透明质酸制备的研究进展

透明质酸(Hyaluronic acid简称HA)是一种国际上公认的生物大分子保湿剂,用于眼科显微手术、关节炎治疗、高级化妆品等领域.目前,透明质酸的生产方法逐渐由动物组织提取法转向微生物发酵法.细菌发酵法生产透明质酸具有产量不受原料资源限制、成本低、产量高、有较高的相对分子量,分离纯化工艺简便,易于大规模生产等特点成为透明质酸生产的发展方向,应当进一步深入研究.综述了透明质酸的化学结构、理化性质、应用及生产方法等方面的研究现状,并预测了其以后发展趋势.     

微生物发酵法生产透明质酸

透明质酸(Hyaluronic acid,以下简称HA)是一种高分子粘多糖,具有良好的亲水性、生物相容性和保湿功能,广泛应用于食品、化妆品和医药领域.透明质酸的传统生产方法是主要从动物组织中提取,用微生物发酵法生产透明质酸正逐步取代传统生产方法,其优点是原料易得、成本低、所产透明质酸有更高的产量和分子量等原因.     

透明质酸的制备与鉴定

透明质酸是一种酸性粘多糖,其特有的粘弹性和保湿性已被用于医药与化妆品的生产中。本文以黄牛眼睛为材料,通过提取,除杂质、有机溶剂沉淀等步骤进行透明质酸的制备,并对其性质进行鉴定,表明用此方法制备的透明质酸基本达到了市场的要求,而且此工艺简单,成本低廉。     

超声波对发酵液中提取透明质酸的影响

目的：提高发酵液中透明质酸的提取率。方法：应用超声波预处理发酵液的方法对醇沉法提取透明质酸的影响进行研究。结果：在超声波功率100W、处理温度15℃、处理时间10min时,透明质酸提取率相对于未经超声波处理的发酵液提高了38.6%。因此,超声波预处理透明质酸发酵液可以达到提高透明质酸提取率的目的。     

透明质酸生物合成途径及基因工程研究进展

透明质酸是由N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸组成的双糖单位聚合而成的直链酸性黏多糖,已被广泛应用于药物、化妆品和食品添加剂。微生物发酵法是目前生产透明质酸最有效的方法。生物体内透明质酸的合成途径基本一致,均为Leloir途径。透明质酸合成操纵子由透明质酸合酶基因、尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因组成,其表达受Cov S/CovR和Lux S等多种调控系统调控。随着分子生物学技术的迅速发展以及对透明质酸合成相关基因了解的不断深入,人们从提高透明质酸安全性、提高透明质酸产量和调控透明质酸分子质量三个方面出发,通过基因工程手段构建出了高产、安全、一定分子质量范围的透明质酸生产菌株。就有关透明质酸生物合成途径、合成相关基因表达调控及生产菌株分子生物学改造的策略与研究进展进行综述和展望。     

马链球菌透明质酸合成酶基因的分子克隆及表达

根据Streptococcus equisimilis、Streptococcus pyogenes、Streptococcus uberis三种链球菌透明质酸合成酶(seHAS、spHAS、suHAS)基因的高度保守区,设计一对简并引物,用两次PCR从Streptococcus equi的总DNA中扩增出sqHAS基因。构建表达质粒pSE-sqHAS并转化大肠杆菌DH5α,诱导培养后在细胞膜中检测到sqHAS蛋白及活性。利用携带该酶的细胞膜以UDP-GlcA和UDP—GlcNAc为底物在体外合成了分子量为3.6×10~6Da的HA,分别是发酵法生产和提取法生产的HA的分子量的2.5倍和5倍左右。马链球菌透明质酸合成酶基因的克隆及表达,国内外文献尚未见报道。本研究为体外酶法生产透明质酸做了初步探索。     

合成生物学技术在糖胺聚糖生产中的应用

糖胺聚糖是一类直链酸性多糖,具有优良的生物相容性和生理活性,被广泛应用于临床治疗,并用作药物运输载体,其中透明质酸、 肝素和硫酸软骨素的相关研究最为深入。由于传统方式（如动物组织提取法等）制备糖胺聚糖,存在外毒素、病毒等致病因子污染的风 险,因而,利用合成生物学技术,构建重组工程菌株生产糖胺聚糖,逐渐受到研究者们的重视。主要围绕透明质酸、肝素前体及软骨素, 综述糖胺聚糖的生物合成途径,并探讨产糖胺聚糖基因工程菌的构建以及糖胺聚糖生物合成过程中分子质量调控机制,以期为构建产高 品质糖胺聚糖工程菌株提供新思路。     

微生物发酵法生产高分子量透明质酸的研究进展

透明质酸是一种线性大分子黏多糖,分子量定义其流变性能,影响生理反应,并决定合适的用途。传统研究通过优化发酵提高透明质酸的产量已取得显著成效,近年来,研究重点逐渐转向如何提高透明质酸产品的分子量。目前,高分子量透明质酸具有良好的黏弹性、保湿性、黏附性,在医药中的应用是中、低分子量透明质酸不可替代的。概述了透明质酸分子量的调控机制,以及利用微生物发酵法生产高分子量透明质酸的研究进展,并对其发展方向进行了展望。     

连续发酵生产透明质酸

目前,透明质酸都是从公鸡冠组织提取的,在医药上用于使盲人复明的角膜和眼球晶体移植。日本资生堂日化公司也建起了发酵法生产透明质酸的技术。以兽瘟链球菌(Streptococcus zooepidemicus)为出发株,经过诱变,每升培养液得5—6克。这种分批法制造出的产品成本高,产量有限。     

基因工程技术优化透明质酸生产的研究进展

透明质酸是由葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺组成的双糖单位聚合而成的直链酸性粘多糖,在医药、化妆品、食品等领域拥有庞大的市场。传统研究通过优化发酵参数改善透明质酸的生产虽然取得了显著成效,但也趋于上限,加之天然生产菌株固有的发酵培养基成本高、具有一定致病性等等的劣势也日益显著。随着分子生物学技术的迅速发展以及对透明质酸合成相关基因研究的不断深入,研究重点逐渐转向利用基因工程技术构建高产、安全、具有特定分子量的透明质酸工程菌株。以下就有关透明质酸生产菌株基因工程改造的策略及研究进展进行概述和展望。     

发酵透明质酸寡糖兽疫链球菌工程菌株的构建

透明质酸(HA)广泛应用于医学、化妆品、食品等领域。HA的生物活性取决于其分子量(M_w)。透明质酸寡糖由于具有重要的生理活性与特殊生理功能,在医药领域具有重要的应用前景。兽疫链球菌因其发酵周期短、生产强度较强的特点,在商业生产HA上具有广泛的应用。为了高效发酵合成透明质酸寡糖和解决发酵过程的溶氧问题,文中通过在兽疫链球菌WSH-24中过表达透明质酸合酶HasA以及优化表达水蛭来源的透明质酸酶LHAase。重组菌株摇瓶发酵24h,透明质酸寡糖积累至0.97g/L,比野生菌提高了182.0%。在3L发酵罐中发酵24 h,透明质酸寡糖生产强度为294.2 mg/(L·h),HA积累至7.06 g/L,比野生菌的罐上水平提高了112.4%。文中所构建的发酵合成透明质酸寡糖的兽疫链球菌重组菌株具有重要的应用前景。     

一种新型粘多糖结构与性能的检测

粘多糖是由糖醛酸和氨基己糖交替连接成的高分子物质, 理化性质独特, 应用范围广泛。通过对突变株兽疫链球菌Streptococcus zooepidemicus BU100进行发酵, 可产一种新型粘多糖(下文用粘多糖A代替)。利用咔唑法、Elson-Morgan法、考马斯亮蓝法、红外光谱以及13C核磁共振谱测定粘多糖A的结构, 结果显示粘多糖A中糖醛酸和氨基糖的摩尔比例接近1:1, 蛋白含量符合标准(<0.1%); 粘多糖A图谱中出现的结构特征峰大部分与透明质酸相同。对粘多糖A的实用性能进行检测, 并用透明质酸做对比, 结果表明透明质酸在两种湿度下的吸湿性均要好于粘多糖A, 但粘多糖A的保湿性要好于透明质酸。粘多糖A总体的抗氧化性好于透明质酸, 并且粘多糖A耐透明质酸酶。粘多糖A可作为保湿剂、润滑剂、抗氧化剂等被更加有效地应用在医疗和化妆品等领域。     

絮凝法预处理透明质酸发酵液的研究

目的:提高透明质酸的纯度。方法:研究了絮凝预处理发酵液对醇沉法提取透明质酸的影响,并通过正交试验对预处理条件进行了优化。结果:明矾可作为最佳絮凝剂,正交实验最佳絮凝条件为:絮凝剂添加量1 000mg/L、絮凝温度30℃、絮凝转速60r/min、絮凝时间20min。在该条件下处理的HA发酵液相对于未经过处理的对照组,菌体去除率可提高42.6%,蛋白去除率可提高5.9%。     

浅议透明质酸发酵条件的优化

现阶段透明质酸已广泛应用于化妆品、美容行业、保健食品、医药等很多领域。国内市场及国际市场得扩展速度都非常快,随之而来的透明质酸的市场竞争也日趋激烈。因此,为了满足国内日益增长的市场需求,我国应大力发展微生物发酵法制备透明质酸的技术,选育高产菌种,完善发酵工艺,以提高工业化的产量与质量。为进一步提高兽疫链球菌透明质酸的产量,优化其发酵条件,采用15L-30L×3的发酵系统进行试验。     

透明质酸生产菌溶血素S基因缺失突变菌株的构建及其特性北大核心CSCD

【目的】马链球菌兽疫亚种是工业上生产透明质酸的主要菌种,该菌能产生引起宿主细胞溶血的链球菌溶血素S(streptolysin S,SLS)毒素,因而其产品的安全性一直是人们所担心的问题。本实验的目的就是通过基因敲除的方法构建不产SLS的透明质酸生产工程菌,同时探讨溶血素sag A基因缺失对菌株透明质酸合成和其他毒力因子的影响。【方法】利用温度敏感/自杀性质粒p JR700载体系统,构建马链球菌兽疫亚种sag A基因缺失突变株;通过PCR扩增,溶血平板和SLS含量测定等方法确定sag A基因缺失;采用分光光度、SDS-PAGE和细胞毒性试验等分析方法,对野生菌株和sag A基因缺失突变菌株透明质酸含量、透明质酸分子量、溶血素Hylc、透明质酸分解酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和菌体表面蛋白等相关毒力因子进行对比研究。【结果】获得了透明质酸产量提高30%而溶血活性极低的马链球菌兽疫亚种sag A基因缺失突变株。该突变株与野生菌株相比较,透明质酸分解酶活性增加而透明质酸相对分子量降低,此外,与毒力相关的表面蛋白含量、溶血素Hylc和甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性也显著降低。细胞毒性实验结果表明,野生菌株与sag A基因缺失突变菌株的培养物上清液,对细胞活性的影响存在显著差异。【结论】在马链球菌兽疫亚种中sag A不仅是表达溶血素SLS的基因,同时sag A基因对菌株透明质酸合成、透明质酸分解酶、菌体表面蛋白、溶血素Hylc和甘油醛-3-磷酸脱氢酶等都具有调节作用。     

复合透明质酸微针制剂的制备及优化

目的:考察透明质酸复合微针的制备方法,并选择形态粘度适宜的高分子溶液制备透明质酸微针。方法:测定不同浓度透明质酸溶液的粘度,确定适宜制备微针的溶液浓度。利用聚乙烯醇反复冷冻-解冻的物理交联方法制备透明质酸复合微针,并加入其他辅料考察微针针形的优劣。利用高效液相色谱法考察优化后透明质酸微针的体外释放行为。结果:10%透明质酸溶液适宜用抽真空法制备微针,聚乙烯醇优化后的透明质酸微针柔韧性更佳,刚性减小,易于揭膜。微针针形良好,不易断裂。体外释放实验中显示有缓释效果,8小时内可释放40%的理论载药量。结论:通过加入聚乙烯醇等生物相容性良好的辅料制备透明质酸微针,既具有良好的物理性能,又有较好的释放行为,优于目前文献报道的纯透明质酸微针的性能,可继续优化处方,具有更进一步研究的价值。     

营养条件对兽疫链球菌发酵生产透明质酸的影响

透明质酸 (Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ ,简称ＨＡ)是Ｎ 乙酰氨基葡萄糖胺和葡萄糖醛酸以 β 1 3糖苷键和 β 1 4糖苷键连接而成的二糖单体重复构建而成的杂多糖 ,广泛存在于高等动物的结缔组织内。由于结构上的特点 ,ＨＡ具有很高的粘弹性和极强的保水性等特征 ,已被大量用于医学医药、化妆品工业[1,2 ] 。1937年Ｋｅｎｄａｌｌ[3 ] 等发现用溶血性链球菌 (Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ)可以产生ＨＡ。其后 ,陆续发现许多能产生ＨＡ的微生物菌种 ,逐渐开发出一条可替代传统的动物组织提取法[4 ] 生产ＨＡ的新途径…     

微生物发酵生产莽草酸及其树脂分离性能的探讨

莽草酸是一种具有较高药用价值的化合物,在医药、食品、工业等领域具有重要作用。莽草酸的生产方法很多,包括植物提取法、化学合成法、微生物发酵法等,从植物中提取时使用中草药植物八角茴香,化学合成时以环戊二烯和苯醌为原料,微生物发酵生产时以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等微生物为工程菌。本文就莽草酸的微生物发酵生产方法做简单介绍,阐述了莽草酸树脂分离性能等的研究,并对莽草酸未来发展应用做出展望。     

高产透明质酸菌种FJ-23的诱变选育

目的:高产透明质酸菌种的选育是提高透明质酸产量和质量的关键。方法:以马疫链球菌SH-0为出发菌,对其进行紫外诱变和NTG诱变选育。结果:筛选出溶血素和透明质酸酶双缺陷型突变菌株FJ-23,其透明质酸产量提高了7倍;突变株经6次传代,其产酸量及HA的相对分子量保持稳定,为今后进一步研究发酵法生产透明质酸打下基础。     

高原鼢鼠组织中透明质酸提取工艺及分子表征

旨在建立高原鼢鼠组织中透明质酸(Hyaluronic acid,HA)提取工艺。采用单因素试验确定粗提、酶解和除杂等工艺的最佳条件,通过响应面法进一步优化粗提和酶解工艺条件。通过红外分光光度法确定HA的分子结构,Bitter-Muir法确定其葡萄糖醛酸的含量,黏度法和体积排阻色谱法确定透明质酸的分子量。高原鼢鼠最佳粗取工艺∶液料比4 m L/g(水/动物组织,V/W),提取温度26℃,提取时间1.6 h;最佳酶解工艺:酶解温度37℃,p H8.7,加酶量0.7%(1∶250胰蛋白酶/动物组织,W/W);最佳除杂工艺为:氯苯体积20%(氯苯/HA水溶液,V/V),以3倍体积95%乙醇沉淀,以7%活性碳(活性碳/HA水溶液,W/V)除杂,透析时间3 h。在此工艺条件下,每500 g高原鼢鼠组织可得到(144±3.61)mg HA粉末。平均回收率为72.73%。红外图谱显示提取物具有与Sigma公司的HA标准品一致的吸收峰,葡萄糖醛酸的质量分数为45.60%,蛋白质含量为0.11%,其分子量达到3×106 Da。本工艺提取的高原鼢鼠组织来源的HA回收率好,纯度高;高原鼢鼠组织中HA分子量大,含量高。