依赖于DNA的RNA聚合酶的研究Ⅱ.615小鼠肝细胞核RNA聚合酶A、B、C的提取、分离和鉴定

本文报道了从615小鼠肝细胞核提取和分离A、B、C三种RNA聚合酶的方法。在80mM硫酸铵离子浓度下,B酶能选择性地吸附在DEAE-纤维素DE52上,从而和A、C酶分开,用500mM硫酸铵洗脱,呈现单一的峰。在50mM硫酸铵离子浓度下,将A、C酶吸附在DEAE-SephadexA25上,经50-500mM硫酸铵线性梯度洗脱,得到A酶和c酶两个峰。测定了这三种酶对α-鹅膏蕈碱的敏感性。A酶是抗α-鹅膏蕈碱的(在最高浓度为200微克/毫升时,酶活完全不受抑制);B酶在α-鹅膏蕈碱浓度为0.2微克/毫升时,活性受到50％以上的抑制;C酶在α-鹅膏蕈碱浓度为100微克/毫升时,活性受到50％以上的抑制。用提取的B酶免疫母鸡,获得了抗B酶的抗血清,这种抗血清在双向免疫扩散实验中和B酶之间产生沉淀反应,而和A酶或C酶之间不产生沉淀反应。     

依赖于DNA的RNA聚合酶的研究 Ⅲ.615小鼠和白血病615小鼠(L615)肝细胞RNA聚合酶B的比较研究

研究了正常的615小鼠和白血病615小鼠(L615)肝细胞的RNA聚合酶B,发现两种肝细胞的RNA聚合酶B都可能存在着结合状态和游离状态的形式。在电泳图中L615 RNA聚合酶B有两条电泳区带是615 RNA聚合酶B所没有的。两种B酶的最适铵离子浓度都是90mM;最适锰离子浓度为2mM;镁离子的激活作用在10mM以下时,酶活性随镁离子浓度增高而增强。两种RNA聚合酶B对α-鹅膏蕈碱的抑制作用都非常敏感,而L615 B酶更敏感一些。两种RNA聚合酶B都适于利用变性的单链DNA作转录模板。     

依赖于DNA的RNA聚合酶与体外转录的研究 Ⅰ.酵母变异株20B-12 RNA聚合酶A和C的纯化及鉴定

从酵母变异株20B-12经过超声波处理、硫酸铵沉淀、DEAE纤维素和磷酸纤维素层析等步骤,纯化依赖于DNA的RNA聚合酶A和C,得到聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的条带。其中不含DNase、RNase 和蛋白酶活力,无内源DNA。测定了 RNA 聚合酶A和C对α-鹅膏荤碱的敏感性。酶A在α-鹅膏荤碱为400μg/ml时,活性受到抑制,而酶C在该浓度时,几乎不受抑制。(NH_4)_2SO_4对酶A的最适浓度为20mM,对酶C有二个最适浓度,分别为40mM和240mM。无二价金属离子Mn~(2+)或Mg~(2+),酶A和C几乎无活力。两种酶最适Mn~(2+)浓度均为2.5mM,Mg~(2+)浓度均为5mM。两种酶以热变性小牛胸腺DNA为模板,测活性均较天然小牛胸腺DNA为模板时高。     

抗-20诱导的三眠家蚕后丝腺RNA聚合酶和RNA的合成

蚕在4龄期开始的48小时连续取食抗-20,4眠家蚕被诱导成3眠蚕并吐丝结茧。根据对α-鹅膏蕈碱的敏感性,放线菌素D的抑制作用,DNA需要以及[~3H]-UMP掺入酸不可溶物,测定了蚕后丝腺的RNA聚合酶Ⅰ和Ⅱ活力。观察到随着抗-20处理后天数的增加,RNA聚合酶在热变性小牛胸腺DNA和内源DNA上转录活性迅速升高,并伴随着RNA合成的迅速增加;而对照组蚕的酶活力和RNA含量仍保持在相当稳定的低水平。     

依赖于DNA的RNA聚合酶与体外转录的研究I．酵母变异株20B-12 RNA聚合酶A和C的纯化及鉴定

从酵母变异株20B一12经过超声波处理、硫酸铵沉淀、DEAE纤维素和磷酸纤维素层析等步骤,纯化依赖于DNA的RNA聚合酶A和C,得到聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的条带。其中不含Dnase、Rnas：和蛋白酶活力,无内源．DNA。测定了RNA聚合酶A和c对弘鹅膏蕈碱的敏感性。酶A在a-鹅膏荤碱为400μg／ml时,活性受到抑制,而酶c在该浓度时,几乎不受抑制。(NH4)zSO4对酶A的最适浓度为20mM,对酶C有二个最适浓度,分别为40raM和240raM。无二价金属离子Mn+或Mg2+,酶A和c几乎无活力。两种酶最适Mn2+浓度均为2.5mM,Mg2+浓度均为5mM。两种酶以热变性小牛胸腺DNA为模板,测活性均较天然小牛胸腺DNA为模板时高。     

抗-20诱导的三眠家蚕后丝腺RNA聚合酶和RNA的合成

蚕在4龄期开始的48小时连续取食抗-20,4眠家蚕被诱导成3眠蚕并吐丝结茧.根据对α-鹅膏蕈碱的敏感性,放线菌素D的抑制作用,DNA需要以及[³H]-UMP掺入酸不可溶物,测定了蚕后丝腺的RNA聚合酶Ⅰ和Ⅱ活力.观察到随着抗-20处理后天数的增加,RNA聚合酶在热变性小牛胸腺DNA和内源DNA上转录活性迅速升高,并伴随着RNA合成的迅速增加;而对照组蚕的酶活力和RNA含量仍保持在相当稳定的低水平.     

依赖于DNA的RNA聚合酶与体外转录的研究II．酵母变异株20B一12RNA聚合酶B的纯化及鉴定

从酵母变异株20B—12经过超声波处理,硫酸铵沉淀、DEAE纤维素、磷酸纤维素和DEAE-Sephadex 层析等步骤,纯化依赖于DNA的RNA聚合酶B,在聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈二条有聚合酶B活力的区带。其中不合有Dnase、Rnasc和蛋白酶活力,无内源DNAo50μg/ml 的a-鹅膏华碱抑制聚合酶活力达90％以上。最适(NH4),SO4．浓度为40mM。最适 Mn2+浓度为2mM。 Mg2+对酶B无激活作用。变性DNA对酶B较天然DNA有更高的效率。     

依赖于DNA的RNA聚合酶研究 VII.玉米胚RNA聚合酶B性质的研究

真核细胞的RNA聚合酶的研究已经有很 多报道〔3,41。但是以高等植物为材料研究RNA 聚合酶远不如其他真核生物多，在植物细胞中 RNA聚合酶B（或11）的含量比RNA聚合酶A 和C要丰富，而且性质也比较稳定IS]，这对研究 RNA聚合酶B的性质和它在结构基因表达中 的作用是很有利的。我们以玉米自交系黄早4 为材料，提取了RNA聚合酶B。本文将报道植 物RNA聚合酶B的分离和纯化，并研究这种酶 的性质和功能。     

依赖于DNA的RNA聚合酶与体外转录的研究——Ⅱ.酵母变异株20B-12 RNA聚合酶B的纯化及鉴定

从酵母变异株20B-12经过超声波处理、硫酸铵沉淀、DEAE纤维素、磷酸纤维素和DEAE-Sephadex层析等步骤,纯化依赖于DNA的RNA聚合酶B,在聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈二条有聚合酶B活力的区带。其中不含有DNase、RNase和蛋白酶活力,无内源DNA。50μg/ml的α-鹅膏蕈碱抑制聚合酶活力达90％以上。最适(NH_4)_2SO_4浓度为40mM。最适Mn~(2 )浓度为2mM。Mg~(2 )对酶B无激活作用。变性DNA对酶B较天然DNA有更高的效率。     

小麦芽依赖于DNA的RNA聚合酶Ⅱ不能转录绒毛烟斑驳病毒及其拟病毒

小麦芽经过匀浆、沉淀、高速及超速离心、透析以及DE_(52)离子交换层析等步骤,纯化小麦芽依赖于DNA的RNA聚合酶。用α-鹅膏蕈碱抑制试验,证明得到RNA聚合酶Ⅱ。用此聚合酶Ⅱ组建的体外转录体系的研究结果表明,绒毛烟斑驳病毒的拟病毒和卫星RNA(黄瓜花叶病毒相关RNA_3)都不能利用该体系进行转录,类病毒PSTV可进行转录,但转录效率明显低于小牛胸腺DNA;α-鹅膏簟碱可抑制类病毒的转录。绒毛烟斑驳病毒拟病毒和卫星RNA都不能被转录,表明他们的复制方法与类病毒不同。     

HL-60细胞内DNA甲基化作用与RNA聚合酶活力的关系

以 S-腺苷酰 - L-甲硫氨酸 ( SAM)为诱导物 ,在 1 0 μmol/L最佳浓度下可诱导 HL- 60细胞分化达 1 6%左右 .HPLC测定结果证明 ,诱导物处理后 HL- 60细胞 DNA甲基化水平升高 .通过 3 H-UTP同位素参入法 ,测定了不同处理时间和不同浓度 SAM对 HL- 60细胞 DNA模板体外转录活性的影响 ,发现体外活力下降 .比较了不同浓度α-鹅膏蕈碱存在下 RNA聚合酶活力的变化 ,结果表明 SAM处理后细胞中不同 RNA转录产物所占份额改变     

鹅膏毒肽与RNA聚合酶II相互作用的分子机制研究

研究鹅膏毒肽与RNA聚合酶II相互作用的分子机制,利用分子对接方法获得了9种鹅膏毒肽与RNA聚合酶II相互作用的结合模式、结合位点、对接能和抑制常数等信息,并对鹅膏毒肽的毒性与结构间的构效关系进行了考察。结果表明：利用分子对接方法获得的鹅膏毒肽与RNA聚合酶II相互作用的信息与实验结果相一致;不同R2取代基引起毒素与聚合酶II结合能力强弱不同,从而导致鹅膏毒肽分子间的毒性差异。结果证实了运用分子对接方法探索多肽分子与蛋白质相互作用的可行性,为在分子水平上研究多肽与蛋白质的相互作用开拓了新的思路。     

a-鹅膏蕈碱对绒毛烟斑驳病毒及其拟病毒复制的影响

在接种了绒毛烟斑驳病毒(VTMoV)的原生质体培养物中加入50μg／ml的a-鹅膏蕈碱和10μCi／ml的3H-尿嘧啶核苷,培养72小时后,从感病的原生质体内提取核酸,然后对核酸进行凝腔电泳分析并测定’H一放射活性,以此探讨a鹅膏蕈碱对绒毛烟斑驳病毒壳内拟病毒RN^复制的作用。结果表明,拟病毒RNA的复制不受该抑制剂的影响。用酶联免疫吸附分析法(E LJsA)测定从感病的原生质体内提取的病毒颗粒,表明a一鹅膏蕈碱对绒毛烟斑驳病毒的复制无影响。本文还对拟病毒RNA的复制机制进行了探讨。     

绿豆子叶脱分化过程中RNA聚合酶的制备、特性及其活性的研究

绿豆(Phaseolus vadiatus L.)子叶切段在脱分化形成愈伤组织过程中,制备的染色质具有较高的RNA聚合酶活力;3天愈伤组绢的酶活力高于5天和7天的;3天、5天和7天加激素脱柱依次分分化形成的愈伤组织,其酶活力均比不脱分化的高一倍以上;用DEAE-纤维素酶部,依据层析洗脱性质和层析图谱及对α-鹅膏菌素的敏感程度,证明三个峰是RNA聚合Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。     

绿豆子叶脱分化过程中RNA聚合酶的制备、特性及其活性的研究

绿豆(Phaseolus vadiatus L.)子叶切段在脱分化形成愈伤组织过程中,制备的染色质具有较高的RNA聚合酶活力,3天愈伤组织的酶活力高于5天和7天的;3天、5天和7天加激素脱柱依次分分化形成的愈伤组织,其酶活力均比不脱分化的高一倍以上, 用DEAE —纤维素酶部,依据层析洗脱性质和层析图谱及对d—鹅膏菌素的敏感程度,证明三个峰是RNA聚合I,II和III。     

大肠杆菌中依赖于DNA的RNA聚合酶的提取

在细菌和其他动植物细胞中都普遍存在着一种以DNA作为模板,利用四种核糖核苷三磷酸作为底物来合成RNA的酶,这种酶叫做依赖于DNA的RNA聚合酶[E.C.2.7.7.6]。从细菌中提取这种酶的方法不少,但以Cham-berlin和Berg以及Burgess的方法使用最为普遍。我们主要参照Burgess氏的方法以大肠杆菌K12(E.coli K 12)中提取RNA聚合酶,并稍加改变。     

南瓜花粉萌发期间蛋白质含量及合成活力的变化

南瓜（Cucurbita moschata Duch.)花粉离体萌发过程中,由于壁蛋白及细胞质中部分蛋白质的释放,蛋白质含量有所下降,萌发过程中具有RNA及蛋白质合成活力,RNA合成活力随培养时间延长而下降,其大部分的合成活力可被α－鹅膏蕈碱所抑制。蛋白质的合成量随萌发时间延长而增长,合成活力几乎完全被亚胺环己酮抑制,为α－鹅膏蕈碱部分抑制,说明贮藏mRNA与新合成mRNA共同指导蛋白质的新合成,离体条件下,亚胺环己酮和α－鹅膏蕈碱抑制花粉管的生长,在整体条件下,亚胺环己酮抑制花粉萌发与花粉管生长,说明蛋白质和RNA的新合成对花粉管的持续生长是必需的。     

南瓜花粉萌发期间蛋白质含量及合成活力的变化

南瓜（Cucurbita moschata Duch.)花粉离体萌发过程中,由于壁蛋白及细胞质中部分蛋白质的释放,蛋白质含量有所下降,萌发过程中具有RNA及蛋白质合成活力,RNA合成活力随培养时间延长而下降,其大部分的合成活力可被α－鹅膏蕈碱所抑制。蛋白质的合成量随萌发时间延长而增长,合成活力几乎完全被亚胺环己酮抑制,为α－鹅膏蕈碱部分抑制,说明贮藏mRNA与新合成mRNA共同指导蛋白质的新合成,离体条件下,亚胺环己酮和α－鹅膏蕈碱抑制花粉管的生长,在整体条件下,亚胺环己酮抑制花粉萌发与花粉管生长,说明蛋白质和RNA的新合成对花粉管的持续生长是必需的。     

α-鹅膏毒肽与真核生物RNA聚合酶Ⅱ相互作用研究进展

鹅膏毒肽是我国蘑菇中毒事件中致死率最高的蘑菇毒素。鹅膏毒肽引起机体中毒的主要机制为鹅膏毒肽与真核生物RNA聚合酶Ⅱ (RNAP Ⅱ)特异性结合并抑制mRNA形成。本文系统整理了有关α-鹅膏毒肽与真核生物RNAP Ⅱ相互作用的国内外研究进展。由于同一时代各领域对该主题有不同研究角度,研究进展既有平行也有交叉,因此,本文将鹅膏毒肽与真核生物RNAP Ⅱ相互作用的110多年研究史(1907-至今)分为8个阶段,包括(1) 鹅膏毒肽的早期研究、(2) 化学结构解析、(3) 毒理学研究、(4) 构-效关系研究、(5) 生物化学研究、(6) 分子生物学研究、(7) 结构生物学研究和(8) 药物开发与评价。本文按以上顺序,分主题论述α-鹅膏毒肽与真核生物RNAP Ⅱ相互作用的研究历程和重要研究结果,以期给中毒和临床毒理学等领域带来新的思考。     

烟叶中依赖于RNA的RNA聚合酶的部分提纯及其合成产物的性质

从烟叶无细胞匀浆液的20,000xg沉淀中用含30mM EDTA无Mg2+的悬浮液溶解出依赖于RNA的RNA聚合酶,再用聚乙二醇一葡聚糖双相分离法除去内源RNA,从而获得无内源模板的依赖于RNA的RNA聚合酶。此酶合成RNA绝对依赖于外加的RNA模板,需要四种核糖核苷三磷酸、酶活性可被焦磷酸盐抑制而不被磷酸盐抑制。酶活性不受放线菌素D(AMD)和利福平的抑制。以TMV RNA为模板,该酶催化的合成产物为分子量相当于168的双链RNA和分子量相当于tRNA的单链RNA,90％以上的RNA产物是互补于模板的负链。从感染TMV的烟叶提取的酶(IE)和健康烟叶提取的酶(HE)在性质上无明显差别。对此酶在病毒RNA复制中的作用也进行了初步探讨。