前列腺特异膜抗原在Pichia pastoris酵母中的表达及鉴定

前列腺特异膜抗原是一种具有高度前列腺特异性的糖蛋白 ,其表达的增高与肿瘤的术后复发、激素抵抗及较差的预后正相关 ,在前列腺癌的诊断和治疗中有广泛的应用前景 .从前列腺癌组织提取总RNA ,利用RT PCR技术获得PSMA基因的全长序列 ,构建了重组酵母表达载体pPIC3.5K PSMA .电击法转化Pichiapastoris酵母 ,通过表型筛选和PCR鉴定证实该基因已稳定整合入Pichiapastoris酵母基因组中 .SDS PAGE显示 ,获得的PSMA蛋白分子量约 10 0kD ,表达产物经West ern印迹证实可特异地与PSMA单克隆抗体 4G5结合 .结果表明 ,成功地获得PSMA编码的cDNA并在酵母细胞中获得表达 .     

组织因子膜外区融合蛋白基因的表达及产物的分离纯化与活性分析

 为构建表达组织因子 (TF)膜外区的融合载体 ,制备组织因子膜外区 ,抽提人胎盘组织的总RNA,通过 RT- PCR法扩增出 TF的 c DNA克隆至 p UC1 8并测定全序列 .然后以此为模板 ,再次PCR扩增出 TF膜外区 (soluble TF,s TF) c DNA,并将其插入到谷胱甘肽巯基转移酶融合表达载体 p GEX4T- 1 ,构建了 tac启动子控制下的 GST- s TF融合蛋白的表达载体 .表达的融合蛋白经亲和层析、凝血酶切得到纯化的 s TF.表达产物经 ELISA验证 ,能特异性地与 TF抗体结合 .重新脂化后 ,该产物具有较大凝血活性 .以上说明采用融合蛋白表达系统可以大量制备组织因子膜外区 ,为研制国产重组凝血活酶试剂和研究 s TF的结构和功能创造条件 .     

人早胚发育相关蛋白ZNF268的抗体制备

目的:获得纯化抗原用于制备ZNF268的多克隆抗体。方法:PCR扩增目的基因片Spacer区序列,亚克隆入融合蛋白表达载体pET28a+,构建了重组质粒pET28a+/SPA。然后将该重组质粒转化E.coliDE3(Rosseta),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分离,获纯化融合蛋白6His-SPA。用6His-SPA免疫家兔,颈动脉取血,分离血清,从血清中获得ZNF268特异的多克隆抗体。结论:通过构建融合蛋白重组表达质粒pET28a+/SPA,用获得的初步纯化融合蛋白6His-SPA,制备了特异的ZNF268的多克隆抗体6His-SPA Ab。     

穿膜肽-LacI HPM载体的构建及其DNA结合活性测定

目的：借助穿膜肽TAT高效跨膜的特性和LacI前头肽突变体（LacI HPM）高亲和力结合DNA的特性,构建新型基因转导载体。方法：PCR扩增LacI、Lacl基因前头肽序列、前头肽序列突变体、TAT序列的编码基因,构建前头肽序列突变体和TAT的原核表达载体,可溶性表达TAT-LacI HPM融合蛋白并纯化,在缇冲液中氧化获得TAT-LacI HPM二聚体并浓缩,PCR检测二聚体融合蛋白与质粒的体外结合能力。结果：获得了pET-28a（-4-）-LacI HPM及pET-28a（＋）-TAT-LacI HPM表达质粒,表达纯化并获得二聚化融合蛋白,体外结合实验确定TAT-Lac／HPM二聚体融合蛋白与检测质粒DNA具有特异的高亲和力结合活性。结论：构建了穿膜呔TAT-LacI HPM,为进一步研究其作为新型DNA转运载体的可行性奠定了基础。     

小鼠膜型抗衰老蛋白Klotho基因特异片段的克隆、原核表达及多克隆抗体制备

目的克隆小鼠膜型抗衰老蛋白Klotho基因特异片段,制备小鼠Klotho多克隆抗体。方法以小鼠基因组为模板进行PCR,克隆了小鼠膜型抗衰老蛋白Klotho基因外显子Ⅳ部分序列,经BamH I和Nhe I双酶切后定向克隆到质粒pET-GST中,构建原核表达质粒pET-GST-Klotho,转化大肠埃希菌BL21（DE3）,用IPTG诱导表达。以重组GST-Klotho融合蛋白免疫家兔,制备Klotho多克隆抗体。结果表达产物经SDS-PAGE检测表明,在大肠埃希菌中成功表达了GST-Klotho融合蛋白,GST-Klotho融合蛋白表达量占菌体总蛋白的15％左右;另外通过ELISA法测得抗血清抗体效价约为1：10000,Western印迹分析验证了抗体特异性。结论GST-Klotho融合蛋白的表达和Klotho多克隆抗体的制备为进一步研究Klotho蛋白在小鼠体内的表达模式以及相关抗衰老药物的研制奠定了基础。     

马立克氏病病毒gB部分基因的原核表达

利用PCR技术扩增获得马立克氏病病毒(MDV)囊膜糖蛋白B(gB)基因部分片段,将其克隆入pET-28a载体中,获得表达载体pET-gB,将该载体转化宿主菌BL21,经1.0mmol/LIPTG诱导,外源基因以包涵体的形式获得高效表达。将包涵体溶解于8mol/L的尿素中,利用His·Bind试剂盒获得纯化的蛋白,将纯化的蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,间接ELISA法测得抗体的效价为1×10-5。此外,通过Western blot实验表明,该抗体具有较高的特异性,为进一步探讨MDVgB所引起的特异的免疫反应奠定基础。     

myh6蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

斑马鱼心脏发育模型中,myh6编码是一种促进心室心肌细胞扩张的转录因子。为了进一步研究myh6在心脏发育和心脏疾病发生中的功能,需要获得斑马鱼myh6蛋白并制备其抗体。从斑马鱼心脏组织中提取总RNA,通过反转录得到心脏组织特异表达基因的cDNA,PCR扩增得到myh6部分编码区序列,然后将其连接到pGEx_4T载体上获得原核表达。经酶切及测序鉴定后,转化BL21细菌,并用IPTG诱导表达融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖珠亲和纯化,将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blotting检测抗体的特异性。结果显示,获得了myh6原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗myh6多克隆抗体,为myh6功能的进一步研究提供了有力的工具。     

嗜水气单胞菌外膜蛋白基因ompTS的高效表达及其免疫原性

根据嗜水气单胞菌外膜蛋白基因ompTS的核苷酸序列设计引物,运用聚合酶链式反应（PCR）扩增出与预期大小相符的基因片段。将此基因片段克隆至质粒pRSET A的BamHI和EcoRI位点,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导获得高效表达,SDS－PAGE蛋白电泳表明在39．9kD处出现超强特异带,占总蛋白的51％。以Ni-NTA-Conjugate抗体进行Western blot分析证明该39．9kD的蛋白为所表达的融合蛋白。纯化融合蛋白注射雄性新西兰大白兔可诱导产生特异抗体。ELISA和Western blot检测结果显示,该抗体与表达的融合蛋白和从嗜水气单胞菌中提取的36．9kD外膜蛋白均呈阳性反应,表明所表达的融合蛋白仍保持原有外膜蛋白的免疫原性,为此融合蛋白作为 疫苗的候选成份提供理论基础。     

犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因片段的克隆和表达

目的　构建pMal N重组表达载体 ,转化E .coliDH5α ,诱导表达犬瘟热病毒 (CDV)重组核衣壳 (N)蛋白。方法　采用RT PCR技术 ,从CDVRNA中扩增编码N蛋白的基因片段 ,通过连接反应 ,构建重组克隆载体和重组表达载体 ,转化感受态。E .coliDH5α细胞。通过IPTG诱导表达CDV重组N蛋白。结果　扩增出约 1 7kbCDV全长的主要结构蛋白N蛋白基因 ,通过PCR获得 5 36bpN蛋白基因片段。将N蛋白基因片段克隆入原核表达载体pMal C2 ,表达产物麦芽糖结合蛋白 (MAP)与N蛋白的融合蛋白的相对分子质量约 6 0× 10 3,与预期大小一致。结论　构建的pMal N重组载体所表达的CDVN蛋白为进一步研究CDV的特异、敏感的抗体检测方法打下基础     

NMDAR1蛋白膜外抗原结构域的重组表达、纯化和免疫反应原性鉴定

构建编码NMDAR1蛋白膜外片段的原核表达重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达、纯化并鉴定其免疫反应原性。根据人NMDAR1基因序列,利用Phyre 2软件预测蛋白的三级结构并分析其结构域。设计引物用RT-PCR方法扩增编码NMDAR1膜外蛋白不同结构域的核酸片段,并插入原核表达载体pCold-SUMO构建重组质粒。转化DH5α感受态细胞,菌落PCR鉴定,阳性单克隆进行测序验证。鉴定正确的重组体转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白的表达和纯化,Ni-NTA柱亲和层析和凝胶过滤层析纯化蛋白,酶切切除融合蛋白6His-SUMO标签,用AKTA Purifier进行凝胶过滤层析,收集纯化蛋白。利用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度,并用Western blotting进行免疫反应性鉴定。克隆获得NMDAR1膜外部分的三段DNA序列,分别是NR1-M1(编码19–393 aa)、NR1-S1(编码394–544 aa)和NR1-S2(编码663–800 aa)。其中NR1-S1和NR1-S2片段之间以G(甘氨酸)和T(苏氨酸)作为接头连接成为复合片段。经菌落PCR筛选和测序鉴定,成功构建了重组质粒p Cold-SUMO-M1和p Cold-SUMO-S1-GT-S2。SDS-PAGE鉴定结果表明重组质粒在大肠杆菌中经诱导可表达可溶性NR1-M1及NR1-S1-GT-S2蛋白。对表达产物进行亲和层析和凝胶过滤层析获得了高纯度的目标蛋白。Western blotting证实纯化的目的蛋白能与相应抗体发生特异性结合反应。本研究成功构建了NMDAR1蛋白膜外抗原结构域的原核表达系统,并获得了具有免疫反应性的NR1-M1及NR1-S1-GT-S2纯化蛋白。该蛋白有望用于NMDAR1蛋白的功能研究及自身抗体的检测。     

青鱼生长激素的重组表达及其多克隆抗体的制备

以含有的青鱼生长激素编码区cDNA的重组质粒pbcGHc为模板,高保真PCR扩增青鱼生长激素（GH）成熟肽cDNA序列,定向插入原核表达载体pET-28a,构建青鱼GH原核表达质粒pET-bcGH。将pET-bcGH转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导青鱼GH基因在大肠杆菌中的融合表达,SDS-PAGE凝胶电泳结果显示一条23 kDa的诱导表达重组青鱼GH带。以草鱼GH多克隆抗体为一抗,Western Blot证明,该重组青鱼GH具有免疫学活性。将经过亲和层析、透析纯化后的重组青鱼GH作为抗原,采用改进的方法对家兔进行皮下免疫注射,获得青鱼GH多克隆抗血清。以该多抗为一抗,Western Blot 可以检测出4 ng的抗原量;并且在青鱼垂体组织抽提液中和血清中检测到一种能与该抗血清作用的大小为21 kDa的蛋白质。这些结果表明本研究得到的青鱼GH多克隆抗血清具有较好的免疫特性。     

人GST-AWP1融合蛋白的原核表达及其抗体制备

为进一步研究人的一新蛋白———蛋白激酶C相关激酶 1相关蛋白 (AWP1)的结构、功能及与其相互作用的蛋白而进行GST AWP融合蛋白表达载体的构建、原核表达、纯化及其抗体的制备 .采用逆转录PCR(RT PCR)法从人ECV30 4内皮细胞中扩增AWP1cDNA编码区 ,并将其重组于谷胱甘肽硫转移酶 (GST)融合蛋白表达质粒pGEX KG中 .经酶切、序列鉴定分析后 ,用该重组质粒转化大肠杆菌BL2 1,并经异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导产生GST AWP1融合蛋白 ,继而纯化获得了分子量约 5 6kD的融合蛋白 .将此融合蛋白免疫新西兰兔 ,经ELISA和Western印迹检测获得了效价高、免疫活性强的兔抗人多克隆抗体 .结果表明成功构建了GST AWP1融合蛋白表达载体 ,在大肠杆菌高效表达了GST AWP1融合蛋白 ,并获得高效多抗 ,为下阶段深入AWP1功能研究提供了重要的基础     

GGNBP1抗体制备及小鼠组织表达谱分析

体外实验研究表明配子生成素结合蛋白1(GGNBP1)可能与GGN1相互作用形成睾丸特异性复合物,在精子生成过程中发挥作用.从小鼠睾丸总RNA中反转录扩增Ggnbpl全长cDNA,构建表达质粒,在大肠杆菌中表达GGNBP1,经聚丙烯酰胺凝胶纯化后免疫新西兰白兔,制备兔多抗血清.镍离子金属螯合柱纯化表达的GGNBP1蛋白,与NHS活化基团交联,制备GGNBP1抗体亲和层析柱,纯化GGNBP1多抗.在293FT细胞中瞬时表达Myc-GGNBP1融合蛋白,用于Mvc单抗验证GGNBP1抗体特异性,结果证明获得了特异性的GGNBP1抗体.分别制备小鼠脑、心、肺、肝、脾、肾、肌肉、卵巢、睾丸和子宫组织匀浆,用GGNBP1抗体进行Western印迹分析,结果仅在睾丸组织匀浆中检测到GGNBP1特异性条带,证明GGNBP1是睾丸特异性表达蛋白.     

重组C8orf32蛋白的表达、纯化及抗体制备

C8orf32是一种功能未知基因,其mRNA含量在乳腺癌组织中显著高于正常乳腺组织。将其开放式阅读框插入pGEX-6P1原核表达载体T7启动子控制下的GST编码基因下游,构建了C8orf32蛋白表达质粒pGEX-6P-C8。表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导,成功表达了GST- C8orf32融合蛋白。经带有GST标签的位点特异性蛋白酶切割除去GST-C8orf32融合蛋白的GST标签,获得了N端带有8个多余氨基酸残基的C8orf32蛋白,蛋白纯度为95%左右。N端氨基酸序列分析表明该蛋白N端氨基酸序列正确,质谱鉴定进一步证明所表达C8orf32蛋白的正确性。用制备的C8orf32蛋白免疫新西兰白兔,获得了能够正确识别C8orf32蛋白的抗血清。该蛋白及其抗体的成功制备,为进一步研究C8orf32蛋白的结构功能和体内分布打下了基础。     

拟南芥转录因子NF-YC的原核表达及多克隆抗体制备

采用PCR方法扩增NF-YC基因得到其全长cDNA序列,并将其克隆至原核表达载体pET-48b中,在大肠杆菌BL21中用IPTG诱导出分子量约为45 kD的融合蛋白,SDS-PAGE和Western blotting检测鉴定表达产物。利用亲和层析技术对融合蛋白进行纯化,纯化后的目的蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。间接ELISA检测抗体效价大于1 62 500,Western blotting结果显示,该抗体可特异性识别NF-YC蛋白。     

人接头蛋白NRBP的表达、纯化及多克隆抗体制备

目的:制备接头蛋白NRBP的兔多克隆抗体,并检测该抗体的效价及特异性。方法:PCR方法以重组质粒PEF-NRBP为模板,获得NRBP全长及NRBP(1-99Aa)cDNA,构建到原核表达质粒pET-21a及pGEX-6P-1中。分别转入大肠杆菌BL21菌株,IPTG诱导表达后,纯化并鉴定表达产物将其免疫家兔,间接ELISA法及免疫印迹等方法鉴定抗体。结果:成功获得人NRBP的cDNA,构建得到相关的原核表达质粒,在大肠杆菌中可诱导性高表达,纯化后蛋白免疫家兔制备得到的抗血清经ELISA检测为阳性结果,4只免疫家兔的抗体效价约为1:5 200～1:40 000。Western印迹结果显示,该抗体可特异性的识别真核细胞外源性及内源性约60kDa的NRBP蛋白,并且具有较强免疫沉淀能力。结论:NRBP多克隆抗体具有很好的特异性和敏感性,该抗体的成功制备为进一步研究NRBP的功能提供了重要工具。     

果蝇odd蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备研究

odd是一个新发现的心脏特异表达基因。为了进一步研究odd在心脏发育中的功能,根据已报道的odd基因序列,以果蝇cDNA文库为模板进行PCR扩增,将所得的odd部分编码区序列连接到pET-28a载体上构建原核表达载体;重组子经酶切测序鉴定后,转化到大肠杆菌BL21菌株,IPTG诱导融合蛋白表达,Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,纯化后的His-odd融合蛋白免疫新西兰大白兔以制备多克隆抗体,Western Blot检测抗体活性。结果表明,获得了odd原核表达重组融合蛋白以及高效价的、特异性兔抗Odd多克隆抗体,为后续的odd功能研究奠定了基础。     

果蝇中Ecp蛋白的表达、纯化与抗体制备

获得特异性抗Ecp多克隆抗体,为进一步研究ecp的功能奠定基础。利用特异引物,通过RT-PCR扩增出编码Ecp蛋白的全长cDNA,克隆至谷胱甘肽S转移酶融合蛋白表达载体pGEX-4T-1(His)6C中,转染大肠杆菌DH 5α,经诱导表达后,利用谷胱甘肽琼脂糖珠从细胞裂解物中特异吸附融合蛋白,经凝血酶裂解,释放出Ecp蛋白,再经Ni-NTA亲和层析,最终获得高纯度的Ecp蛋白。用纯化的Ecp蛋白免疫新西兰家兔,亲和层析纯化抗Ecp抗体。利用该抗体进行的Western Blot结果表明：Ecp蛋白在野生型黑腹果蝇胚胎、三龄幼虫神经系统、成虫、成虫头部组织中均有明显表达,提示ecp可能是一个重要的管家基因。     

大鼠RVLG cDNA的克隆、原核表达和小鼠抗RVLG蛋白多克隆抗体的制备

为了识别大鼠卵巢中的生殖细胞,在原核系统中表达和纯化RVLG蛋白并制备了多克隆抗体.采用RT-PCR方法从大鼠睾丸组织中扩增获得RVLG cDNA片段,然后克隆到pMD19-T载体上进行测序,经双酶切回收目的基因片段后,将其插入到原核表达载体pGEX-4T-1上,转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达.纯化后的GST-RVLG融合蛋白免疫昆明(KM)小鼠,最后给小鼠腹腔注射S180细胞制备抗RVLG腹水多克隆抗体.用Western blotting及免疫组织化学法鉴定RVLG腹水多克隆抗体的特异性,间接ELISA法测定该抗体的效价.序列分析表明,所克隆的RVLG cDNA片段比GenBank中报道的大鼠RVLG cDNA(NM_001077647)多60 bp,原因是由于RVLG的可变剪切方式造成的.本研究成功构建了重组表达质粒pGEX-RVLG,且GST-RVLG融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,表达的目的蛋白占菌体总蛋白的10%以上.制备的抗体可特异性识别RVLG蛋白,其效价达1:20 000.获得的高效价、高特异性的小鼠抗RVLG蛋白腹水多克隆抗体为下阶段研究RVLG的特异性表达奠定了基础.