthesis of the enzymes uricase, glyoxylate carboligase and urease in Hydrogenomonas H 16 II. Effect of uric acid, fructose and nitrogen deficiency on enzyme formation

Summary Changes in uricase, glyoxylate carboligase and urease activity were determined in fructose grown Hydrogenomonas H 16 cells during subsequent incubation with uric acid, allantoin and in nitrogen-deficient fructose media.The specific activities of uricase and glyoxylate carboligase increased within 2–3 hours up to levels of 35 and 1000 moles of substrate/min/g protein respectively, when the cells were transferred to an uric acid containing medium. These enzyme levels decreased after the substrate was consumed. Uric acid degradation was slightly stimulated by fructose, but was not affected by the addition of ammonia.In the presence of allantoin only glyoxylate carboligase was synthesized at a full rate, while uricase exhibited only a slight, temporary increase.Urea and ammonia were liberated from uric acid and accumulated in the suspension at a molar ratio of approximately 1:2. This ammonia formation was apparently not catalyzed by urease.Urease was not formed during growth with uric acid and allantoin, presumably due to the accumulation of ammonia. A pronounced synthesis of urease was observed under nitrogen deficiency, under which conditions uricase and glyoxylate carboligase were not formed. These data indicate, that urease, unlike other enzymes of the uric acid degrading pathway, is not induced by its substrate. It is considered, that urease formation in Hydrogenomonas H 16 is controlled by repression only, with ammonium ions serving as the repressing substrate.

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Auszug aus der gleichlautenden Habilitationsschrift zur Erlangung der venia legendi der Landwirtschaftlichen Fakultät der Georg-August-Universität Göttingen.     

Verwertung von Fructose durch Hydrogenomonas H 16

Zusammenfassung Hydrogenomonas H 16 wächst gut auf Fructose, kann aber Glucose nicht verwerten. Die Fructoseoxydation wird durch Glucose auch in höheren Konzentrationen nicht beeinflußt. Die im zellfreien Extrakt vorhandene Hexokinase phosphoryliert Glucose, Fructose und Mannose. Durch free space-Versuche wird nachgewiesen, daß Glucose nicht in das Zellinnere transportiert wird. Hydrogenomonas H 16 verhält sich also cryptisch gegenüber Glucose.

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Summary The only carbohydrate utilized by Hydrogenomonas strain H 16 is fructose. The oxidation of fructose is not influenced by glucose even at high concentrations. Cell-free preparations contain hexokinase which phosphorylated glucose, fructose, and mannose. By means of free-space experiments, it has been demonstrated, that glucose does not enter the cell. Strain H 16 behaves therefore as a cryptic with respect to glucose.

     

Phenylalanine and tyrosine metabolism in the facultative methylotroph Nocardia sp. 239

Nocardia sp. 239 is able to use l-tyrosine and both d- and l-phenylalanine as carbon-, energy- and nitrogen sources for growth. The catabolism of these compounds is by way of (4-hydroxy)phenylpyruvate and (4-hydroxy)-phenylacetate as intermediates and the pathways merge at the level of homogentisate. The conversion of the amino acids into (4-hydroxy)phenylpyruvate is catalyzed by an inducible NAD-dependent phenylalanine dehydrogenase and l-tyrosine aminotransferase, respectively. Incubation of the organism in media with l-phenylalanine plus phenyl-pyruvate resulted in diauxic growth, with phenylpyruvate used first. Phenylalanine dehydrogenase activity cold only be detected after depletion of phenylpyruvate, in the ensuing second growth phase on l-phenylalanine. During growth on phenylalanine plus methanol, low levels of phenylalanine dehydrogenase were detected and this resulted in simultaneous utilization of the two substrates. Following diepoxyoctane treatment, mutants of Nocardia sp. 239 affected in phenylalanine and phenylpyruvate degradation were isolated. Double mutants blocked in both phenylalanine dehydrogenase and phenylpyruvate decarboxylase completely failed to catabolize phenylalanine. The absence of these enzymes did not affect growth on tyrosine.Abbreviations RuMP ribulose monophosphate - EMS ethylmethanesulphonate - NTG N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine     

The metabolism of l-malate and other compounds by schizosaccharomyces pombe

Summary The aerobic and anaerobic metabolism of l-malate by Schizosaccharomyces pombe, strain 106, has been investigated. l-malate was converted to ethanol and CO₂ stoichiometrically by intact cells under anaerobic conditions; oxalacetate and pyruvate were dissimilated to ethanol, acetoin, acetic acid and CO₂. Under aerobic conditions the same organism oxidized a number of mono- and dicarboxylic acids at different rates. Citric-, lactic-and tartaric acid were not attacked. l-malate was oxidized quantitatively to CO₂ and H₂O. Possible intermediates in this reaction have been investigated.

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Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit wurde unter anderem die Dissimilation von Äpfelsäure unter aeroben und anaeroben Bedingungen (Stickstoff-Atmosphäre) durch einen Stamm von Schizosaccharomyces pombe untersucht. Es zeigte sich, daß intakte, ruhende Zellen dieser Hefe l-Malat sowohl unter anaeroben wie aeroben Bedingungen vollständig abzubauen vermögen. Während die aerobe Dissimilation gemäß der Bruttogleichung l-Äpfelsäure +3O₂4CO₂+3H₂O verlief, erfolgte der anaerobe Abbau stöchiometrisch zu Äthanol und CO₂. Die anaerobe Dissimilation von Oxalessigsäure und Brenztraubensäure lieferte Äthanol, Acetoin, Essigsäure und CO₂. Unter aeroben Bedingungen war die untersuchte Hefe ferner imstande, eine ganze Reihe weiterer Mono-und Dicarbonsäuren mit unterschiedlicher Intensität zu oxydieren. Citronen-, Milchund Weinsäure wurden nicht angegriffen. Eine Bildung von Milchsäure konnte in keinem Fall nachgewiesen werden.

     

Der Einfluss von Ernährung und Alter des Muttertieres Auf Die Hämocytäre Abwehrreaktion vonNeomyzus Circumflexus (Buck.)

Zusammenfassung Die F?higkeit vonNeomyzus circumflexus (Buck.), Larven vonAphelinus asychis durch Blutzellen abzukapseln, ist nach drei Generationen auf einem synthetischen N?hrmedium ohne Phenylalanin und Tyrosin stark reduziert. Nach Umsetzen auf ein vollst?ndiges N?hrmedium erreichen H?ufigkeit und Intensit?t der Abwehrreaktionen erst in der dritten nachfolgenden Generation wieder ihr ursprünglisches Ausmass. Das Abwehrverm?gen der Jungl?use sinkt mit zunehmendem Alter des Muttertieres zum Zeitpunkt der Geburt. Ihr Gewicht wird gleichzeitig etwas reduziert.

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Summary The aphid,Neomyzus circumflexus (Buck.) is able to encapsulate the newly hatched larvae of its endoparasite.Aphelinus asychis Walker, with blood cells. This haemocytic reaction was strongly reduced when the aphids were reared for three successive generations on an artificial diet lacking phenylalanine and tyrosine. But when these aphids were fed a full diet (original diet containing vitamins, trace elements, sucrose and 22 amino acids) the reaction increased and reached its original intensity in the third generation. With increasing age of the mother at parturition, the ability of the young aphid to encapsulate parasitic larvae decreased and its weight was also reduced slightly.

     

Verwertung von Cytosin und Uracil durch Hydrogenomonas facilis und Hydrogenomonas H 16

Zusammenfassung Hydrogenomonas facilis verwertet Thymin, Cytosin und Uracil als N-Quelle, Hydrogenomonas H 16 dagegen nur Cytosin. Durch Hydrogenomonas facilis wird Cytosin vollständig abgebaut, durch Hydrogenomonas H 16 lediglich desaminiert, wobei das entstehende Uracil in der Nährlösung angehäuft wird.In zellfreien Extrakten aus Hydrogenomonas H 16, die mit Cytosin als einziger N-Quelle gewachsen waren, wurde Cytosindesaminase-Aktivität im gekoppelten enzymatischen Test nachgewiesen, wobei Glutaminsäuredehydrogenase als Hilfsenzym diente. Mit Ammoniumchlorid herangezogene Zellen zeigten während der Indubation in Cytosin-haltigem Medium einen 18fachen Anstieg der spezifischen Cytosindesaminase-Aktivität.

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Utilisation of cytosine and uracil by Hydrogenomonas facilis and Hydrogenomonas H 16

Summary Hydrogenomonas facilis utilizes thymine, cytosine, and uracil as nitrogen sources; Hydrogenomonas H 16, however, only cytosine. Cytosine is completely metabolised by Hydrogenomonas facilis, but is only deaminated by Hydrogenomonas H 16 and the resulting uracil accumulates in the culture medium.Cytosine deaminase activity was demonstrated in cell-free preparations from Hydrogenomonas H 16 which had been grown with cytosine as the sole nitrogen source. Enzyme activity was measured using a coupled enzyme assay in which glutamic acid dehydrogenase served as an accesory enzyme. An 18-fold increase in cytosine deaminase activity was observed in ammonia-grown cells during the incubation in a cytosine containing medium.

     

Über melaninbildende Stämme von Pseudomonas aeruginosa

Zusammenfassung Der Tyrosinstoffwechsel von 12 auf Peptonagar Melanin bildenden und 15 melaninfreien Kontrollstämmen der Species Pseudomonas aeruginosa wird untersucht. Es wird ein tyrosinfreies Ammoniumgluconat-Medium angegeben, auf dem bei gutem Wachstum aller Stämme keine Melaninbildung erfolgt. Ein Zusatz von Tyrosin oder seinen Precursoren gestattet eine deutliche Unterscheidung der Melaninbildner von den melaninfreien Stämmen innerhalb 16 Std. Die Melaninbildung wird durch Tyrosinasehemmer wie KCN, Na₂S, Natriumdiäthyldithiocarbaminat usw. nicht beeinflußt. DOPA und DOPA chrom ließen sich in den Kulturextrakten nicht nachweisen. Es besteht keine Identität zwischen dem braunen Pigment und authentischem DOPA-Melanin. Sämtliche Melaninbildner zeigen eine Akkumulation von Homogentisinsäure mit nachfolgender Entwicklung eines anfangs roten, später braunen Pigmentes, während die melaninfreien Stämme keine Homogentisinsäure in nachweisbaren Mengen anhäufen. Unterbindet man die Melaninproduktion durch Anzüchtung der Keime auf tyrosinfreien Medien, so kommt es namentlich bei Zusatz von l-Tryptophan zu der für Pseudomonas aeruginosa typischen Anreicherung des Geruchsstoffes o-Aminoacetophenon und 4-Methylchinazolin. Die Hemmung des Chinazolinweges bei den Melaninbildnern wird mit der Tryptophanpyrrolase-Hemmung durch Hydrochinon verglichen.Die melaninbildenden Stämme der Species Pseudomonas aeruginosa sind nicht als tyrosinasehaltige Varianten aufzufassen, sondern als Verlustmutanten mit dem genetisch bedingten Defekt der Homogentisicase, ein Analogiefall zur Alkaptonurie.

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Melanin-forming strains of pseudomonas aeruginosa

Summary Studies are performed on tyrosine metabolism of 12 melaninforming and 15 melanin-free strains of Pseudomonas aeruginosa grown on pepton agar. Melanin production does not occur in tyrosineless ammoniumgluconate medium. Addition of tyrosine or its precursors to this basis-medium allowed to distinguish between the melanin-forming and melanin-free strains within 16 hours. Inhibitors of tyrosinase such as KCN, Na₂S, sodium-diethyl-dithiocarbaminate etc. are proved to be without influence on the pigment production. DOPA and DOPA-chrome are not present in the culture extracts. There is no identity between the isolated brown pigment and authentic DOPA-melanin. All melanin-forming strains are found to be remarkable by accumulating homogentisic acid followed by developing a red, later brown pigment, whereas the melanin-free strains do not concentrate homogentisic acid in detectable amounts. Preventing the melanin formation by growth on the tyrosineless basis-medium with addition of l-tryptophan the quinazoline pathway is employed again, which had been found inhibited during simultaneously occuring production of the brown pigment. Probably this effect may be caused by accumulated homogentisic acid similar to the inhibition of tryptophan-pyrrolase by hydroquinone.The melanin-forming strains of the species Pseudomonas aeruginosa are not regarded as variants containing a tyrosinase but as mutants with a genetic defect of homogentisicase in analogy to the alcaptonuria in metabolic diseases of men.

     

Untersuchungen über das Vorkommen proteolytischer Enzyme in verschiedenen Fisch- und Molluskenorganen

Zusammenfassung Es wird über die Hydrolyse synthetischer Peptidsubstrate (Aminosäureester und -amide, Peptidester und acylierte Peptide) durch Organhomogenate von Fischen (Engraulis enchrasicholus, Mullus barbatus, Belone akus, Mugil auratus) und Mollusken (Rapana bezoar, Mytilus galloprovincialis) des Schwarzen Meeres berichtet.Die untersuchten Fischorgane (insbesondere Leber und Niere, ferner Appendices pyloricae, Pankreas und Blasengalle) hydrolysieren sowohl l-Leucinamid (LA) wie die verschiedenen Aminosäure-und Peptidester optimal im schwach alkalischen Milieu. Lediglich die Niere spaltet Acetyl-l-tyrosinäthylester (ATÄE) maximal im sauren Medium.Analoge Resultate werden mit den Mytilusorganen (Nieren, Mitteldarmdrüse, Kristallstiel, Gonaden) erhalten; jedoch wird neben ATÄE auch Glycyl-l-tyrosinäthylester sehr stark durch Niere primär esterolytisch gespalten. Im Kristallstiel sind außer einer geringen LA-Hydrolyse keine in vorliegender Untersuchung geprüften Peptidasen nachweisbar.In den Verdauungsdrüsen von Rapana bezoar konnten außer Exopeptidase-und Aminosäureesterasewirkungen (letztere mit Ausnahme der Speicheldrüsen im schwach sauren Milieu optimal wirksam) nur geringfügige (Leibleinsche Drüse, Speicheldrüse) bzw. keine meßbaren (Mitteldarmdrüse) Endopeptidase- (pepsin-, trypsin-und chymotrypsin-homospezifischen) Aktivitäten nachgewiesen werden.Die Leucinaminopeptidase-und Aminosäureesterase-Aktivitäten der Molluskenorgane sind vergleichsweise zu denen der Säugetierorgane nur schwach durch Effektoren (Metallionen und SH-Enzymsowie Esteraseinhibitoren) beeinflußbar.     

Vorkommen und Eigenschaften der proteolytischen Enzyme des Magensaftes und der Mitteldarmdrüse des Flußkrebses Astacus astacus (L.) und Cambarus affinis (Say)

Zusammenfassung Es werden die Exopeptidase- und Dipeptidaseaktivitäten des Hepatopankreas und Magensaftes von Astacus astacus (L.) und Cambarus affinis (Say) quantitativ bestimmt (Durchschnittswerte von ca. 90 Tieren). Die besonders im Magensaft vorkommende Carboxypeptidase hydrolysiert Carbobenzoxyglycyl-l- phenylalanin und Carbobenzoxy-l-glutamyl-l-tyrosin ungefähr gleichstark (pH-Optimum 7,6 bzw. 7,0). Im Vergleich zur kristallisierten Pankreascarboxypeptidase wird das Magensaftenzym stärker durch Hydrozimtsäure als durch o-Phenanthrolin gehemmt. SH-Gruppen sind für die Wirkung nicht nötig. Die Leucinamid- und Leucin--naphthylamid-Hydrolyse ist nicht auf die klassische Leucinaminopeptidase, sondern auf eine metallionenunabhängige und puromycinempfindliche Arylamidase-ähnliche Wirkung (pH-Optimum 7,7–8,0) zurückzuführen. Amidase- und Dipeptidase (Substrat: Glycyl-l-lencin)-Wirkung sind besonders im Hepatopankreas aktiv.

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Occurrence and properties of proteolytic enzymes in the gastric juice and hepatopancreas of the crayfishes Astacus astacus (L.) and cambarus affinis (Say)I. Exopeptidases

Summary The exopeptidase and dipeptidase activities of the hepatopanereas and gastric juice of Astacus astacus (L.) and Cambarus affinis (Say) were determined (mean values from approximately 90 exemplares). The carboxypeptidase which was highly active in the gastric juice hydrolyzes carbobenzoxyglycyl-l-phenylalanine and carbobenzoxy-l-glutamyl-l-tyrosine at about the same rate (pH-optimum at 7,6 and 7,0 respectively). Compared with the crystalline pancreas carboxypeptidase the gastric juice enzyme was stronger inhibited by hydrocinnamic acid than by o-phenanthroline. Sulfhydryl groups are not essential for the enzyme action. The observed hydrolysis of leucine amide and leucine--naphthyl amide could not be attributed to the classic leucine aminopeptidase but to an arylamidase like action (pH Optimum 7,7 to 8,0) which was independent of metal ions and puromycin-sensitive. The amidase and dipeptidase (substrate: glycyl-l-leucine) are mainly localized in hepatopanereas.

     

Stoffwechselprodukte von Mikroorganismen

Zusammenfassung Aus Kulturen zweier Streptomycetenstämme wurde das l-2,5-Dihydrophenylalanin (I) isoliert. Die antibiotische Wirkung dieser Verbindung kann durch Phenylalanin und Tyrosin aufgehoben werden.

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Metabolic products of microorganisms87. l-2,5-dihydrophenylalanine

Summary l-2,5-Dihydrophenylalanine has been isolated from cultures of two strains of Streptomyces. The antibiotic activity of this compound is antagonized by Phenylalanine and Tyrosine.

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86. Mitteilung: W. Keller-Schierlein und W. Richle: Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1970 (im Druck).

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Jetzt: Gesellschaft für Molekularbiologische Forschung mbH., Stöckheim bei Braunschweig.     

Harnsäureabbau und Biosynthese der Enzyme Uricase,Glyoxylatcarboligase und Urease bei Hydrogenomonas H 16

Zusammenfassung Glyoxylatcarboligase und d-Glycerat-3-Dehydrogenase werden in Hydrogenomonas H 16 unter dem induktiven Einfluß von Harnsäure, Allantoin und Glyoxylsäure gebildet.In zellfreien Extrakten wurden spezifische Enzymaktivitäten bis zu 500 E/g bzw. 4000 E/g gemessen. Beide Enzyme erwiesen sich in Extrakten als nicht an subcelluläre Partikeln gebunden.Glyoxylatcarboligase benötgt Thiaminpyrophosphat und MgCl₂; NADH₂ und NADPH₂ sind als Coenzyme der d-Glycerat-3-Dehydrogenase wirksam.Die Bildung der Glyoxylatcarboligase wurde durch Fructose reprimiert, wenn Glyoxylat das induzierende Substrat war. Mit Harnsäure als Induktor unterlag die Enzymbildung jedoch keiner Repression durch Fructose.

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Uric acid degradation and biosynthesis of the enzymes uricase, glyoxylate carboligase and urease in Hydrogenomonas H 16 I. Formation of glyoxylate carboligase and d-glycerate-3-dehydrogenase

Summary Inductive formation of glyoxylate carboligase and d-glycerate-3-dehydrogenase was observed in cells of Hydrogenomonas H 16 in presence of uric acid, allantoin and glyoxylic acid.Specific enzyme activities up to 500 U/g and 4000 U/g respectively were determined in cell-free preparations. Both enzymes are not bound to subcellular particles in ultrasonic preparations. Thiamine pyrophosphate and MgCl₂ are necessary cofactors for glyoxylate carboligase; NADH and NADPH are active coenzymes of d-glycerate-3-dehydrogenase.The formation of glyoxylate carboligase was repressed by fructose, provided glyoxylate was the inducing substrate. Enzyme synthesis induced by uric acid was not subject to fructose repression.

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Auszug aus der gleichlautenden Habilitationsschrift zur Erlangung der venia legendi der Landwirtschaftlichen Fakultät der Georg-August-Universität Göttingen.     

Tiefenabhängige Änderungen von RBW,LET und Energiespektrum bei hochenergetischer Elektronenstrahlung

Zusammenfassung Im ersten Teil der Arbeit wird als Ursache für die Zunahme der RBW schneller Elektronen mit ihrer Eindringtiefe die Änderung ihres Energiespektrums vorausgesetzt. Über die Ermittlung der Quelldichte der Sekundärelektronen wird, unter Einbeziehung der Primärelektronen, die energieabhängige Elektronenflußdichte für zwei verschiedene Primärelektronen-Energien berechnet. Im Verein mit den auf anderem Wege erhaltenen ähnlichen Resultaten vonHarder wird ein wahrscheinlicher Verlauf der energieabhängigen Elektronenflußdichte für zwei verschiedene Tiefen ermittelt.Im zweiten Teil wird zur Berechnung der RBW die strahlenbiologische Wirkung proportional zum Produkt aus der Elektronenflußdichte und einer der physikalischen Wechselwirkung mit dem biologischen Modell entsprechenden spektralen Empfindlichkeitsfunktion angesetzt. Die Anwendung der im ersten Teil ermittelten Spektralfunktion auf dieses Prinzip liefert für den Fall der Übertragung von Ionisations- und Anregungsenergie auf den Zellkern durch-Elektronen nur für Energien zwischen 5 und 10 keV die richtige Tiefenabhängigkeit der RBW. Dasselbe gilt für die Übertragung von Ionisationsenergie auf den Zellkern durch K-Schalen-Ionisation biologisch wichtiger Elemente mit anschließendem Auger-Effekt (SchrapnellWirkung). Dagegen erhält man bei Annahme der Energieübertragung durch Plasmonanregung oder Einzelionisationen keine den Experimenten entsprechende Zunahme der RBW mit der Tiefe.Herrn Prof. Dr. med. H.-St.Stender, Herrn Priv.-Doz. Dr. B.Markus und Herrn Priv.-Doz. Dr. D.Harder danke ich für wertvolle kritische Anmerkungen und anregende Diskussionen zum vorliegenden zweiten Teil der Arbeit.     

Denitrifikation bei Hydrogenomonas eutropha Stamm H16

Zusammenfassung Hydrogenomonas eutropha (syn. Alcaligenes eutrophus) Stamm H 16 wächst anaerob mit Fructose und Nitrat bzw. Nitrit. Autotrophanaerobes Wachstum unter einer H₂-CO₂-Atmosphäre (90+10 Vol.-%) mit Nitrat als einzigem Wasserstoff-Acceptor ist minimal.Während des anaeroben Wachstums mit Nitrat sind zwei Phasen zu unterscheiden. In der ersten Phase erfolgt die Zellvermehrung auf Kosten der Reduktion von Nitrat zu Nitrit; dieses wird angehäuft. In der zweiten Phase wird Nitrit unter Bildung von Stickstoff reduziert.Gewaschene, anaerob gewachsene Zellen reduzieren Nitrat und Nitrit unter Bildung von N₂. Stöchiometrische Experimente mit H₂ oder Fructose als H-Donatoren lassen darauf schließen, daß Stickstoff das einzige Produkt der Denitrifikation durch die Zellen ist. Diese Schlußfolgerung wurde durch eine massenspektrometrische Analyse des gebildeten Gases bestätigt. Aerob gewachsene Zellen reduzieren Nitrat nur zu Nitrit. In Gegenwart von Ammonium-Salz gewachsene Zellen reduzieren Nitrat mit sehr geringer Rate.Die Ergebnisse deuten darauf hin, daß Stamm H 16 über nur eine Nitratreductase verfügt. Die Bildung des Enzyms ist durch Ammonium reprimierbar; O₂ ist ohne Einfluß. Die Nitritreductase fand sich sowohl in der löslichen Fraktion als auch in den gereinigten Partikeln lokalisiert. Das Nitritreductase-System wird nur unter anaeroben Bedingungen gebildet.

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Denitrification in Hydrogenomonas eutropha strain H16

Summary The hydrogen bacterium Hydrogenomonas eutropha (syn. Alcaligenes eutrophus) strain H 16 is able to grow anaerobically with fructose and nitrate or nitrite, respectively. Autotrophic anaerobic growth under a gas atmosphere of hydrogen and carbon dioxide (90+10 vol-%) with nitrate as the sole hydrogen acceptor is minimal.During anaerobic growth with nitrate as H-acceptor, two growth phases are distinguishable: During the first phase cell growth occurs with the reduction of nitrate to nitrite, which is accumulated; on the second phase nitrite is reduced with the formation of gaseous nitrogen.Washed, anaerobically grown cells reduce nitrate and nitrite with the formation of N₂. Stoichiometric experiments employing hydrogen or fructose as the hydrogen donors are consistent with the conclusion that nitrogen is the sole product of denitrification by these cells. This was confirmed by mass spectrometric analysis of the gas formed. Aerobically grown cells are able to reduce nitrate only to nitrite; when grown in the presence of ammonia, the reduction rate is very low.The results indicate that strain H 16 contains only one nitrate reductase. The formation of this enzyme system is not influenced by oxygen, however, is repressed by ammonia.When employing a purified soluble fraction and particles, nitrite reductases were found in both fractions. The nitrite reductase system is formed only under anaerobic conditions.

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Abkürzungen MB Methylenblau - PMS Phenazinmethosulfat     

Zur Frage der Beeinflussung der Glucosevergärung durch l-Malat bei Leuconostoc mesenteroides

Zusammenfassung Es wird gezeigt, daß bei Leuconostoc mesenteroides 39 (ATCC 12291) der gleichzeitige Abbau von l-Malat die Glucosevergärung weder qualitativ noch quantitativ verändert. Bei Verwendung positionsmarkierter Glucose wird auch die Isotopenverteilung in den Gärungsprodukten durch gleichzeitige Malatgabe nicht verändert. Der Malatabbau steuert auch keine Energie zum Wachstum bei, wie die bei l-Malatgabe unveränderten Y_Glucose-Werte zeigen. Die von Doelle (1971) beschriebene verstärkte Milchsäurebildung aus Glucose bei Anwesenheit von Malat konnte auf einen pH-Effekt zurückgeführt werden. Für eine ebenfalls von Doelle (1971) berichtete Bildung von l-Lactat aus Glucose unter dem Einfluß von l-Malat ergab sich kein Anhaltspunkt.

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The effect of l-malate on glucose fermentation by Leuconostoc mesenteroides

Summary It is shown that the simultaneous fermentation of l-malate and d-glucose by Leuconostoc mesenteroides 39 does not lead to quantitatively or qualitatively different fermentation products. When glucose, labelled in different positions is fermented, the distribution of ¹⁴C within the fermentation products is not changed by the addition of l-malate to the fermentation mixture. The l-malate fermentation does not contribute energy for growth, since Y_glucose remains unchanged by adding l-malate to the medium. The increased production of lactic acid from glucose in the presence of l-malate, reported by Doelle (1971), is due to a pH effect. There is no indication of the formation of l(+)-lactate in addition to d(-)-lactate from glucose, when l-malate is present as claimed by Doelle (1971).

     

Induktive Bildung partikelgebundener Uricase bei Hydrogenomonas H16 und anderen aeroben Bakterien

Zusammenfassung Induktive Bildung von Uricase (E.C. 1.7.3.3. Urat: O₂-Oxidoreductase) wurde während des Wachstums mit Harnsäure als alleiniger Kohlenstoff-und Stickstoffquelle bei Hydrogenomonas H 16, Micrococcus denitrificans und Pseudomonas aeruginosa beobachtet.Das Enzym wurde in der Partikelfraktion nachgewiesen, die aus Ultraschallextrakten bei 100 000 g sedimentiert.Gewaschene Partikeln aus Hydrogenomonas H 16 verbrauchten 0,45 Mole O₂ je Mol Harnsäure, gemessen in Boratpuffer beim Optimum von pH 9,0. Die Reaktion ist empfindlich gegenüber Cyanid; 4 · 10^-6 m KCN führt zu einer 50%igen Hemmung.

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Inductive biosynthesis of particle-bound uricase in Hydrogenomonas H 16 and other aerobic bacteria

Summary Induced biosynthesis of uricase (E.C. 1.7.3.3 Urate: O₂ oxidoreductase) was observed during growth with uric acid as the only carbon and nitrogen source in strains of Hydrogenomonas H 16, Micrococcus denitrificans and Pseudomonas aeruginosa.The enzyme was located in particles, sedimenting from ultrasonic preparations at 100000 g.An average of 0.45 moles of oxygen were utilized during the oxidation of one mole of uric acid by washed particles from Hydrogenomonas H 16 in borate buffer at the pH optimum of 9.0. The reaction is sensitive to cyanide; 4 · 10^-6 m KCN caused a 50% inhibition.

     

Chemolithotrophes Wachstum von Hydrogenomonas H16 im Chemostaten mit elektrolytischer Knallgaserzeugung

Zusammenfassung Ein Chemostat zur Kultur von Knallgasbakterien mit begrenzenden Konzentrationen von Wasserstoff und Sauerstoff wird beschrieben. Die Gase werden durch Elektrolyse des Mineralmediums erzeugt. Durch Verwendung von zwei Anoden, von denen die eine außerhalb des Kulturgefäßes angeordnet ist, läßt sich das Verhältnis H₂/O₂ innerhalb weiter Grenzen verändern. Zur Steuerung und Veränderung der Flußrate zwischen 20 und 720 ml/Std dient ein Tropfenzähler mit Platinkontakten, ein Magnetventil und ein Impulsgeber.Wurde Hydrogenomonas H 16 in statischer Kultur mit H₂ oder O₂-Begrenzung herangezogen, so nahmen die Rate der Gasaufnahme und die Hydrogenase-Aktivität mit zunehmendem Alter der Kultur ab. In kontinuierlicher Kultur mit Wasserstoff als wachstumsbegrenzendem Faktor wurden die Beziehungen zwischen Wachstumsrate, Bakterienkonzentration und Wasserstoffverbrauch untersucht. Bei gleichen Wachstumsraten unter Begrenzung des Wachstums a) durch Wasserstoff und b) durch Sauerstoff wurden einige Stoffwechsel-Aktivitäten miteinander verglichen. Wurde das Wachstum durch Wasserstoff begrenzt, so war der Gehalt an Poly--hydroxybuttersäure gering und die Aktivitäten von Hydrogenase und Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase waren hoch. Bei Begrenzung des Wachstums durch Sauerstoff häuften die Zellen Poly--hydroxybuttersäure bis zu 23% des Trockengewichts an; die Aktivitäten der Hydrogenase und Glycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase waren gering. Das H₂/CO₂-Verhältnis betrug bei Begrenzung durch Wasserstoff 9,1, bei Begrenzung durch Sauerstoff 4,6. Die spezifischen Aktivitäten anderer Enzyme (Phosphoglycerokinase und NADP-spezifische Glutamat-Dehydrogenase) unterschieden sich nicht nennenswert.

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Chemolithotrophic growth of hydrogenomonas H16 using electrolytic production of hydrogen and oxygen in a chemostat

Summary A chemostat for growing Knallgasbacteria with limiting concentrations of hydrogen or oxygen is described. Both gaseous components were produced by electrolysis of the mineral medium. By using two anodes, one of which was located outside the culture vessel, the proportion of hydrogen and oxygen could be varied within wide limits. An electronic control unit consisting of a magnetic valve, a drop counter with platinum contacts and a timer was used to control and vary the flowrate from 20 to 720 ml/hour.When Hydrogenomonas H 16 was grown with limiting hydrogen or oxygen concentrations in static culture, the rate of gas uptake and hydrogenase activity of the cells declined concomitantly. In continuous culture with hydrogen as the growth limiting factor, the relationships between growth, cell density and hydrogen consumption were investigated. At equal growth rates some metabolic activities were compared. With hydrogen as the limiting factor, the amount of poly--hydroxy-butyric acid was negligable, however, the specific activities of hydrogenase and glyceraldehyde phosphate dehydrogenase were high. With oxygen as the limiting factor the cells accumulated poly--hydroxybutyric acid up to 23% of the dry weight; the activities of hydrogenase and glyceraldehyde phosphate dehydrogenase were low. The H₂/CO₂-ratio was 9.1 with hydrogen limitation and 4.6 with oxygen limitation. The specific activities of other enzymes (phosphoglycerokinase, NADP-specific glutamate-dehydrogenase) did not significantly differ under either condition.

     

Die Aminosäuresequenz des Threonin und Serin enthaltenden Mureins von Bifidobacterium longum Reuter

Zusammenfassung Von 18 Stämmen von Bifidobacterium longum Reuter und einem Stamm von B. lactentis Reuter wurden die Zellwände in üblicher Weise hergestellt. Sie enthielten Mur, GlcNH₂, d-Glu, Ala, l-Orn (l-Lys), Thr, Ser in einem Molverhältnis von rund 1:1:1:4:1:1:1. Die Molverhältnisse änderten sich nicht, wenn die Zellwände mit Trichloressigsäure oder heißem Formamid extrahiert wurden. In einigen Stämmen trat mehr als 1 Mol Glutaminsäure pro Mol Diaminosäure auf. Die zusätzliche Glutaminsäure hatte die l-Konfiguration. Sie war kein Bestandteil des Mureins, sondern einer lysozymunempfindlichen, unbekannten Zellwandkomponente, vermutlich einer Polyglutaminsäure. l-Ornithin war in den meisten Stämmen die dominierende Diaminosäure, während l-Lysin nur mit einem Anteil von 10–20% vertreten war. In 2 Stämmen war l-Lysin dominierend (90%). Die Aminosäuresequenz wurde durch die Analyse der Oligopeptide aus Partialhydrolysaten bestimmt. Die an Mureinsäure gebundenen Peptiduntereinheiten hatten die auch von anderen Mureinen bekannte Sequenz: l-Ala-d-Glu-l-Orn (oder l-Lys)-d-Ala. Glutaminsäure ist wahrscheinlich amidiert, wie aus dem Auftreten von rund 1 Mol NH₃ im Hydrolysat der Zellwände zu schließen ist. Die Interpeptidbrücke besteht aus dem Peptid l-Ala-Thr-l-Ala-l-Ser. Sie ist mit dem C-terminalen Serin an die -Aminogruppe der Diaminosäure der Peptiduntereinheit gebunden. Die Quervernetzung erfolgt zwischen dem N-terminalen Alanin der Interpeptidbrücke zum C-terminalen d-Alanin einer Peptiduntereinheit. Da 4% des gesamten Alanins und 3% der -Aminogruppe des Ornithins dinitrophenylierbar sind, ist anzunehmen, daß die Quervernetzung nur zu etwa 80% verwirklicht ist.

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The amino acid sequence of the threonine and serine containing murein of Bifidobacterium longum reuter

Summary Cell walls of 18 strains of Bifidobacterium longum Reuter and one strain of B. lactentis Reuter were prepared in the usual way. They contained Mur, GlcNH₂, d-Glu, Ala, l-Orn (l-Lys), Thr, Ser in a molar ratio of about 1:1:1:4:1:1:1. The ratio was not changed when the cell walls were extracted by trichloroacetic acid or hot formamide. In some strains more than 1 mole glutamic acid per mole of diamino acid was present. The additional glutamic acid was of the l-rather than the d-form. It was not a constituent of the murein, but of an unknown lysozyme insensitive cell wall component, probably a polyglutamic acid. l-Ornithine was the dominating diamino acid in most strains but l-lysine was also present in a portion of 10 to 20%. In 2 strains l-lysine was dominating (90%).The amino acid sequence was determined by analysing the oligopeptides arising during partial acid hydrolysis. It was shown that the peptide subunits attached to the muramic acid are the same as those of other mureins: l-Ala-d-Glu-l-Orn (or l-Lys)-d-Ala. glutamic acid is probably amidated, since about 1 mole of NH₃ is released by acid hydrolysis of the cell walls. The interpeptide bridge consists of the peptide l-Ala-Thr-l-Ala-l-Ser which is bound by its C-terminal serine to the -amino group of the diamino acid of one peptide subunit and by its N-terminal l-alanine to the C-terminal d-alanine of another peptide subunit. About 4% of the total alanine and 3% of the -amino groups of ornithine of the cell wall can be dinitrophenylated. This indicates that about 20% of the peptide subunits are not crosslinked.

     

CO2-Fixierung durch Knallgasbakterien

Zusammenfassung Die Gewinnung, Aufbereitung und papierchromatographische Analyse ¹⁴C-markierter Extrakte aus PHBS-speichernden Zellen von Hydrogenomonas H 16 wird beschrieben und diskutiert. Einige chromatographische Trennsysteme wurden verglichen, insbesondere mit dem von Metzner (1960) vorgeschlagenen System. R_f-Werte wichtiger Intermediärverbindungen und Positionskonstanten von Phosphatestern wurden ermittelt.Für die papierchromatographische Trennung von Zuckern, Aminosäuren und Hydroxamsäuren sowie für organische Säuren und Phosphatester wurden zweckmäßige Systeme angegeben, Sprühmittel verglichen und Farbreaktionen beschrieben.Chromatogramme von Extrakten aus Hydrogenomonas H 16 und Chlorella pyrenoidosa, die ¹⁴CO₂ im Kurzzeitversuch unter vergleichbaren Bedingungen eingebaut hatten, zeigten voneinander verschiedene Markierungsmuster. Unter den Phosphatestern sind bei Hydrogenomonas (nur 63% des fixierten ¹⁴C) vorwiegend Hexosemonophosphate, Sedoheptulose-7-phosphat, Phosphoglycerinsäure und AMP markiert, bei Chlorella (95% des fixierten ¹⁴C) hauptsächlich Phosphoglycerinsäure, Triosephosphat und Phosphoenolbrenztraubensäure. Bei Hydrogenomonas waren einige organische Säuren und Aminosäuren (Äpfelsäure, Citronensäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Glutaminsäure, Alanin u.a.) relativ stark markiert, die bei Chlorella kaum oder nicht radioaktiv waren.

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CO₂-fixation by Knallgas bacteriaII. Chromatographical identification of early labeled fixation products

Summary The production, preparation, and analysis by paperchromatography of ¹⁴C-labeled extracts from cells of Hydrogenomonas H 16 storing poly--hydroxybutyric acid (PHBS) is described and discussed. Some chromatographical solvent systems were compared, especially with one proposed by Metzner (1960). R_f-values of important intermediates and phosphate ester position constants were determined.Separation by paperchromatography of sugars, amino acids, and hydroxamic acids was tested in various systems. Sprays for these compounds, as well as for organic acids and phosphate esters, were compared and their colour reactions described.Chromatograms of extracts from Hydrogenomonas H 16 and Chlorella pyrenoidosa after incorporation of ¹⁴CO₂ in short time experiments under comparable conditions showed labelling patterns different from each other. In the case of Hydrogenomonas, 63% of the activity fixed was found in the phosphate esters, mainly in hexose monophosphates (incl. sedoheptulose-7-phosphate), phosphoglyceric acid, and AMP. The phosphate esters of Chlorella contained 95% of the activity fixed, the bulk of which appeared in phosphoglyceric acid, triose phosphate and phosphoenolpyruvic acid. Much less was found in the hexose monophosphates.Some organic and amino acids such as malic, citric, succinic, fumaric glutamic acid and alanine of the Hydrogenomonas extracts were rather heavily labelled, while this was not the case with Chlorella.