小麦与禾草对称融合中杂种染色体组成与亲缘关系的初步探究

采用PEG 法诱导普通小麦的原生质体与新麦草、无芒雀麦及韦氏雀麦等3 种近缘或远缘属间禾草的原生质体进行对称融合。对融合再生细胞系进行形态比较、同工酶分析及5S rDNA间隔序列差异分析, 以鉴定其杂种性质。对部分杂种细胞系进行了染色体组成的分析, 就体细胞杂种中小染色体及染色体断片的产生与异源核质的互作及亲缘远近的关系等问题进行了讨论。     

普通小麦与无芒雀麦不对称体细胞杂交的研究

普通小麦（ＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍＬ．）９９Ｐ原生质体与经紫外线照射的无芒雀麦（ＢｒｏｍｕｓｉｎｅｒｍｉｓＬｅｙｓ）愈伤组织来源的原生质体用ＰＥＧ法诱导融合。融合再生的３个单细胞克隆（Ｎｏ．１～Ｎｏ．３）经染色体、同工酶和ＲＡＰＤ分析表明,它们均为杂种细胞系。Ｎｏ．１克隆形成的愈伤组织分化出大量白化苗,其叶片同工酶和ＲＡＰＤ分析均出现双亲特征谱带及新带,白化苗的染色体数目为４２～５４,大于亲本小麦,并具有无芒雀麦的小染色体和染色体断片,确认它们为不对称体细胞杂种。     

草木樨状黄芪和木本霸王的科间体细胞杂交

在成功培养原生质体的基础上, 用改进的PEG-高pH高钙法诱导草木樨状黄芪(Astragalus melilotoides)和木本霸王(Zygophyllum xanthoxylum)原生质体融合, 得到了科间体细胞杂种融合细胞。采用罗丹明-6G预处理草木樨状黄芪原生质体以及UV-B辐照霸王原生质体, 使双亲原生质体及其同源融合产物均不能持续分裂而死亡, 融合后的杂种细胞由于生理互补可恢复持续分裂能力而被筛选出来。融合产物经培养分裂获得了2个杂种细胞系, 其中1个分化出芽。染色体计数和分子鉴定证明了杂种的真实性。初步比较了杂种细胞系及亲本对盐分和水分胁迫的耐受性, 结果表明杂种细胞系对盐分和水分胁迫的耐受性介于两个亲本之间。     

草木樨状黄芪和木本霸王的科间体细胞杂交

在成功培养原生质体的基础上,用改进的PEG-高pH高钙法诱导草木樨状黄（Astragalus melilotoides）和木本霸王（Zygophyllum xanthoxylum）原生质体融合,得到了科间体细胞杂种融合细胞。采用罗丹明-6G预处理草木樨状黄芪原生质体以及UV-B辐照霸王原生质体,使双亲原生质体及其同源融合产物均不能持续分裂而死亡,融合后的杂种细胞由于生理互补可恢复持续分裂能力而被筛选出来。融合产物经培养分裂获得了2个杂种细胞系,其中1个分化出芽。染色体计数和分子鉴定证明了杂种的真实性。初步比较了杂种细胞系及亲本对盐分和水分胁迫的耐受性,结果表明杂种细胞系对盐分和水分胁迫的耐受性介于两个亲本之间。     

红豆草与苜蓿原生质体融合再生属间体细胞杂种植株

通过PEG诱导红豆草抗羟脯氨酸细胞系原生质体与苜蓿根癌农杆菌702转化系原生质体融合,首次选择得到非对称属间体细胞杂种愈伤组织,并分化出17株小植株.PEG可诱导原生质体紧密粘连,使相连膜环化形成泡囊状结构,导致原生质体相互融合.融合诱导溶液中附加 5％～ 10％甘油可以明显提高异源融合频率.采用后滴原生质体法具有较好的结果.杂种再生芽的染色体数目处于30～60条之间,并包含红豆草的小染色体和苜蓿的2条具有2个明显缢痕的染色体.同工酶分析和胭脂碱合成酶活性检测,均证实其杂种特征.     

电融合法产生骆驼刺与鹰嘴紫云英属间体细胞杂种

采用电融合法获得了骆驼刺和鹰嘴紫云英属间体细胞杂种。骆驼刺原生质体来自发根农杆菌A4转化系细胞,并经碘乙酰胺处理;鹰嘴紫云英原生质体从甲硫氨酸抗性系细胞分离。双亲及同源融合产物均不能在无激素的筛选培养基上持续分裂,融合后的杂种细胞由于双亲生理互补效应可恢复持续分裂能力而被筛选出来。本实验优化了电融合参数,如直流脉冲、交流脉冲和脉冲次数。融合产物经培养获得的杂种细胞系经形态学、染色体数目检查、生化及随机扩增多态性DNA分析,鉴定出10个杂种克隆,并从3个杂种克隆再生了小植株。     

通过“供体-受体”原生质体融合将裸燕麦部分核基因组转移给普通小麦(英文)

本文进行了小麦和裸燕麦悬浮细胞原生质体的电融合,并基于双亲失活(用IOA处理受体小麦原生质体,用γ-射线照射供体裸燕麦细胞系),获得可能的杂种愈伤组织。对7块愈伤组织进行了乙醇脱氢酶(Adh)同工酶筛选,发现5块表现出双亲特征酶带。对3个杂种细胞系进行5种同工酶分析,证实它们均为稳定的不对称体细胞核杂种细胞系;它们表现出小麦的完整谱带和裸燕麦的部分谱带。对2个杂种细胞系及亲本的核糖体DNA Southern分析结果表明只有一个杂种细胞系(HB 95)含有双亲的全部谱带。细胞学观察表明,2个杂种细胞系的染色体数目均显著高于双亲。从杂种细胞系HB 94中分化出叶原基等分化结构。Adh同工酶分析表明,这些分化结构具有和母体细胞系完全相同的杂种谱带。     

青菜与芥菜花粉－体细胞原生质体融合的研究

以聚乙二醇（ＰＥＧ）为诱导剂,试验用４种方法进行青菜幼嫩花粉原生质体与芥菜下胚轴原生质体的融合,结果以修改的Ｔｅｒａｄａ等的方法最好。融合后原生质体的培养形成了愈伤组织,但未分化出芽,个别愈伤组织分化了根。用ＲＡＰＤ技术对任选的５个细胞系进行鉴定,发现１个细胞系含双亲的ＤＮＡ片段,可确认是青菜幼嫩花粉原生质体与芥菜下胚轴原生质体融合后产生的杂种细胞系。     

普通小麦与簇毛麦原生质体的紫外线融合

从来源于普通小麦品种济南177（Triticum aestivum cv.Jinan 177）悬浮细胞系的原生质体与来源于簇毛麦（Haynaldia villosa）胚性愈伤组织的原生质体融合获得体细胞杂种。供体簇毛麦原生质体在融合之前用紫外线照射30s或1min,紫外线剂量为360Цw/cm^2。仅由紫外线照射30s的组合获得再生愈伤组织克隆。细胞学、生物化学及PCR分析结果证实了再生克隆的杂种性质。用线粒体基因特异的探针进行的RFLP分析的结果表明,杂种中含有融合双亲的线粒体并且发生了重组。由杂种愈伤组织再生得到白化苗。讨论了紫外线对融合产物的影响。     

混合小麦亲本与新麦草不对称体细胞杂交体系的建立

以小麦品种济南177悬浮细胞系来源的原生质体与同品系胚性愈伤组织制备的原生质体混合后作为受体;以经过380μＷ/ｃｍ²紫外线照射1min、2min的新麦草原生质体分别作为供体,用PEG法诱导融合。组合Ⅰ(176+cha9+新麦草UV 1min)获得16个再生克隆。经过形态学、同工酶、染色体和RAPD分析,确定其全部为属间体细胞杂种。其中的5个克隆再生杂种植株。用7对小麦SSR引物对杂种克隆的叶绿体基因组进行了分析;组合Ⅱ(176+cha9+新麦草UV 2min)只获得3个克隆,且逐渐褐化死亡。表明以小麦济南177的两种培养细胞混合作受体的融合体系有利于杂种的获得及再生;紫外线对融合产物的生长发育有明显的剂量效应。     

普通小麦与簇毛麦对称及不对称体细胞杂交的比较

由长期继代的小麦品种济南177悬浮系制备原生质体为受体,取继代一年的簇毛麦愈伤组织不经照射或经⁶⁰Co-g射线照射,剂量分别为40,60,80Gy(1.3Gy/min),然后分离原生质体为供体,在PEG诱导下分别进行了对称及不对称融合(g融合).经形态学、细胞学、同工酶及5SrDNA间隔序列分析鉴定,对称及不对称融合均高频率地获得了体细胞杂种细胞系,并在对称融合及低剂量g辐照组合得到再生杂种植株.基因组原位杂交的结果证实,对称及不对称融合杂种中异源染色体间不同方式的易位及重组均普遍存在.g辐照存在剂量效应.结果表明:对称及不对称体细胞杂交均可有效地实现核基因的转移与重组,而不对称体细胞杂交还可直接导致染色体小片段易位,显示出此方法在小麦育种上的独特优势.     

沙打旺与苜蓿属间体细胞杂交

以豆科牧草沙打旺为一亲本,碘乙酰胺处理的紫花苜蓿发根农杆菌A_4菌株转化系为另一亲本,通过PEG-高pH,高钙法诱导原生质体融合。在不加外源激素的DPD 培养基上有效地筛选了杂种细胞。经培养首次得到沙打旺( )紫花苜蓿的属间体细胞杂种。尽管双亲原生质体均已丧失分化植株的能力,但杂种细胞系R_1仍得到苗的分化。杂种R_1细胞的染色体数检查、冠瘿碱检测、同工酶和RAPD 分析结果,都证实了其杂种特性。     

沙打旺与苜蓿属间体细胞杂交

以豆科牧草沙打旺为一亲本,碘乙酰胺处理的紫花苜蓿发根农杆菌A4菌株转化系为另一亲本,通过PEG-高pH,高钙法诱导原生质体融合。在不加外源激素的DPD培养基上有效地筛选了杂种细胞。经培养首次得到沙打旺( )紫花苜蓿的属间体细胞杂种。尽管双亲原生质体均已丧失分化植株的能力,但杂种细胞系R1仍得到苗的分化。杂种R1细胞的染色体数检查、冠瘿碱检测、同工酶和RAPD分析结果,都证实了其杂种特性。     

青菜与芥菜花粉－体细胞原生质体融合的研究

以聚乙二醇（ＰＥＧ）为诱导剂,试验用４种方法进行青菜（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）幼嫩花粉原生质体与芥菜（Ｂ．Ｊｕｎｃｅａ）下胚轴原生质体的融合,结果以修改的Ｔｅｒａｄａ等的方法最好。融合后原生质体的培养形成了愈伤组织,但未分化出芽,个别愈伤组织分化了根。用ＲＡＰＤ技术对任选的５个细胞系进行鉴定,发现１个细胞系含双亲的ＤＮＡ片段,可确认是青菜幼嫩花粉原生质体与芥菜下胚轴原生质体融合后产生的杂种细胞系。     

小麦与高冰草不对称体细胞杂种F_5代部分株系的根尖细胞染色体分析

将普通小麦“济南177”(Triticum oestivum cv．Jinan 177)原生质体(受体)和经紫外线照射的高冰草Agropyron elongatum)原生质体(供体)用PEG(聚乙二醇,polyethylene glycol)法诱导融合,获得外形偏向小麦的不对称体细胞杂种及后代。经过田间繁育,现已到F5代。对来源于同一个体细胞杂种克隆的不同株系(Ⅱ-2,8-l,Ⅱ-I-8)的F5代的根尖细胞染色体进行核型分析,并与其亲本比较,结果表明,杂种株系染色体的形态、数目在遗传上均趋于稳定。各杂种株系的染色体与亲本小麦“济南177”之间有多处显著的不同,杂种株系之间也存在差异,推测高冰草的染色体小片段可能进入了受体小麦的染色体中。     

烟草种间的体细胞杂交──Ⅰ．通过原生质体融合将波缘烟草部分核基因组转移给普通烟草

通过“供体──受体”原生质体融合获得５个“波缘烟草＋普通烟草”体细胞杂种细胞系（ＴＵ＿１至ＴＵ＿５）。对５个杂种细胞系的细胞学观察表明,其中２个系为多细胞融合产物,其平均染色体数目分别为１６７．２和１９８．４;３个系为二细胞融合产物,其平均染色体数目分别为５４．３７０．６和６２．８。杂种细胞系的一个明显特征是所有观察的中期细胞均存在数量不等的畸变染色体。对５个杂种细胞系再生植株叶片苹果酸脱氢酶和酯酶的同工酶分析结果表明,它们均为程度不同的不对称核杂种,即只含有供体亲本（波缘烟草）的部分核基因组。以小麦ｒＤＮＡ为探针对杂种细胞系基因组ＤＮＡ的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果表明,杂种中双亲的载有ｒＤＮＡ的染色体可能均有部分消除;此外,杂种中新ＤＮＡ片段的存在说明双亲ｒＤＮＡ可能发生了分子间重组。两个由多细胞融合产生的杂种细胞系（ＴＵ＿２和ＴＵ＿５）再生苗不易生根而且形态上异常。３个由二细胞融合产生的杂种细胞系（ＴＵ＿１、ＴＵ＿３和ＴＵ＿４）再生苗可生根长大,形态上类似受体亲本;对其根尖的细胞学观察表明,染色体数目在５１─６６之间,说明均为只含有少量供体亲本染色体的不对称核杂种。     

花椰菜与黑芥种间体细胞杂种的获得和鉴定

利用非对称体细胞杂交技术,获得芸薹属花椰菜（Brassica oleracea var．botrytis）与黑芥（B．nigra）的种间杂种,实现了野生种质抗病基因向甘蓝类蔬菜作物的渗透。以具有良好再生能力的花椰菜下胚轴原生质体作为融合受体,具有抗黑腐、黑胫和根肿病优良性状的黑芥叶肉原生质体作为融合供体,用不同强度的UV射线处理后,利用PEG方法诱导供、受体原生质体融合。培养后获得170棵再生植株。选取来自40个不同愈伤组织的40棵单株进行形态学观察及RAPD和SRAP分子标记检测,结果表明其中30棵为体细胞杂种。染色体计数显示,约23％杂种植株的染色体数目小于供、受体染色体数之和。用流式细胞仪测定DNA含量显示,杂种植株DNA含量是受体的2—4倍,20％杂种植株DNA含量小于供、受体之和。     

花椰菜与黑芥种间体细胞杂种的获得和鉴定

利用非对称体细胞杂交技术, 获得芸薹属花椰菜(Brassica oleracea var. botrytis)与黑芥(B. nigra)的种间杂种, 实现了野生种质抗病基因向甘蓝类蔬菜作物的渗透。以具有良好再生能力的花椰菜下胚轴原生质体作为融合受体, 具有抗黑腐、黑胫和根肿病优良性状的黑芥叶肉原生质体作为融合供体, 用不同强度的UV射线处理后, 利用PEG方法诱导供、受体原生质体融合。培养后获得170棵再生植株, 选取来自40个不同愈伤组织的40棵单株进行形态学观察及RAPD和SRAP分子标记检测, 结果表明其中30棵为体细胞杂种。染色体计数显示, 约23%杂种植株的染色体数目小于供、受体染色体数之和。用流式细胞仪测定DNA含量显示, 杂种植株DNA含量是受体的2-4倍, 20%杂种植株DNA含量小于供、受体之和。     

小麦与多年生黑麦草原生质体的电融合及杂种愈伤组织的形成

多年生黑麦草(Lolium perenne L.)悬浮培养细胞来源的原生质体和小麦(Triticumaestivum L.)含叶绿体的悬浮培养细胞来源的原生质体间,用直流方波脉冲进行电融合,获得了体细胞杂种愈伤组织。小麦的原生质体经过碘乙酰胺失活。愈伤组织的形态和颜色被用作识别预期杂种的标记。为了对杂种愈伤组织进行同工酶分析,观察了亲本的9种同工酶谱,其中3种在亲本间表现出差异(ADH、GOT 和 SDH)。酒精脱氢酶(ADH)的分析结果表明,有6个细胞系表现出杂种带。这些细胞系经过其他两种同工酶分析和 rDNA 探针杂交试验表明,一个细胞系表现出基本完全的亲本基因组间的组合,其余5个细胞系是部分杂种。     

普通小麦与玉米不对称体细胞杂交的研究

以长期继代培养,经分化实验证明无分化能力的普通小麦（Triticum aestivum L.)济南177原生质体为受体,以经380uW/cm^2紫外线处理的继代第3－5天的墨西哥黑甜玉米（Zea mays L.cv.Sccharina F.Nigera)胚性悬浮组织原生质体为供体,使用PEG的方法诱导融合。融合再生的18个单细胞克隆的愈伤组织经形态学比较、染色体检查、同工酶分析、5S rRNA间隔序列分析,确认克隆1为杂种愈伤组织,杂种愈伤组织再生出来的白化苗未进行杂种鉴定。同时,初步探讨了紫外线对玉米原生质体的影响。