犬细小病毒血凝的检测和血凝抑制试验方法的优化

目的优化血凝和血凝抑制（HA／HI）试验条件,提高HA／HI试验的稳定性和准确性。方法在不同的缓冲液、pH值、猪红细胞浓度、BSA浓度下进行HA／HI试验,选择合适的HA／HI条件。结果pH7．0、0．1％BSA、0．2mol／LPBS、1％猪红细胞可作为HA／HI试验合适的反应条件,猪血球可保存12d不影响试验结果。结论方法优化后稳定性增强、检测时间缩短、准确性提高。     

表达犬细小病毒VP2蛋白重组犬2型腺病毒的构建及鉴定

对CAV-2的E3区的Ssp I片段进行缺失构建了E3区缺失载体pVAXΔE3,然后将CPV VP2表达盒连接到pVAXΔE3的E3区缺失处,构建了CPV VP2表达盒的转移载体pΔECPV-VP2,用SalI NruI分别对pPoly2-CAV2和pΔECPV-VP2进行双酶切,分别进行琼脂糖凝胶电泳回收目的片段,将含CPV VP2表达盒的SalI NruI片段定向克隆入pPoly2-CAV-2载体,获得了含CPV VP2表达盒重组CAV-2基因组的质粒pCAV-2/CPV-VP2。用AscI ClaI对pCAV-2/CPV-VP2进行双酶切,释放CAV-2/CPV-VP2重组基因组,将CAV-2/CPV-VP2基因组与去除SalI NruI片段的CAV-2基因组的两个片段混合,利用脂质体介导共转染DK细胞,出现病变,获得重组病毒CAV-2/CPV。并且,从形态学、基因组水平、目的基因的转录及重组病毒的生长特征等方面进行了鉴定。结果证明,CAV-2/CPV具有典型的CAV-2形态特征,CAV-2/CPV在繁殖的过程中没有对CPV VP2表达盒片段进行缺失或重排,并且能够转录CPV VP2的mRNA。CAV-2/CPV的繁殖速度比野生型CAV-2的繁殖速度慢。     

犬冠状病毒S糖蛋白基因重组犬2型腺病毒的构建及其免疫原性研究

首次构建了能表达犬冠状病毒纤突糖蛋白(CCVS1)的重组犬2型腺病毒(CAV-2)。用RT-PCR方法从CCVDXMV株细胞培养物中扩增出编码S糖蛋白A、B、C和D4个抗原位点的基因片段S1,将其克隆到pVAX1中,然后将含有CCVS1基因的完整表达盒(CMV-S1-PolyA)进一步定向克隆到含有CAV-2E3区的穿梭质粒pVAXE3中,构建出pVAX△E3S1。通过SalⅠ NruⅠ双酶切pVAX△E3S1回收含有目的基因的表达盒,将其克隆入含有CAV-2全基因组的骨架质粒pPoly2-CAV-2中,获得重组质粒pCAV-2-CCV-S1。ClaⅠ AscⅠ酶切pCAV-2-CCV-S1释放重组基因组,转染MDCK细胞,获得了重组病毒CAV-2-S1。该重组病毒在MDCK细胞上能产生典型的腺病毒细胞病变。通过mRNA水平和Westernblot检测,证实重组病毒能表达CCVS1蛋白。动物免疫试验表明,该重组病毒可以有效地诱导免疫犬产生抗CCV和CAV-2抗体。     

益母草注射液小鼠急性毒性和Beagle犬重复给药毒性试验研究

通过小鼠单次给药急性毒性试验和Beagle犬重复给药毒性试验,评价益母草注射液(YMC)的安全性。用半数致死剂量法对小鼠进行急性毒性试验,观察小鼠的死亡情况和急性毒性症状,用Bills法计算半致死剂量(LD50)。将32只Beagle犬根据体质量、性别随机分为YMC 240.99 mg·kg~(-1)、120.50 mg·kg~(-1)、60.25 mg·kg~(-1)组和0.9%氯化钠注射液对照组,每组8只。静脉滴注给药,每周给药6 d,连续180 d,停药恢复30 d。对Beagle犬进行临床症状、体质量、心电图、血液学、血液生化学、血清电解质、尿液及组织病理学等检查。YMC小鼠静脉给药LD50为845.64 mg·kg~(-1),急性毒性症状主要表现为跳跃、烦躁、嗜睡、活动减少、阵挛性抽搐、眼球突出、尿失禁。重复给药毒性试验,Beagle犬出现呈剂量反应趋势的流涎、呕吐症状,未见肝、肾毒性,其余各项检测指标也均未见与药物毒性相关的明显异常。YMC小鼠静脉给药LD50相当于临床拟用剂量的394.6倍,YMC重复给药毒性试验对Beagle犬的安全剂量为120.50 mg·kg~(-1),相当于临床拟用剂量的56.2倍。提示YMC具有较高的安全性。     

表达狂犬病毒糖蛋白抗原的重组犬2型腺病毒的构建及鉴定

为研制一种预防犬科动物狂犬病的新型疫苗,将含有狂犬病毒ERA株糖蛋白基因(Rabies glycoprotein,Rgp)表达盒的穿梭质粒pVAXΔE3Rgp中的Rgp表达盒克隆入犬2型腺病毒(Canine adenovirus type2,CAV2)骨架质粒pPoly2-CAV2中,获得重组质粒pPoly2-CAV2-ΔE3-Rgp,释放其基因组,转染MDCK细胞系,获得E3缺失区(Deletion of early protein3,ΔE3)含有Rgp表达盒的重组病毒CAV2-ΔE3-Rgp。该重组病毒能在MDCK细胞上产生典型的腺病毒细胞病变。通过酶切、PCR、基因测序,表明该重组病毒含有完整的Rgp表达盒。通过RT-PCR、Western blot等检测,表明该重组病毒能够表达Rgp抗原。用该重组病毒免疫犬,3次免疫后,可以诱导犬产生特异的抗CAV2HI抗体,其效价超过1∶256和抗狂犬病病毒(Rabies virus,RV)中和抗体,其效价超过0.50IU/mL。试验结果表明,获得的重组病毒免疫犬后,能够产生抗狂犬病毒和腺病毒的高效价保护性抗体,是一种有潜力的犬科动物狂犬病毒腺病毒二联疫苗候选株。     

正常麻醉犬动脉血和脑脊液酸碱及电解质值

２０条正常麻醉犬经股动脉插管和枕骨下经皮穿刺在严格隔绝空气情况下，分别取得动脉血和脑脊液（ＣＳＦ）样本，用ＩＬ－１３０３型血气分析仪和Ｂｅｃｋｍａｎ－７００型生化分析仪检测酸碱变量及电解质。通过酶反应分光光度法检测乳酸（Ｌａｃｔ）。应用（Ｎａ＋＋Ｋ＋）－（Ｃｌ－＋Ｌａｃｔ＋ＨＣＯ３－）公式计算阴离子隙（ＡＧ）。经统计学处理结果表明ＣＳＦＰＨ、Ｋ＋、ＡＧ＜动脉血（ｐ＜０．０１）；ＣＳＦＰＣＯ２、ＨＣＯ３－、Ｃｌ－、Ｌａｃｔ＞动脉血（ｐ＜０．０１）；ＣＳＦＮａ＋同动脉血比较无明显差异（ｐ＞０．０５）。     

宠物犬和猫流感病毒感染

近十年来犬和猫流感病毒感染报道迅速增多,不仅威胁到犬和猫的健康,也对公共卫生造成了影响。自2004年首次发生H3N8亚型流感病毒感染赛犬事件以来,犬流感一直在美国的赛犬和宠物犬中流行。在韩国和我国南方的犬群中出现了因H3N2亚型禽流感感染引起的肺炎病例。亚洲和欧洲均报道了猫H5N1亚型高致病性禽流感致死性感染病例,还通过实验研究发现H5N1亚型流感病毒可在猫与猫之间水平传播。这些现象预示着流感病毒进一步获得了感染哺乳动物的能力,其公共卫生意义需引起关注。为此,本文对犬和猫流感病毒感染的流行病学、临床症状、发病机制、诊断和防控措施进行了综述。     

痢疾杆菌菌型分布和药物敏感试验

细菌性痢疾是我市夏秋季多发病和常见的肠道传染病,了解痢疾杆菌菌型的分布和痢疾杆菌对常用药物敏感度,对于流行病学的调查,特殊预防,以及临床治疗方面,具有重大意义,同时为我市今后使用痢疾杆菌菌苗提供了可靠依据,现将试验结果介绍如下:     

犬2型腺病毒E3区表达载体的构建

利用构建的犬2型腺病毒E3区缺失质粒pBE3L分别构建了含有和不含外源性启动子的绿色荧光蛋白（GFP）基因和在犬病病毒糖蛋白（Rgp）基因的重组表达质粒pBE3LGFP、pBE3LCGFP、pBE3LRgp和pBE3LCPgp,并分别对DK细胞进行了转染实验,以检测其表达,结果显示,pBE3LCGFP质粒在转染DK细胞后,于36h即可观察到荧光,72～96h无明显差别,传3代后仍可见表达荧光的细胞,pBE3LCRgp质粒转染DK细胞后,于48～96h用间接免疫荧光染色可检测到糖蛋白的表达,而pBE3LGFP和pBE3Rgp质粒转染DK细胞后经检测均无表达,表明构建的E3区缺失性载体不能利用E3区自身的启动子进行目的基因的表达,但利用外源性的启动子可使外源基因获得良好表达。     

对犬心丝虫病的一点认识

2000年我们购家犬50只供实验用。饲养中部分犬出现食欲不佳、胃肠功能紊乱、精神烦躁、呼吸异常等临床症状,并伴有心电图异常,甚至死亡。经解剖观察,在右心室内发现有犬恶丝虫。我们重点观察了犬心丝虫病的症状,结合系统尸体解剖,获得一些体会,供同行参考。1 动物来源农村家犬50只,收购于四川省简阳市农村。这些犬为村民散养,伺养环境一般,外观健康,年龄1～3岁以上,体重7～13kg,雌雄各半。2 临床症状及解剖观察     

犬2型腺病毒通用载体的构建及鉴定

为了获得能够携带较大外源基因的犬2型腺病毒E3区缺失性载体,以犬2型腺病毒全基因组质粒pPolyⅡ-CAV-2及E3区重组质粒pVAX-E3为基础,缺失1381bp的E3区片段(92.6%的E3区全序列),插入Linker-NF(内含NotⅠ、ClaⅠ、FseⅠ多克隆位点),获得重组载体质粒pPolyⅡ-CAV-2-ΔE3（NF）(31.9kb)。以AscⅠ和PmeⅠ双酶切,游离重组基因组,在脂质体Lipofectamine^TM 2000介导下,转染MDCK细胞系,获得了E3区缺失的重组病毒CAV-2-ΔE3（NF）。通过病毒的形态学观察,血凝性、生长特性、感染性实验证明,该重组病毒与母源病毒没有差异。重组病毒CAV-2-ΔE3（NF）可以作为载体表达外源基因,其外源基因插入片段不小于3.3kb。     

犬流感病毒起源进化和宿主适应性机制研究进展

甲型流感病毒的跨宿主传播一直是流感病毒研究的主要方向之一.犬作为人类主要的伴侣动物,其呼吸道组织也同时具有α-2,3禽流感病毒受体和α-2,6人流感病毒受体,是潜在的产生新型重配流感病毒的"基因混合器",在流感病毒的流行和跨宿主传播中扮演着重要角色.近年来,犬流感病毒已经在东南亚和美国等国家地区呈地区性流行,而且从犬中分离到了犬流感病毒与人流感病毒的重配株,因此犬流感病毒对公共卫生健康的潜在威胁不容忽视.本文将对犬流感病毒的流行、起源进化以及宿主适应性和致病性相关的分子机制进行综述,旨在为犬流感的防控和甲型流感病毒跨宿主传播研究提供参考.     

犬2型腺病毒通用载体的构建及鉴定

为了获得能够携带较大外源基因的犬2型腺病毒E3区缺失性载体,以犬2型腺病毒全基因组质粒pPolyⅡ-CAV-2及E3区重组质粒pVAX-E3为基础,缺失1381bp的E3区片段(92.6%的E3区全序列),插入Linker-NF(内含NotⅠ、ClaⅠ、FseⅠ多克隆位点),获得重组载体质粒pPolyⅡ-CAV-2-ΔE3(NF)(31.9kb)。以AscⅠ和PmeⅠ双酶切,游离重组基因组,在脂质体LipofectamineTM2000介导下,转染MDCK细胞系,获得了E3区缺失的重组病毒CAV-2-ΔE3(NF)。通过病毒的形态学观察,血凝性、生长特性、感染性实验证明,该重组病毒与母源病毒没有差异。重组病毒CAV-2-ΔE3(NF)可以作为载体表达外源基因,其外源基因插入片段不小于3.3kb。     

表达狂犬病病毒糖蛋白的重组犬2型腺病毒的构建

本试验以犬2型腺病毒全基因组重组质粒pPolyⅡCAV 2及其E3 区重组质粒pVAX E3 为基础,通过DraⅢ和SspⅠ双酶切,缺失第25097bp 26141bp共1044bp的E3区片段,按与编码链相同转录方向插入由CMV启动子、狂犬病病毒SRV9 株糖蛋白基因、SV40 polyA基因构成的总长2424bp的表达盒,获得重组基因组质粒pPolyⅡCAV 2 CGS(34.7kb)。以AscⅠ和ClaⅠ双酶切,游离重组基因组(32.7kb),在脂质体LipofectamineTM 2000 介导下,转染MDCK细胞系,获得了E3 缺失区携带狂犬病病毒糖蛋白表达盒的重组犬2 型腺病毒CAV 2 CGS。Western印迹试验表明,CAV 2 CGS表达了狂犬病病毒糖蛋白。初步接种试验显示,重组病毒可以诱导犬产生狂犬病病毒特异性抗体。