木糖异构酶基因xylA的克隆及其表达载体的构建

木糖异构酶基因xylA是一种正向选择标记基因,在植物基因工程中使用该标记可以获得安全的转基因植物.构建了以xylA基因为选择标记的植物表达载体.从大肠杆菌Top10中扩增出xylA基因,插入到质粒pCAMBIA2301的Xho Ⅰ位点,通过酶切和PCR检测插入片段的正确性,得到载体pCAMBIA2301-xylA,将pBI121载体上的‘35S-GUS-Nos'表达框插入到pCAMBIA2301-xylA的EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ位点.得到中间载体pCAMBIA2301-xylA-GUS,用Sac Ⅰ和Sma Ⅰ切下克隆载体上的CBF1基因替代pCAMBIA2301-xylA-GUS中的GUS片段,用电转化法将获得的表达载体转化到农杆菌中,为将来获得安全的转基因抗寒植株奠定基础.     

含幽门螺杆菌CagA、UreB蛋白与霍乱肠毒素B亚单位（CTB）融合基因的植物表达载体的构建及遗传转化

幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染是慢性胃炎和消化性溃疡的主要病因,与胃癌和胃粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤的发生也密切相关。目前所用的疫苗制造成本高、运输费用贵,然而利用转基因植物生产的植物疫苗成本低廉、服用方便是现有疫苗的良好替代品。将Hp相关蛋白与免疫佐剂CTB的融合基因(ctb-linker-cagA和ctb-linker-ureB)利用PCR、酶切、连接等一系列方法从载体p1300-WxCLCN和p1300-WxCLUN中重组到载体pCAMBIA2301中(含35S启动子),重组载体分别命名为p2301-35SCLCN和p2301-35SCLUN。通过冻融法将载体导入农杆菌EHA105菌株中,以农杆菌介导的方法,将重组载体p2301-35SCLCN和p2301-35SCLUN转化烟草黄苗榆和心叶烟,获得了具有卡那霉素抗性再生植株,经过酶切、PCR、GUS染色和PCR-Southern鉴定结果表明,目的基因分别正确插入载体中并稳定整合到植株中,为利用植物反应器生产幽门螺杆菌疫苗奠定了坚实的基础。     

金花茶FLS基因的克隆及其植物表达载体的构建

利用RT-PCR和RACE技术,从我国珍稀濒危植物金花茶花瓣中获得了黄酮醇合成酶（Flavonol synthase,FLS）基因的cDNA全长,命名为CnFLS,GenBank登录号JF343560.1。根据该基因序列设计全长扩增引物P3/P4进行PCR扩增,将扩增产物插入PMD18-T载体并转化克隆菌株DH5α,提取质粒DNA酶切鉴定,通过酶切连接的方法将该基因与改造后的pCAMBIA1300表达载体连接,成功构建了该基因的正义表达载体pCAM-CnFLS。根据该基因的保守序列设计了含有酶切位点的特异引物G1/G2,扩增出250 bp的干扰片段并将其克隆到PMD18-T载体,在中间载体pUCCRNAi及表达载体pCAMBIA1300的基础上,通过多次酶切连接,成功构建了金花茶FLS基因的干扰表达载体pCAMRNAi-CnFLS。金花茶正义及干扰植物表达载体的成功构建,为进一步研究该基因的功能及其对花色的调控效应奠定了基础。     

Epsps基因为筛选标记的多基因抗虫表达载体构建

目的:为了获得水稻的广谱抗虫性,同时也避免由潮霉素抗性基因引起的安全性问题.构建以抗除草剂基因(Epsps 基因)为筛选标记的多基因抗虫植物表达载体 pCTSK.方法:以双元载体pCAMBIA1300为基础,将潮霉素抗性基因hpt替换成携带烟草叶绿体转运肽序列TSP的草甘膦抗性突变基因aroAM12(编码细菌5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶Epsps)作为筛选标记基因,获得中间表达载体pCISM1300.然后再连接上3个抗虫基因(马铃薯蛋白酶抑制剂基因Pin-Ⅱ、苏云金杆菌毒蛋白基因Bt cryI(A)及雪花莲外源凝集素基因 CNA)的完整表达片段(包含各自的启动子和终止子).结果:通过PCR方法和酶切方法鉴定已成功地构建了该表达载体;通过不同实验方案的数据分析,得出在载体构建的大分子连接中优化的一次连接法连接效率高于二次连接法的结论.     

含甘露糖异构酶基因植物表达载体的构建

目的:构建了以manA基因为选择标记的植物表达载体。方法:从大肠杆菌DH5α中克隆出manA基因,连接到质粒pCAMBIA1301的XhoⅠ位点,替换hpt基因,通过酶切和PCR检测了插入片段的正确性,使用XbaⅠ和HindⅢ酶切Gateway载体(pGWCBF)获得含有P35S-T35S-attR1-attR2-CmR-ccdB的结构域,将其插入到表达载体pCAMBIA1301的相应位点中,获得中间表达载体pCAMBIA1301-manA-GW,使用Gateway载体的BP反应与LR反应,将转录因子CBF基因片段整合到载体中。结果:酶切结果表明以甘露糖异构酶基因(manA)为选择标记的植物表达载体pCAMBIA1301-manA-CBF已经构建完成。结论:将构建好的载体用液氮冻融法转化到农杆菌中,可以用于葡萄的遗传转化研究,为将来获得安全的转基因抗寒植株奠定基础。     

甘蔗黄叶病毒CP蛋白基因ihpRNA表达载体构建及烟草转化

为提高甘蔗抗病性,本研究根据甘蔗黄叶病毒海南分离物ScYLV-CHN-HN1全基因组序列(GenBank no. HQ342888),利用病毒CP蛋白介导的RNAi技术,针对病毒外壳蛋白CP,设计两对含有酶切位点的特异性引物,CPsf1/CPsr1和CPasf1/CPasr1,以构建好的pMD19-T/CP质粒为模板,pRNAi1017为中间载体,分别合成构建干扰载体的正反向片段pRNAi-CP-F-R,将CP正反向片段分别插入表达载体pCAMBIA2300的相应位置,构建含有发卡结构的RNAi载体p2300-CP-F-R,经过PstⅠ酶切鉴定,证明载体构建成功。通过农杆菌介导的方法,以干扰表达载体p2300-CP-F-R转化烟草,经过PCR检测,得到12株阳性转基因植株,Southern blot杂交和半定量RT-PCR对其检测,证明干扰片段已经整合烟草基因组中并进行了转录,该结果为RNAi介导抗病毒甘蔗育种研究奠定基础。     

几丁质酶、葡聚糖酶与萝卜抗真菌蛋白RS-AFP2基因三价表达载体的构建及农杆菌工程菌株的重组

利用基因工程技术构建了含有几丁质酶(Chitinase,Chi．)、β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-Glucanase,Glu．)、萝卜抗真菌蛋白(Raphanus sativus-antifingal protein,Rs-AFP2)的三价植物表达载体,并通过农杆菌直接转化法将三价植物表达载体转入农杆菌EHA105,分别为GC R／pCAMBIA1300／EHA105和RC G／pCAMBIAl300／EHA105,并采用PCR、DNA dot blotting技术对其进行了鉴定分析,证明获得了阳性的重组农杆菌工程菌株。     

玉米核基质结合区在烟草中对外源转基因表达水平的影响

为研究核基质结合区(matrix attachment region, MAR)在转基因植物中的功能,将来自玉米基因组的MAR序列构建在植物表达载体T-DNA中, 并将报告基因β-葡糖醛酸酶(β-glucuronidase, GUS)基因(uidA)插入两段MARs序列之间.将此载体与不包含MARs序列的植物表达载体分别转化烟草(Nicotiana tabacum L.).GUS活性检测表明,MARs可以显著提高外源基因uidA在转基因烟草中的表达水平,平均表达水平提高2倍,最高单株活性可达10倍.并且转基因植株GUS活性高低与稳定mRNA的量成正比,表明MARs在转录水平提高基因表达.     

人乳头瘤病毒31和33亚型L1基因导入水稻及转基因植株的鉴定

目的:结合水稻胚乳生物反应器的优点,将人乳头瘤病毒(HPV)31、33亚型的L1蛋白编码基因导入水稻,构建HPV31 L1、HPV33 L1植物表达载体,最终实现其在水稻胚乳表达系统中的表达。方法:利用生物信息学方法分析并优化合成HPV31及HPV33 L1蛋白编码基因,将其重组于中间载体pMP3和植物表达载体pCAMBIA1300中,分别构建植物双元表达载体pCAMBIA1300-pMP3-HPV-31 L1和pCAMBIA1300-pMP3-HPV-33 L1,采用遗传转化法经根癌农杆菌介导转化水稻TP309种子的愈伤组织,经共培养、潮霉素筛选和分化再生,获得潮霉素抗性植株。结果和结论:构建了HPV31 L1、HPV33 L1的植物表达载体,经根癌农杆菌介导转化水稻TP309种子的愈伤组织,获得转基因植株。     

p21 RNAi的pSUPER载体的构建及功能鉴定

目的:构建抑制p21基因表达的pSUPER RNAi载体(pSUPER-p21)并鉴定其功能.方法:化学合成一对编码短发夹RNA序列的、靶向大鼠p21基因的寡核苷酸链,各60个碱基,退火,克隆到经Bg1 Ⅱ、HindⅢ双酶切的pSUPER质粒上,构建重组RNAi质粒(pSUPER-p21).通过双酶切鉴定及测序分析验证构建效果.将正确构建的质粒转染大鼠原代培养皮质神经元,western blotting检测经红藻氨酸处理的神经元中p21蛋白表达.结果:pSUPER-p21载体经双酶切鉴定及测序分析,结果表明60个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致.Western blotting结果证实pSUPER-p21载体可特异性抑制红藻氨酸诱导的原代培养皮质神经元中p21蛋白表达的上调.结论:靶向p21的pSUPER RNAi载体构建成功,该载体可特异性抑制p21基因表达.     

农杆菌介导的水稻双载体共转化法中部分影响因素的研究

以T-DNA区分别只含有潮霉素选择标记基因(HPT)和GUS报告基因的双元载体pCAMBIA1300和pCAMBIA0301用于农杆菌介导的水稻共转化试验。根据经农杆菌浸染并共培养3d后水稻愈伤组织中的GUS瞬间表达情况及其稳定共转化率,测定了不同农杆菌菌株搭配及其不同浓度配比对共转化效率的影响。结果表明,在两种农杆菌菌液浓度比为1:1的情况下,农杆菌EHA105/pCAMBIA1300与EHA105/pCAMBIA0301组合共转化水稻的效率要高于其他菌株的组合;在以农杆菌EHA105/pCAMBIA1300与EHA105/pCAMBIA0301进行共转化时,两种菌液浓度比为1:2时共转化效率最高。     

CBF4基因植物表达双元载体的构建

目的:对拟南芥CBF4基因序列进行克隆.方法:用限制性内切酶将CBF4基因从pMD18-T CBF4载体上切下,定向连接到含超强启动子的pC2301-35S-OCS表达载体上,成功构建了CBF4基因植物表达载体pC2301-35S-OCS-CBF4.利用冻融法将此表达载体导入只含辅助质粒的根癌农杆菌中,提取转化质粒,经PCR扩增和酶切验证鉴定表明.结果:CBF4基因植物表达双元载体构建成功.结论:转CBF4基因烟草的抗寒性比野生型烟草要高.     

银杏CONSTANS基因植物表达载体构建

目的:构建银杏CONSTANS基因的表达载体.方法:PCR扩增CO基因得到1.2kb左右的片段,用BamH Ⅰ+HindⅢ酶切纯化,通过T4 DNA连接酶连接到植物表达载体pCAMBIA 1304上,并转化到农杆菌LBA4404,然后进行菌落PCR及酶切鉴定.结果:载体构建成功.结论:构建了GbCO正义链和反义链的植物表达载体pCAMBIA 1304-GbCOs和pCAMBIA 1304-GbCOa,可用于GbCO基因的转基因功能研究.     

p300基因小干扰RNA慢病毒载体的构建及其对乳腺癌ZR75-1细胞的影响

目的:构建p300基因的小干扰RNA(siRNA)慢病毒表达载体,检测其对p300蛋白表达的干扰,以及对乳腺癌细胞ZR75-1生长的影响。方法:利用RNA干扰(RNAi)技术设计并合成针对p300基因的siRNA,并将其克隆到siRNA表达载体pSIH-H1上,经酶切和测序验证,用293T人胚肾细胞包装p300 siRNA慢病毒,感染乳腺癌细胞ZR75-1,建立敲低p300表达的稳定细胞株,通过实时定量PCR和Western印迹检验RNAi的干扰效果,利用细胞生长实验检测p300 siRNA对ZR75-1细胞生长的影响。结果:酶切和测序证明构建了p300 siRNA真核表达载体;实时定量PCR和Western印迹证明构建的siRNA能有效抑制p300基因的表达,并建立了敲低p300表达的稳定细胞株;细胞生长实验证实p300 siRNA可有效促进ZR75-1细胞的生长。结论:构建了p300基因的siRNA真核表达载体,转染细胞后能有效抑制p300基因的表达,且能促进ZR75-1细胞的生长,表明构建的p300 siRNA具有功能。     

两种质粒中gus基因在植物细胞和根癌农杆菌中的表达特性研究

以含有基因转化操作过程中常用的两种质粒载体pBI121和pCAMBIA2301的根癌农杆菌EHA105为材料,分别转化甜瓜子叶,应用组织化学方法检测了甜瓜子叶和子叶培养后的愈伤组织及根癌农杆菌菌液的瞬时转化效果,研究了两种不同的质粒载体上所含的gus基因在根癌农杆菌中和植物细胞中的表达特性.结果表明,不同质粒载体上所含的gus基因的表达特性不同,质粒载体pBI121上所含的gus基因既能在植物细胞中能表达,也能在根癌农杆菌细胞中表达,而质粒载体pCAMBIA2301上所含的gus基因能在植物细胞中表达,但是不能在根癌农杆菌细胞中表达.     

甜瓜ACC氧化酶反义基因植物表达载体的构建及转化烟草的研究

用限制性内切酶从目的基因供体质粒pBI-aACO1上切下大小约2．3kb的目的基因,将其定向连接在受体质粒pCAMBIA2301载体上,构建成含有GUS基因的甜瓜ACC钣化酶反义基因植物表达载体pCB-aACO1。采用直接转化法将pCB-aACO1导入根癌农杆菌菌株EHA105,并用新构建的工程菌对普通烟草进行了遗传转化研究。在Kanamycin选择压力下获得的烟草转化不定芽和完整植株,经过GUS基因组织化学法检测以及PCR方法鉴定,证实了该反义基因已导入烟草基因组中,此项研究为下一阶段用该反义基因转化甜瓜品种以改良甜瓜果实耐贮运性打下基础。     

三七细胞中共超表达FPS、SS对皂苷合成的影响

研究三七细胞中共超表达法呢基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophasphate synthase,FPS)基因、鲨烯合酶(squalene synthase,SS)基因对三七细胞皂苷合成的影响.利用农杆菌EHA105将pCAMBIA1300S-FPS超表达载体转入已超表达SS的三七细胞内,双抗生素培养及基因组PC...     

利用RNA干扰抑制p21WAF1/CIP1基因的表达及周期阻滞效应

目的：构建p21WAF1/CIP1基因小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体,观察其对p21WAF1/CIP1表达的影响和细胞周期的变化。方法：合成了针对p21WAF1/CIP1基因的siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSliencer2.1-U6neo上,将重组质粒和带FLAG标签的p21WAF1/CIP1共转染293T人胚肾细胞,通过Westernblot检验RNA干扰（RNAi）敲低外源p21WAF1/CIP1的效果;将重组质粒单独转染293T人胚肾细胞,利用p21WAF1/CIP1抗体检测RNAi敲低内源p21WAF1/CIP1的效果;利用流式细胞仪检测敲低后细胞周期的变化。结果：测序证明构建了p21WAF1/CIP1siRNA真核表达载体;Westernblot和流式细胞分析证明,构建的siRNA能有效降低p21WAF1/CIP1基因的表达,并且使G1期细胞数减少14.03%,S期细胞增多13.45%。结论：构建了p21WAF1/CIP1siRNA的真核表达载体,该siRNA能有效抑制p21WAF1/CIP1基因的表达并部分解除了G1期阻滞。     

野生罂粟RNAi表达载体的构建及遗传转化

通过PCR方法从质粒pGEM-bc中克隆野生罂粟BBE-COR融合基因片段约760 bp,以pHANNIBAL和植物表达载体pCAMBIA3300为基础,将克隆到的BBE-COR融合基因正向和反向片段分别插入pdk内含子的两边,经酶切、PCR鉴定及序列分析表明,特异性RNAi表达载体p3300-pHR构建成功.采用直接转化法,将重组子导入根癌农杆茵AGL1中.以野生罂粟茎尖生长点为转化受体,用农杆茵介导法将目的基因转入野生罂粟中.经卡那霉素和除草剂筛选后,共获得53株转基因植株,PCR检测后,其中14株表现阳性,可初步确定目的基因已经整合到野生罂粟基因组中.     

莱茵衣藻BBS1基因RNAi载体的构建及应用

巴德-毕氏综合症(Bardet-Biedl syndrome,BBS)是一种由多种基因突变造成、与原生纤毛功能缺失相关的疾病,包含12种致病基因,分别为BBS1-12。旨在通过对衣藻BBS1基因进行RNAi干扰来研究其在衣藻中的功能。首先搭建衣藻快捷简单的RNAi骨架载体;再用RT-PCR克隆莱茵衣藻BBS1基因的一段c DNA序列于中间载体p EASY-T1上;测序后通过两次酶切连接到RNAi骨架载体上,经菌液PCR、酶切和测序验证,成功构建BBS1基因的RNAi干涉载体。经基因枪介导法转化莱茵衣藻CC503,转基因衣藻具有明显不同于对照的表现型,趋光性发生了改变。