抗CD5单链抗体基因克隆和表达

以分泌抗CD5单克隆抗体的杂交瘤细胞poly(A) mRNA为模板,通过RTPCR扩增出抗CD5单克隆抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL) cDNA片段组装出抗CD5单链抗体(ScFv) cDNA片段。该ScFv片段被克隆到pCANTAB 5E载体上,以E.coli TG1为宿主,进行噬菌体表面呈现。通过Molt4细胞表面分子CD抗原,对噬菌体表面呈现的ScFv进行免疫亲和富集筛选。经细胞ELISA鉴定,得到4株高亲和力克隆。DNA序列分析得知,单链抗体全长732碱基,其中VH为339碱基,VL为300碱基。抗CD5 ScFv在E.coli HB2151中以可溶形式分泌表达,产物主要分布于周质之中,占周质中总蛋白的20%。     

抗CD47单链抗体制备及抗原结合活性分析

[目的]研究旨在制备抗CD47小分子单链抗体,并分析其与抗原的结合能力和阻断作用的活性。[方法]采用DNA合成方法,将抗CD47的单克隆抗体B6H12的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),通过短肽(Gly4Ser)3连接形成B6H12单链抗体(B6H12-scFv),在大肠杆菌中可溶性表达并纯化B6H12-scFv。ELISA和Western Blot方法检测与人重组CD47的结合。检测EC9706和KYSE150两种食管癌细胞表面CD47的表达,细胞ELISA和流式细胞术分析B6H12-scFv与细胞表面CD47的结合。最后采用竞争ELISA分析B6H12-scFv对CD47与髓样细胞表面的信号调节蛋白α(SIRPα)结合的阻断能力。[结果]成功获得纯度达到90%以上的可溶性单链抗体。EC9706和KYSE150细胞均高表达CD47。细胞ELISA和流式检测B6H12-scFv浓度为50μg/m L可与EC9706表面CD47有较好结合。B6H12-scFv浓度为40μg/m L时也可以竞争性阻断CD47与SIRPα的结合。[结论]成功地构建了抗CD47单链抗体,浓度在20μg/m L具有EC9706的结合活性,也具有阻断作用。     

抗CD20单链抗体与力达霉素强化融合蛋白的制备及其抗肿瘤活性

抗体融合蛋白是新一代抗肿瘤抗体药物.CD20在约95%的B细胞非霍奇金淋巴瘤表面过度表达,是治疗B细胞淋巴瘤的理想靶点.力达霉素(LDM)是强效烯二炔抗肿瘤抗生素,目前已进入Ⅱ期临床阶段.采用DNA重组技术,利用大肠杆菌表达体系,制备抗CD20单链抗体与力达霉素辅基蛋白LDP的基因工程融合蛋白scFv-LDP.经纯化和...     

抗人CD19单链抗体基因的构建、表达及功能测定

采用RT-PCR方法从分泌抗人类白细胞表面分化抗原CD19单克隆抗体的杂交瘤细胞中克隆出V_H和V_L可变区基因,再通过重叠延伸拼接（spliceoverlap extension）PCR方法在V_H和V_L可变区基因之间引入连接肽(Gly4Ser)3,体外构建抗人CD19单链抗体（抗CD19-ScFv）基因。将其克隆至表达载体PET28a并在大肠杆菌中表达。SDS-PAGE和Westernblot分析结果表明,抗CD19-ScFv在BL21（DE3）菌中获得表达,重组蛋白的相对分子量为27kD,表达产物以不溶性包涵体形式存在,经过溶解包涵体,镍柱亲和层析纯化和体外复性过程,获得了高纯度的单链抗体片段。流式细胞分析结果证实抗CD19ScFv可与人类白细胞表面的分化抗原CD19结合,保留了鼠源性单抗与CD19结合活性。抗人CD19-ScFv的构建与表达,为下一步针对B淋巴系统恶性肿瘤的靶向治疗奠定了基础。     

抗前列腺特异抗原的单链抗体的克隆和表达

本文克隆了抗前列腺特异抗原(PSA)单抗526的轻、重链可变区基因,构建了在大肠杆菌中表达单链抗体的具有强启动子PR和PL的温度诱导型表达载体,表达了抗前列腺特异抗原的单链抗体。表达产物经ELISA测定证明具有特异结合PSA的能力。     

抗CD3/抗CD20双特异性单链抗体的表达、鉴定及活性分析

设计并合成多个60bp左右的DNA小片段 ,经重叠延伸PCR扩增获得1640bp的抗CD3 抗CD2 0双特异性单链抗体完整基因片段 ,将其克隆入真核定点表达载体pcDNA5 FRT中 ,脂质体法转染Flp-In^TM CHO细胞 ,获得稳定表达细胞株 ,目的蛋白在上清中的表达量约为 300μg/L。采用Ni_NTA柱对其进行了纯化 ,经SDS-PAGE蛋白电泳及Western-blot分析结果表明 ,含组氨酸标签的目的蛋白的分子量约为 70kD ,与预期结果一致。活细胞间接免疫荧光实验和玫瑰花环实验证明抗CD3抗CD20双特异性单链抗体具有与Ramous(CD20+)及Jurkat(CD3+)细胞特异性结合的活性。光学显微镜下可以观察到抗CD3 抗CD2 0双特异性单链抗体可以有效介导人外周血淋巴细胞裂解B淋巴瘤细胞Ramous。以上工作为进一步了解抗CD3 抗CD2 0双特异性单链抗体的体内体外生物学活性奠定了基础。     

抗TNF-α单链抗体的表达及其纯化

克隆抗人肿瘤坏死因子(TNF-α)鼠源单抗的可变区基因以构建其单链抗体(ScFv)表达载体,实现在大肠杆菌的表达,并进行ScFv的可溶性纯化与鉴定。采用RT-PCR技术,以前导肽序列的引物从1个分泌抗人TNF-α的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆抗体轻链、重链可变区基因(VL,VH),构建ScFv基因,将ScFv基因片段与pGEX-4T-1表达载体连接,在大肠杆菌中表达并采用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)进行可溶性纯化,最后鉴定其生物活性。结果显示,得到了功能性重排的轻、重链可变区基因,分别构建了VH和VL不同连接顺序的HLL(VH-Linker-VL)和LLH(VL-Linker-VH)两种ScFv,LLH的表达量较HLL的高,但亲和力不及HLL。采用Sarkosyl溶解包涵体,对目的蛋白进行可溶性纯化,蛋白纯度达到90%,纯化后的蛋白经ELISA和WB证明ScFv维持了亲本抗体与TNF-α特异性结合的能力,且具有细胞毒中和活性。实验中研究探索了一种新颖的,操作简单,省时的裂解、纯化方案,实现了单链抗体经原核系统的表达后得以可溶性纯化。     

抗肝癌单链抗体的活性检测

将抗肝癌单克隆抗体 ＨＡｂ２５的轻、重链可变区基因通过Ｌｉｎｋｅｒ连接起来,构建成抗肝癌单链抗体ｓｃＦｖ２５,然后亚克隆入含 Ｅ－ｔａｇ检测标签的 ｐＥＴ１５ｂ表达载体进行融合表达。表达产物（ｓｃＦｖ２５－Ｅ－ｔａｇ）采用 ＳＡＢＣ法对肝癌细胞涂片进行染色,利用鼠抗Ｅ－ｔａｇ抗体间接检测初步纯化的ｓｃＦｖ２５的活性,同时采用竞争结合实验检测ｓｃＦｖ２５的亲和活性。ｓｃＦｖ２５能够与靶细胞特异性结合,阳性部位主要定位于细胞膜上;ｓｃＦｖ２５可封闭５３％的亲本抗体的亲和活性。ｓｃＦｖ２５较好地保持了亲本抗体的特异性和亲和活性。     

抗CD3/抗CD20双特异性单链抗体介导的B淋巴瘤细胞体外裂解作用

在构建并成功表达抗CD3/抗CD20双特异性单链抗体(bscCD3×CD20)的基础上,对其在体外介导T淋巴细胞杀伤Ramous B淋巴瘤细胞的生物活性进行了分析。Annexin V/PI(AV/PI)染色和形态学观察及扫描电镜分析表明bscCD3×CD20介导的B淋巴瘤细胞体外裂解作用是通过先诱导靶细胞凋亡而继发坏死、裂解的方式实现的。非放射性细胞毒性分析表明bscCD3×CD20介导的T淋巴细胞杀伤活性随抗体浓度、反应时间和效靶比的升高而增加。在抗体浓度为5μg/mL、作用时间为24h、效靶比为10∶1时,杀伤活性最高可达87·3%。采用美国SuperArray人细胞凋亡芯片检测细胞杀伤起始阶段细胞凋亡相关基因的表达水平变化,许多凋亡相关基因的表达均发生了不同程度的上调或下调,其中ATM基因表达升高了187倍,p53基因升高了15倍,提示ATM-p53途径可能是bscCD3×CD20介导T细胞诱导B淋巴瘤细胞凋亡的主要途径。     

抗人CD3单链抗体四聚体基因的构建及表达

为构建和表达抗人CD3单链抗体 (scFv) 人p5 3四聚功能域融合基因 ,选用人IgG3上游铰链区作为抗人CD3scFv和人p5 3四聚功能域之间连接的linker .利用递归PCR法扩增人IgG3上游铰链区与人p5 3四聚功能域融合基因 ,克隆入pUC18载体中构建pUC18 IgG3 p5 3克隆载体 .将抗人CD3scFv克隆入pUC18 IgG3 p5 3载体中 ,构建抗人CD3scFv 人p5 3四聚功能域融合基因 .经酶切鉴定及序列测定证实后 ,将融合基因克隆入真核表达载体pSecTag2 B中 ,转染HeLa细胞进行表达 ,表达产物纯化后利用流式细胞仪进行亲和活性测定 .获得了抗人CD3scFv 人p5 3四聚功能域融合基因 ,基因全长 882bp ,可编码 2 94个氨基酸 ,与已发表的抗人CD3scFv、人IgG3上游铰链区和人p5 3四聚功能域基因cDNA序列一致 .表达产物经SDS PAGE和Western印迹实验证实为约 35kD的特异蛋白条带 ,纯化后经流式细胞仪检测可以特异性地结合人外周血单个核细胞 (PBMC)细胞 ,亲和力高于scFv ,为进一步临床应用奠定基础     

抗人CD3改形单链抗体的构建、表达及活性测定

ＣＤ３单抗通过多种途径有效地同体的免疫状态,在临床应用中具有极大的潜力。为克服鼠源单抗用于临床的局限性,拟采用抗体工程技术研制抗人ＣＤ３改形单链抗体。首先,将鼠源ＣＤ３单抗ＯＫＴ３轻重链ＣＤＲｓ分别移植到人源抗体ＬＳ１轻链和Ｎｄ重链的框架中,经计算机模拟其空间构象,进行残基替换,确定ＣＤ３改形ＶＬ、ＶＨ氨基酸序列,化学合成改形ＶＬ、ＶＨ基因,将其分别插入至载体ｐＲＯＨ８０中,构建成抗人ＣＤ３改形单     

表达抗α毒素单链抗体基因工程菌株的构建

将 2种抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体 (ScFv)基因ScFv 2E3和ScFv 1A8分别克隆至表达质粒pUC119,pET 2 0b ,pET 2 8a和pHOG2 1中 ,构建了重组质粒 ,分别转化至相应的受体菌JM10 5 ,BL2 1(DE3)和XL1 BLUE中 ,得到表达ScFv的重组菌株。ELISA和SDS PAGE分析检测表明 :经IPTG诱导后所表达的ScFv目的蛋白主要形成了包含体的形式 ,但也有少量ScFv存在于重组菌株的培养上清和胞周质中。经薄层扫描分析 :重组菌株XL1 BLUE (pHOG 2E3)的蛋白表达产物分别占菌体可溶性蛋白的 4% ,重组菌株XL1 BLUE (pHOG 2E3)的蛋白表达产物占菌体总蛋白的相对含量为 2 2 % ,其相对分子量约为 31ku。表达的ScFv蛋白不但具有中和卵磷脂酶的活性 ,而且能够对致死性腹腔攻击α毒素的小鼠产生良好的被动保护作用     

抗肠炎沙门氏菌单链抗体制备及其特异性分析

目的:利用基因工程技术制备抗肠炎沙门氏菌的单链抗体.方法:从抗肠炎沙门氏菌单克隆抗体的杂交瘤细胞中纯化RNA,反转录后扩增出抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因片段,采用重叠延伸的方法,用柔性多肽Linker接头(Gly4 Ser)3按VL-Linker-VH方式将VH基因和VL基因拼接成单链抗体基因片段后,连接到pGEX-4T-1载体上,进行重组转化.挑取阳性克隆,经IPTG诱导后,通过GST柱进行亲和层析,最后利用ELISA检测抗体的活性.结果:成功构建了表达抗肠炎沙门氏菌单链抗体的基因工程菌株,经SDS-PAGE和ELISA检测结果表明,诱导表达的单链抗体scFv分子量约为60 kDa,其能特异与肠炎沙门氏菌结合,但与副甲伤寒沙门氏菌、鸭沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌有轻度交叉反应.结论:成功构建了抗肠炎沙门氏菌单链抗体的表达菌株,表达的单链抗体scFv可作为沙门氏菌的检测的候选抗体分子.     

抗人CD3单链抗体与改形单域抗体的表达

设计并化学合成含有适当酶切位点及连接肽的寡核苷酸序列,与一定的背景载体连接并改造成适用于单链抗体表达的载体:外分泌型pWAI80和融合蛋白型pROH80从分泌抗人CD3单克隆抗体的杂交瘤细胞UCHT1中,经PCR扩增出轻、重链可变区基因V_H和V_K,并插入上述表达载体中构建成单链抗体基因.通过对鼠OKT3结合位点的结构模拟,并比较人、鼠抗体家族性保守序列,设计出改形OKT3的基因序列.化学法部分合成8个寡核苷酸片段,应用重叠PCR技术扩增出完整改形重链基因V_H,并克隆、酶切和测序鉴定.将所克隆V_H基因插入表达载体pCOMB3和 pGEX-4T-1中进行表达.经 IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和 Western blot分析以及 ELISA检测,结果发现分泌型表达产物及 M13基因Ⅲ-V_H改形单域抗体融合蛋白具有与CD3单抗竞争抑制的活性;而融合型单链抗体及改形单域抗体表达产物主要以包涵体形式存在,占细菌总蛋白的 30％左右.     

抗人血管内皮生长因子单链抗体基因的构建、表达及活性鉴定

鼠单克隆抗体E11能与人血管内皮生长因子(VEGF)特异结合,已用于临床检测恶性肿瘤细胞VEGF的表达,并初步证明其体内抑瘤活性。为便于大规模生产,特进行基因工程改造,构建小分子的单链抗体(scFv)。首先通过逆转录及多聚酶链式反应(PCR),分离并克隆E11的可变区基因。经测序表明,E11轻链可变区(VL)基因全长333bp,编码111个氨基酸,归属小鼠轻链可变区基因第Ⅲ亚组。重链可变区VH基因全长369bp,编码123个氨基酸,归属小鼠重链可变区基因Ⅱ(A)亚组。然后用一编码亲水性多肽接头的DNA片断将E11单抗轻、重链可变区基因连接,构建表达质粒pET-15YV,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。表达产物(包含体)经变性及复性后,用免疫组化法检测该单链抗体结合抗原(颊癌)能力。对颊癌组织检测的结果表明,基因工程抗体scFv与亲代抗体一样,具有较高的组织特异性。本研究获得的抗人VEGF单链抗体具有潜在的临床价值,为肿瘤放射免疫显像及以血管为靶标的抗血管生成治疗奠定了基础。     

抗转铁蛋白受体单链抗体的表达、纯化及活性测定

根据转铁蛋白受体和转铁蛋白特异性结合的性质,利用亲和纯化的方法从胎盘中提取转铁蛋白受体。以转铁蛋白受体为抗原包被免疫管,从全合成人源噬菌体单链抗体库中筛选其抗体。对筛选到的抗体进行特异性鉴定后,将抗体基因插入表达载体pET22b( ),转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后获得可溶性表达。HeLa细胞的免疫组化结果显示,表达的抗体可以与转铁蛋白受体结合。表达产物经Ni-NTA金属螯和层析柱纯化、脱咪唑后,从尾静脉注射小鼠。1h后,去除血液及毛细血管的干扰,在脑实质中检测到了抗体的存在,说明该抗体可以通过血脑屏障。     

人源抗ICAM-1单链抗体的制备及其生物学活性鉴定

利用噬菌体展示技术筛选特异性人源抗ICAM-1单链抗体（Anti-human ICAM-1 scFv）并进行生物学活性鉴定。应用Tomlinson I+J噬菌体抗体库,以P1抗原肽为包被抗原,经过4轮“吸附-洗脱-扩增”进行亲和富集筛选。以PCR反应、ELISA抗原交叉反应和Dot blotting实验进行阳性克隆的鉴定。scFv经原核表达和分离纯化后,以Western blotting实验、竞争ELISA实验和细胞黏附抑制实验对其生物学活性进行初步鉴定。Tomlinson I+J噬菌体抗体库经4轮亲和富集筛选,利用ELISA方法成功筛出4株阳性克隆。通过PCR鉴定反应、ELISA抗原交叉反应和Dot blotting实验,最终获得了1株既能与P1抗原肽特异结合又能与人ICAM-1抗原特异结合的阳性克隆J-A1。对scFv进行原核表达和亲和层析后获得了高纯度的目的蛋白。竞争ELISA实验和细胞黏附抑制实验证实纯化的scFv具有良好的亲和活性和抗细胞黏附活性。文中成功利用噬菌体展示技术筛选到特异性人源抗ICAM-1 scFv,为进一步探索该抗体在炎症相关性疾病治疗中的应用奠定了基础。     

应用噬菌体抗体库技术制备特异抗人纤维蛋白鼠单链抗体

应用Pharmacia公司的重组噬菌体抗体系统,从经过人交联纤维蛋白特异抗原D二聚体(DD)免疫过的鼠脾细胞mRNA中构建出组合单链抗体(ScFv)cDNA文库。文库cDNA克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E,转化大肠杆菌TG1,得到2.5×10~5个氨苄抗性菌落。通过噬菌体表面呈现,用DD对表达的重组噬菌体单链抗体文库进行三轮亲和富集获得一株特异抗DD的噬菌体单链抗体(ScFvA11)。经Phage-ELISA鉴定,呈现在噬菌体表面的ScFvA11与DD结合的ELISA阳性滴度小于10~7tfu/ml,而与人纤维蛋白原结合的ELISA滴度大于10~(10)tfu/ml,两者相差1000倍以上。表明ScFvA11具有较好的DD结合特异性。经序列分析,ScFvA11cDNA全长729bp,其中Vh基因354bp,编码118个氨基酸;Vl基因327bp,编码108个氨基酸;Vh与Vl之间为(Gly_4Ser)_315个氨基酸连接肽。     

抗犬细小病毒VP2蛋白单链抗体的制备与中和活性研究

为了减轻鼠源单克隆抗体(McAb)异源性引起的宿主免疫排斥反应,同时克服生产McAb成本高及费时费力等缺点,利用原核表达制备具有抗犬细小病毒(CPV)鼠源抗体可变区基因的单链抗体(single chain antibody fragment,ScFv)。提取实验室前期制备筛选的分泌具有良好中和活性抗CPV VP2蛋白McAb的杂交瘤细胞株总RNA,从反转录cDNA中扩增抗体重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因并克隆到表达载体中,构建重组质粒p OPE101-ScFv;将重组质粒转化大肠杆菌进行诱导表达,通过蛋白免疫印迹(Western blot)实验、酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)证明,利用大肠杆菌表达系统获得的ScFv具有和CPV特异性结合的能力,且具有中和活性,效价为1:20(0. 028μg/ml),为CPV的临床免疫治疗提供基础。     

抗对虾白斑综合症病毒单链抗体A1基因在酵母中表达及其与抗原结合活性

通过PCR从噬菌粒载体上扩增一种抗对虾白斑综合症病毒 (WSSV)的单链抗体A1(ScFvA1)基因 ,并构建于大肠杆菌 酵母穿梭质粒载体pPIC9K上。经PCR ,酶切 ,测序鉴定重组克隆 ,发现重组成功。将重组质粒pPIC9K ScF vA1转化毕赤酵母 (Pichiapastoris)GS115中 ,利用甲醇诱导 ,将单链抗体A1在酵母中进行了初步表达。经SDS PAGE电泳 ,发现其大小约为 32KD ,通过ELISA实验 ,证明表达上清液中的单链抗体具有很高的WSSV结合活性。