小白杏脂氧合酶基因PaLOX的克隆与序列分析

[目的]克隆小白杏(Prunus armeniaca)PaLOX基因全长并对其进行序列分析。[方法]根据已有的ESTs序列,设计3'和5'端RACE引物,利用RT-PCR和RACE技术克隆小白杏PaLOX基因c DNA全长。[结果]PaLOX c DNA全长序列为2 723 bp,含有一个1 002 bp的ORF开放阅读框,编码334个氨基酸,含有PLAT高度保守的特异结构域,预测蛋白质的相对分子质量为26.558 1 k Da,推测理化等电点为8.77,分子式为C1689H2635N459O490S13;该蛋白主要表现为亲水性,α-螺旋和延伸链则散布于整个蛋白质中,空间结构不稳定,无信号肽和跨膜结构,可能存在于线粒体中。进化分析表明,PaLOX氨基酸序列与梅、碧桃、苹果、梨、草莓等蔷薇科聚为一类,相似性依次为98%、99%、78%、77%、63%。[结论]获得了编码小白杏脂氧合酶的基因PaLOX全长序列,登录号为KM067451。     

胡麻脂氧合酶基因LuLOX1的克隆与表达分析

胡麻的籽粒富含多不饱和脂肪酸-亚麻酸,易被脂氧合酶(LOX)氧化,导致油脂的酸败。因此,油脂的稳定性和风味是影响胡麻油质量的重要因素。脂氧合酶是一类非血红素双加氧酶,其催化不饱和脂肪酸如亚油酸和亚麻酸的氢过氧化反应。本研究旨在阐明在胡麻种子发育时期脂氧合酶基因(LuLOX1)的表达、酶活性与品质的关系。本试验利用基于亚麻全基因组DNA测序数据,对LuLOX1基因进行克隆,利用RT-PCR方法进行LuLOX1基因表达分析,采用分光光度计法进行LOX酶活性测定。结果显示,LuLOX1基因的cDNA全长为2 607 bp,编码868个氨基酸,LuLOX1蛋白分子质量和等电点分别为98.87 kD、6.36。LuLOX1在种子发育早期高表达,之后呈下降的趋势,成熟期几乎检测不到该基因的表达。LuLOX1的酶活性变化与LuLOX1基因表达模式一致。该研究结果表明,LuLOX1可能参与了种子发育过程中脂肪酸氧化的调控。本研究为进一步研究其功能,通过脂氧合酶调控改进胡麻油脂品质奠定了基础。     

番茄脂氧合酶基因的表达和酶活性分析

将番茄脂氧合酶基因Tom loxD克隆至酵母表达载体pPIC9K中,转化毕赤酵母GS115菌株,构建组成型表达Tom loxD的酵母工程菌株。SDS-PAGE和W estern blot分析表明,经甲醇诱导,Tom loxD蛋白在酵母中得到表达,表达的融合蛋白分子量约为103.56 kD,与预测的分子量一致。酶活性分析表明,酵母中表达的Tom loxD蛋白具有脂氧合酶活性。半定量RT-PCR分析表明,Tom loxD基因在番茄中表达受机械损伤的诱导,损伤处理的番茄叶片中脂氧合酶的活性明显增高。说明Tom loxD基因在番茄防御信号中发挥作用。     

木瓜凝乳酶基因的克隆及序列分析

通过设计一对特异性的引物,采用RT－PCR方法从未成熟的木瓜组织中扩增得到木瓜凝乳酶基因,并将其重组到pPIC9K载体中,转化大肠杆菌并筛选阳性克隆,序列测定并利用BLAST软件进行核酸及氨基酸序列相似性分析,结果表明：通过序列组成及特征结构分析,扩增得到的基因为木瓜凝乳酶基因。     

桃脂氧合酶基因的原核表达分析

利用RT-PCR技术从桃(Prunus persica L.)基因组中克隆到脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)基因3(PpLOX-3)的ORF全长.ORF全长与原核表达载体pET-32a(+)相连接,构建重组原核表达载体pET-LOX-3,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,在IPTG诱导下,通过SDS-PAGE电泳,得到一条约125 kD的融合蛋白条带,除去pET-32a(+)自身诱导的约20 kD大小的蛋白后,结果与PpLOX-3编码的约105 kD蛋白的大小一致.     

小鼠脂联素受体2基因编码区的克隆及序列分析

构建小鼠脂联素受体2(mAdipoR2)基因cDNA克隆,并进行序列及基因结构分析,为进一步研究小鼠AdipoR2的表达和生物学活性奠定基础。用RT—PCR方法扩增mAdipoR2基因cDNA,获得的片段连接至pGEM-T载体,转化JM109大肠杆菌,经酶切鉴定后,进行序列测定。利用因特网生物信息学资源分析mAdipoR2基因序列。结果成功地构建了mAdipoR2基因cDNA克隆,其序列与GenBank登录序列一致。通过与小鼠基因组序列比对,分析了mAdipoR2基因结构,其编码序列由7个外显子组成,编码1个含7个跨膜区的膜蛋白,但该受体不属于G蛋白偶联受体家族(GPCRs)。mAdipoR2与人及大鼠蛋白的同源性分别为91％和95％。     

人神经生长因子基因的克隆及序列分析

以人基因组DNA为模板,采用PCR获得人神经生长因子(hNGF)基因,载体pGEM-T中,DNA序列分析克隆的hNGF基因与文献报道的完全一致。     

钩吻脂氧合酶基因GeLOX1的鉴定及低温胁迫表达分析

近年来,钩吻（Gelsemium elegans）的药用和饲用价值日益凸显,但钩吻在生长过程中不耐低温,挖掘其低温响应基因,为钩吻的抗寒育种研究奠定基础。植物中,脂氧合酶（lipoxygenase, LOX）在种子老化、抗逆境胁迫等方面的生理生化过程中有重要影响。基于课题组构建的钩吻转录组数据库,挖掘响应低温胁迫的钩吻LOX基因,运用RT-PCR技术,从中克隆到一条GeLOX1的cNDA全长序列,对其进行生物信息学、亚细胞定位、基因表达、原核表达及平板胁迫等分析。结果显示,GeLOX1所编码蛋白的氨基酸长度为761 aa,蛋白相对分子质量为87.00 kD,预测为不稳定的亲水性蛋白,含有28个丝氨酸磷酸化位点,22个苏氨酸磷酸化位点和9个酪氨酸磷酸化位点。进化树分析结果表明,GeLOX1属于9-LOX家族的成员。亚细胞定位检测结果显示,GeLOX1蛋白定位于细胞质中。实时荧光定量PCR分析发现,GeLOX1在钩吻的根中高表达,且其在4℃低温胁迫下的表达量呈现下调的趋势。经原核表达诱导后,GeLOX1的重组蛋白在约111 kD处出现目标条带,且重组蛋白的积累量在诱导8 h时达到峰值。此外...     

猪SOCS-2基因的克隆及序列分析

从中国地方猪品种八眉猪(BaMei)肾脏组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法克隆了猪SOCS-2(suppressor of cytokinesignaling-2,细胞因子信号转导抑制因子-2)基因的cDNA序列,经T/A克隆,插入到pMD19-T载体上,导入大肠杆菌DH-5α,阳性克隆经PCR鉴定后进行测序,将测序结果与GenBank中已登录的人、大鼠和小鼠SOCS-2基因的序列进行同源性比较,利用生物信息学和分子生物学软件对猪SOCS-2基因编码的蛋白进行结构预测。结果表明:首次成功克隆了猪SOCS-2基因的cDNA序列(GenBank登录号为EF121242),其长度为822bp,该基因ORF区核苷酸序列与其他物种相比同源性达到93%以上,氨基酸同源性则达到89%以上,生物信息学分析表明该蛋白分子量为22.25kD,等电点pI=8.30,包含199个氨基酸残基。该基因cDNA序列的克隆,有利于进一步研究SOCS-2调节机体发育的分子机理。     

5-脂氧合酶抑制剂的研究进展

脂氧合酶是一种含铁的氧化还原酶,存在于动植物的组织和细胞中。脂氧合酶主要分为1、3、5、8、12、15-脂氧合酶6种亚型。5-脂氧合酶(5-lipoxygenase,5-LOX)是LOX同工酶中研究较为深入的非血红素铁蛋白氧化代谢酶,是许多高活性氧化脂质生物合成中的关键酶,参与多种炎症性疾病,如炎症、哮喘、脑缺血、部分恶性肿瘤及阿尔茨海默症等疾病的发生和发展过程。因此,开发有效的5-LOX抑制剂对治疗上述疾病至关重要。本文介绍了5-LOX抑制剂的研究成果,并对其分类、来源、治疗药效和优缺点进行了讨论,为深入研发创新型5-LOX抑制剂提供理论依据。     

砂梨脂氧合酶cDNA片段克隆与RNAi载体构建

以砂梨‘若光’的成熟果实为材料,根据脂氧合酶氨基酸保守区设计1对简并引物,采用RT-PCR克隆到1段长827 bp的序列,经Blast比对和DNAstar软件聚类分析,结果表明由该序列推导出的氨基酸序列含有脂氧合酶氨基酸保守结构域,与马铃薯脂氧合酶基因的氨基酸序列相似性达到77.5%,判断其为砂梨脂氧合酶基因片段,命名为LOX1,并将序列登录到GenBank,登录号为EF215448。根据RNAi载体的构建原则,选择LOX1一开放阅读框设计携带酶切位点的特异引物,通过PCR扩增正、反向基因片段,再与YYT间隔区串连,插入植物表达载体pYF7713中的相应位置,成功地构建了干扰LOX基因表达的RNAi的植物双元表达载体pYL028,为深入研究该基因在砂梨果实成熟过程中的功能及耐贮藏基因工程育种奠定了基础。     

番鸭IFN-α基因的克隆与序列分析

广东华南农业大学兽医学院王春霞、王林川和黄爱芳等6位先生从经免疫的番鸭外周血分离淋巴细胞,经PHA刺激培养后提取总RNA,采用RT—PCR法,按照GenBank中序列号为X84764鸭Ⅰ型IFN（DIFN1）基因设计引物,扩增出了番鸭IFN基因,命名为MDIFN-α,包含编码MDIFN-α成熟蛋白全部核苷酸序列。DIFN1开放阅读框架（ORF）有576个核苷酸,编码191个氨基酸,其中除去信号肽的IFN-α为成熟DIFN1,共有486个核苷酸组成,编码161个氨基酸,含有不完整信号肽的MDIFN-α与X84764的核苷酸同源性为97．7％。故他们6位先生从研究结果和大量参考资料中推导氨基酸同源性为95．7％,后来研究的结果显示,那种MDIFN-α可能为鸭Ⅰ型IFN一个新的亚型。     

杏褪绿卷叶植原体新疆分离物核糖体蛋白基因的克隆与序列分析

【目的】了解杏褪绿卷叶植原体新疆分离物的系统发育关系及遗传分化,确定其分类地位。【方法】利用植原体核糖体蛋白(rp)基因的特异性引物rpF1/rpR1对新疆轮台县托克逊县杏褪绿卷叶病植株总DNA进行PCR扩增,并对部分扩增片段克隆、测序及序列分析。【结果】获得杏褪绿卷叶植原体新疆分离物rp基因片段大小为1196 bp,该片段包含部分rpS19以及rpL22和rpS3基因的全部序列。序列相似性和系统进化分析表明,杏褪绿卷叶植原体新疆分离物与16SrⅤ-rp亚组中的各代表性植原体的rp基因核苷酸序列相似性达到95.7%~99.3%,其中与rpⅤ-C亚组的甜樱桃绿化植原体和枣疯病植原体的相似性最高,核苷酸及氨基酸相似性分别达到99.2%~99.3%和98.3%~98.4%。进一步虚拟RFLP分析,发现杏褪绿卷叶植原新疆分离物rp基因的酶切图谱与rpⅤ-C亚组成员相似性最高,但在MseⅠ、SspⅠ和TaqⅠ的酶切位点上存在差异。综上初步判断其可能属于16SrⅤ组(榆树黄化组)中的一个新rp亚组。【结论】本研究首次报道了杏褪绿卷叶植原体新疆分离物的rp基因序列,确定了其分类地位,为杏褪绿卷叶病的早期诊断和检测提供了基础。     

小麦锌指蛋白基因的克隆、序列与表达分析

根据R基因及其调控基因保守序列设计简并性引物,对白粉菌接种和未接种处理的一对抗病和感病的小麦—黑麦等位突变易位系TAM104R和TAM104S总RNA进行RT-PCR扩增,得到一个诱导表达的cDNA片段。序列分析表明,该片段全长2474bp,其中含有一个822bp的完整开放阅读框,推测其编码一个有273个氨基酸残基、分子量约31kD的蛋白质分子。蛋白质的氨基酸序列比对显示,该蛋白质分子具有C2HC锌结合motif CX2CX4HX4C结构和锌指domain,可见克隆的cDNA是一个锌指蛋白基因,命名为TaZF。Southern杂交表明,TaZF在抗病易位系TAM104R的基因组中是多拷贝的。半定量RT-PCR分析显示,TaZF基因属组成型表达、但受白粉菌诱导表达上调的基因,推测其与白粉病菌的侵染过程相关。基因组DNA专化扩增、克隆和测序揭示TaZF基因无内含子。     

大鼠肝脏脂酶基因的PCR扩增,序列分析和克隆

报导了应用聚合酶链式反应技术,扩增大鼠肝脏脂酶基因及其克隆和序列分析的结果,经３１个循环的坟增,得到大鼠肝脏脂酶及其Ｎ端结构域的ｃＤＮＡ,前为１５０８ｂｐ的片段,后为１０７６ｂｐ的片段。克隆事,对此二片估进行一限制性内切酶物理图谱分析,测定了ＤＮＡ序列,并已将它们克隆表达载体ｐＧＴ－ｄ中。     

人和小鼠resistin基因的克隆与序列测定

构建人和小鼠resistin基因cDNA克隆,并进行序列分析,为进一步进行resistin表达和生物学活性研究奠定基础。用RT－PCR方法扩增人和小鼠resistin基因cDNA,获得的片段边疆至pGEM-T载体,转化大肠杆菌JM109,并经过敏过鉴定和序列测定。结果成功地构建了人和小鼠resistin基因cDNA克隆,人和小鼠resistin的氨基酸序列具有共同的结构特征CX28CX12CX8CXCX3CX10CXCXCX9CC,克隆的人resistin cDNA在编码序列第133位的A被T代替,导致45位密码子编码的丝氨酸由半胱氨酸代替,小鼠resistin cDNA在第16位的T被C取代,导致第6位密码子编码的苯丙氨酸改变为亮氨酸。密码子发生改变的生物学意义还有待于进一步研究。     

赤链蛇Sox基因的克隆及序列分析

参照人SRY基因HMG-box保守区的序列,设计一对兼并引物,采用PCR技术扩增了赤链蛇的Sox基因,并对扩增产物进行了克隆和测序,结果在雌雄个体中共筛选出三个Sox基因,其中有一个为雌雄共有,显示出性别差异性;三个Sox基因编码的氨基酸序列与人相应SOX3,SOX4,SOX22基因的相似性分别为96%,98%,96%。显示出Sox基因在进化上的高度保守性,本文为赤链蛇的性别决定机制研究提供了分子资料。     

金黄色葡萄球菌A蛋白基因的克隆及序列分析

 我们构建了金黄色葡萄球菌Cowan1株(CMCC26111)的染色体文库,转化大肠杆菌后筛选出一株protein A的阳性克隆。SDS-PAGE及Western-blot结果显示该克隆株表达的重组protein A的分子量为30 000,较天然protein A的小。该克隆中的protein A基因片段的序列分析表明,它含有天然protein A基因的启动子、信号肽以及至少四个与IgGFc段结合的结构域,而不含天然protein A的胞壁结合区,并发现其中有24个碱基对与Uhlen报告的protein A基因不同,由此导致三个编码的氨基酸发生变化,但这些差异并不影响该重组protein A与IgG Fc段的特异结合。     

牦牛α-乳清蛋白基因的克隆与序列分析

根据奶牛α－乳清蛋白基因序列设计引物,用PCR方法扩增并克隆了牦牛（Poephagens grunnieus）α－乳清蛋白基因的全序列。结果表明,在671－2689bp之间,共有4个外显子和3个内含子,牦牛α－乳清蛋白基因共编码142个氨基酸,其中第1－19氨基酸之间的短肽为信号肽序列。牦牛的α－乳清蛋白基因有较高水平的表达可能与基因内非编码序列碱基突变引起的回文结构消失有关。该基因5′侧翼序列在结构上牦牛和牛基本相同,只有MGF因子识别位点稍有差别。且牦牛的该序列更符合Groenen等1994年总结的该因子识别位点的模式序列,因此牦牛的该基因5′调控区可能更适于进行组织特异性表达的转基因动物的制作研究。     

毕氏酵母胱硫醚合成酶基因的克隆和序列分析

胱硫醚合酶（cystathione beta-synthase,CBS）是半胱氨酸代谢中一个重要的酶。以PCR技术为主,克隆了毕氏酵母来源的CBS基因。首先基于不同来源的CBS基因的序列比对,设计了一对CBS的性简并引物,用它扩增出毕氏酵母CBS基因的一个保守片段。根据这段DNA的序列,设计了5′RACE和3′RACE的引物,分别克隆了该基因的3′区和5′区。由此装配出完整的毕氏酵母的CBS基因序列。该基因编码了一种501个氨基酸残基的蛋白质。核苷酸序列和氨基酸序列的排比显示该基因与酿酒酵母来源的CBS基因有较高的相似性。破坏该基因,造成毕氏酵母的半胱氨酸生长依赖性。该序列已存入GenBank／EBM／DDBJ数据库,其登录号为No.AF367364。