来源于红球菌胆固醇氧化酶ChOG的异源表达、纯化及催化反应结构分析

胆固醇氧化酶是胆固醇代谢过程中的关键酶,临床上用胆固醇氧化酶作为检测血清胆固醇含量的应用潜力巨大。将来源于红球菌Rhodococcus ruber的胆固醇氧化酶Ch OG,分别转化到大肠杆菌宿主BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中,在不同条件下进行诱导表达,结果表明:BL21(DE3)菌株在诱导温度为16℃、IPTG浓度为0.1 mmol/L时,Ch OG可溶性表达量最高(0.49 mg/ml)。Ch OG的最适反应温度为30℃,最适反应p H为7.5。最适反应条件下,酶活性达到8.0 U/mg。利用TLC、HPLC对Ch OG催化产物胆甾-4-烯-3-酮进行了鉴定分析。三维结构及定点突变分析表明Glu406及Arg408、Glu261在进行胆固醇C3羟基的脱氢、质子传递,以及底物异构化方面发挥着重要作用。     

一种胆固醇氧化酶高产菌株筛选方法的建立

用亚硝基胍(1 mg/mL)与超声波(200 W, 50 kHz)复合诱变的方法, 对产胆固醇氧化酶短杆菌Brevibacterium sp. DGCDC-82进行诱变处理, 得到一株桔红色突变株其产胆固醇氧化酶能力提高140%, 酶活达到1.24 U/mL, 又用同样的方法对桔红色突变株进行回复突变处理, 得到一株白色回复突变株和一株淡粉色回复突变株, 两株回复突变株产胆固醇氧化酶的能力又明显下降, 酶活分别为0.17 U/mL和0.69 U/mL。说明短杆菌Brevibacterium sp.产胆固醇氧化酶能力与其产红色素成正相关偶联关系, 这种相关性模型的建立可以作为以后诱变或定向进化研究的筛子。     

一种胆固醇氧化酶高产菌株筛选方法的建立

用亚硝基胍(1 mg.mL)与超声波(200 W,50 kHz)复合诱变的方法,对产胆固醇氧化酶短杆菌 Brevibacterium sp.DGCDC-82 进行诱变处理.得到一株桔红色突变株其产胆固醇氧化酶能力提高140%,酶活达到1.24 U/mL,又用同样的方法对桔红色突变株进行回复突变处理,得到一株白色回复突变株和一株淡粉色回复突变株,两株回复突变株产胆固醇氧化酶的能力又明显下降,酶活分别为0.17 U/mL和0.69 U/mL.说明短杆茵 Brevibacterium sp.产胆固醇氧化酶能力与其产红色素成正相关偶联关系,这种相关性模型的建立可以作为以后诱变或定向进化研究的筛子.     

降胆固醇活性花生多肽制备工艺的研究

以冷榨花生粕为原料,酶解制备具有降胆固醇活性的花生多肽。以体外结合胆酸盐的能力为指标,考察了酶的种类、温度、pH值、加酶量、酶解时间等因素对花生多肽降胆固醇活性的影响,确定最优蛋白酶为木瓜蛋白酶,通过正交试验的方法,确定了酶解花生粕制备降胆固醇活性花生多肽的最佳工艺条件为：温度50℃、pH 7.0、加酶量4 000 U/g底物、酶解时间4 h。     

拟南芥Antiquitin基因的原核表达和生物信息学分析

将拟南芥Antiquitin基因重组到原核表达载体pMAL-c4x和pET41中,在T7 Express菌株中诱导表达,经Amylose和Ni-NTA亲和层析柱纯化获得重组蛋白.SDS-PAGE结果表明:MBP和His-tag融合的拟南芥Antiquitin主要以可溶性形式存在,表达量分别占细胞总蛋白的25.1%和39.4%.以乙醛和NAD~+为底物测定融合蛋白活性,结果显示:His-tag融合的Antiquitin具有醛脱氢酶活性,比活力为8.98 U/mg,乙醛的表观K_m和V_(max)值分别为0.98 mmol/L和12.75 U/mg.序列比对和结构预测结果显示:拟南芥Antiquitin包含该家族蛋白典型的催化结构域、NADH结合结构域和寡聚化结构域,活性中心残基为Gly238、Gly291、Glu391、Phe393.     

高密度培养重组大肠杆菌发酵生产胆固醇氧化酶的策略

以重组大肠杆菌发酵生产胆固醇氧化酶,依据溶解氧的变化控制底物的流加速率,实现了重组大肠杆菌的高密度培养,最高密度达85（OD600）。在此基础上确定了最佳的诱导时机为发酵中期,菌体产酶水平达5830．6tJ／L,产酶速率为971．77U·L^-1·h^-1,生产强度为388．71U·L^-1·h^-1,实现了胆固醇氧化酶的高效生产。     

重组腺相关病毒载体介导的apoA—I和／或LCAT在肌源性细胞中的表达

卵磷脂胆固醇酰基转移酶 (lecithincholesterolacyltransferase,LCAT)是产生血浆中大部分胆固醇酯 (CE)的主要酶 ,并且是胆固醇逆转运 (reversecholesteroltransfer,RCT)中的一个关键因子。将含有人apoA I和 /或LCATcDNA的rAAVAIL/rAAVL表达载体与 pDG质粒经磷酸钙共沉淀法转导入 2 93T细胞中 ,包装为重组腺辅助病毒 (rAAV) ;以Iodixanol密度梯度离心 ,继以肝素亲和层析等方法分离、纯化及浓缩rAAV ;斑点杂交鉴定制备的rAAV颗粒数达 7× 10 14 个 /L(rAAVAIL)和 1× 10 14 个 /L(rAAVL)。以rAAVAIL/rAAVL转染小鼠肌源性细胞C2C12 ,经ELISA、Western印迹和 [3 H] 胆固醇标记底物的放射化学方法结果分别表明 ,apoA I、LCAT在转染细胞中持续 30天表达 ;分化为多核的肌管细胞后 ,仍保持这种表达能力。PCR结果表明 ,目的基因已整合入细胞基因组。以rAAV为载体 ,能有效介导人LCAT、apoA I基因在肌源性细胞中表达 ,并分泌至细胞外     

芫根提取物对高血脂症大鼠调节作用的初步研究

为了探讨芫根的降血脂功效,分别用剂量为400 mg/kg·d、800 mg/kg·d、1600 mg/kg·d的芫根95%乙醇提取物(EE95)和芫根醇沉水提物(WE)连续灌胃营养型高血脂症模型SD大鼠,检测各组大鼠血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平及肝脏系数.结果表明:芫根具有辅助降血脂的功效,与高脂模型组比较,EE95和WE各剂量组均能不同程度地降低TC、TG、LDL-C水平,HDL-C则不同程度高于高脂模型组;EE95高剂量组能降低血清中LDL-C的含量.EE95和WE对大鼠的肝脏系数均无显著影响.     

胆固醇致人血管内皮细胞DNA损伤

本文研究胆固醇是否通过氧化应激机制损伤人内皮细胞DNA.实验用125 mg/L, 25 mg/L, 50 mg/L胆固醇作用于人内皮细胞12 h,用免疫荧光法观察到不同浓度的胆固醇均可诱导细胞内γH2AX形成焦点,随着胆固醇浓度的增加,γH2AX焦点的荧光强度也逐渐增强.利用Western印迹及流式细胞术检测到细胞内γH2AX的量和ROS水平也随胆固醇浓度增大而增加.彗星电泳实验检测到细胞内拖尾DNA量随胆固醇浓度逐渐增加,DNA损伤加重.用抗氧化剂10 mmol/L N 乙酰半胱氨酸(NAC)预作用细胞1 h后,再用50 mg/L胆固醇作用细胞12 h,细胞内γH2AX焦点的荧光强度明显减弱,γH2AX量减少,ROS的水平下降.结果表明,胆固醇可诱导人脐静脉内皮细胞中ROS升高,导致DNA损伤.     

胸腺腺苷脱氨酶免疫亲和纯化和性质研究

用免疫亲和层析结合常规生化方法从人胸腺中纯化腺苷脱氨酶达电泳纯, 比活力14898U/mg, 得率34.15%.该酶分子质量为41.3ku, 约由380个氨基酸残基构成, 等电点为4.9, 最适温度37～40℃, 最适pH为7.0以腺苷或2-脱氧腺苷为底物, 其K_m分别为83μmol/L和61μmol/L. 对氯汞苯甲酸能显著抑制酶活性, 二硫苏糖醇可使被抑制的活性得到部分恢复.