斑马鱼长时记忆缺陷突变体的筛选

目的:在化学物质乙基亚硝基脲(ENU)诱变的F1代斑马鱼中筛选学习记忆缺陷的突变体,为学习与记忆相关机制的研究提供新的模式动物。方法:通过抑制逃避反应的行为学方法筛选出斑马鱼突变体,然后利用qRT-PCR检测基因表达对突变体进行鉴定。结果:筛选到一例斑马鱼突变体fgt。该突变体在训练后24 h的长时记忆显著的低于野生型。其F2代在训练后的24 h的长时记忆中有将近一半(13/30)显著的低于野生型,而另一半则相对正常。对一个新的环境的探索后,学习记忆相关的早期即刻基因(IEGs)c-fos在将近一半突变体F2代中(13/30)的表达与野生型的对照相比明显升高,且有统计学上的显著性差异,另外一半相对正常,与行为学结果是一致的。结论:筛选获得的斑马鱼fgt突变体是一个显性长时记忆缺陷的突变体。     

斑马鱼sat1.a突变体的鉴定

目的在我们的前期研究工作中,通过Tol2转座子介导的插入突变,筛选到了一批组织特异性表达绿色荧光蛋白GFP的斑马鱼品系。其中一个品系Tol2:20141221t的GFP在神经系统中表达,但还没有鉴定到Tol2转座子插入到基因组什么位置,造成了哪个基因的突变。本文的主要研究目标就是对这一由Tol2转座子插入诱导的斑马鱼突变品系进行鉴定。方法使用交错式热不对称PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)鉴定Tol2转座子插入的基因组位置;利用原位杂交检测被突变的基因的时空表达是否与该品系GFP表达具有一致性;筛选鉴定纯合体突变体,并进一步分析该基因突变造成的发育缺陷。结果在该品系中,Tol2转座子插入到了亚精胺/精胺N1-乙酰基转移酶1a(spermidine/spermine N1-acetyltransferase 1a,sat1.a)的第八个内含子区域,致使sat1.a基因转录提前终止。我们筛选到了sat1.a纯合突变体,但是没有检测到明显的发育缺陷。结论筛选鉴定的Tol2转座子介导的斑马鱼sat1.a突变体没有明显的发育缺陷,但可以作为研究神经系统发育的有力工具。     

斑马鱼tbx2b调控心脏房室间隔发育的功能研究*

tbx2是早期心脏发育的关键基因。为进一步探究其对房室间隔(AVC)发育的影响,研究利用CRISPR/Cas9介导的基因敲除技术,成功构建了斑马鱼tbx2b突变体。通过T7E1酶切对其F₀进行敲除效率检测,结果显示平均敲除效率约为57.5%。F₁进一步筛选获得tbx2b杂合突变体,测序结果显示突变类型为11 bp碱基缺失的移码突变。tbx2b杂合子内交获得纯合子,tbx2b纯合突变体在5 dpf死亡并出现早期心脏环化异常表型。斑马鱼整胚原位杂交实验显示在3 dpf tbx2b纯合突变体中, 心脏腔室分化特异性标志基因nppa、nppb表达上调并异位表达在AVC,而AVC发育关键基因has2的表达消失。高效构建tbx2b突变体并初探其对下游基因的影响,为后续深入研究tbx2b对心脏AVC发育的作用奠定了基础,同时加深了人们对早期心脏调控网络的认识。     

利用CRISPR/Cas9技术构建tnnt2a基因突变斑马鱼及表型分析

心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)作为心肌纤维细肌丝的结构蛋白,参与心脏兴奋收缩耦联过程。tnnt2a为斑马鱼cTnT基因的亚型。本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建了可稳定遗传tnnt2a缺失突变斑马鱼。对tnnt2a缺失突变体进行表型分析,结果显示tnnt2a+/-斑马鱼心脏无明显异常,而tnnt2a-/-斑马鱼心脏在胚胎发育早期具有显著的突变表型,表现为心脏无搏动、心房和心室增大、心包积液,并于受精后6~7天死亡。运用real time RT-PCR检测tnnt2a、actc1a、tpm4a、myl7和vmhc基因在转录水平的表达情况,结果显示tnnt2a~-/~-(Δ2)斑马鱼tnnt2a基因在发育的各时间点表达水平均显著下降;而actc1a、tpm4a、myl7和vmhc基因在突变体胚胎发育早期表达增高,晚期则表达下降。进一步对心脏组织进行电镜观察和免疫荧光染色,结果显示tnnt2a~-/~-(Δ2)斑马鱼心脏无正常粗、细肌丝结构,同时F-actin与Tpm4的共染色也展示了心肌细胞肌丝结构的异常。本研究利用CRISPR/Cas9构建的tnnt2a突变斑马鱼表现出了心腔扩张,停搏及粗、细肌丝形成障碍等与临床扩张型心肌病相似的表型,因此可为TNNT2缺陷相关心肌病的研究提供很好的工具。     

斑马鱼eomesb基因突变体的构建及其功能分析

Eomesodermin (Eomes)是T-box转录因子基因家族的成员,在脊椎动物胚胎发育、模式形成和形态发生过程中发挥重要作用.斑马鱼(Danio rerio) eomesa基因的一个点突变导致其母源合子突变体胚胎发育延迟而大量死亡,而eomesa合子突变体可正常发育至性成熟,但缺失背鳍.本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了斑马鱼eomesa旁系同源基因eomesb的突变体,eomesb纯合突变体不仅可正常发育至性成熟,而且鳍的发育也完全正常.q-PCR和整体原位杂交实验结果显示,eomesa和eomesb在脑部组织具有重叠的表达域,eomesb在中脑的表达略高于eomesa,故推测两基因在脑部可能行使相似的功能,存在一定的功能冗余.对2,4,6 dpf(Days post fertilization)和6 dpf的WT和突变体q-PCR基因表达分析显示,eomesb突变对eomesa的表达没有明显影响.eomesa-/-;eomesb-/-双突变体未出现背鳍缺失以外的附加表型,推测斑马鱼eomesa和eomesb在背鳍发育过程中可能不存在功能冗余,eomesb不参与背鳍的发育过程.此外,整体原位杂交实验结果显示,eomesb突变也不影响其同源基因tbr1a和tbr1b的早期表达.eomesb纯合突变体未观察到明显表型,可能与其影响的功能不引起明显表型有关,也可能与其它基因的遗传补偿效应有关.本研究结果为深入研究斑马鱼eomesb基因的功能提供了实验材料,同时对研究eomesa与eomesb基因功能分化具有参考价值.     

拟南芥白化突变体心口的基因定位与分析

EMS30是拟南芥经甲基磺酸乙酯（EMS）诱变得到的白化突变体。该突变体的叶绿体结构存在严重缺陷,同时伴随叶绿素缺失。遗传分析显示EMS30突变体的突变表型受隐性单基因控制。采用图位克隆的方法对EMS30突变基因进行定位的结果显示,该基因位于拟南芥第一条染色体的分子标记F21M12和F14N23之间的96kb区间内,该区间包含25个基因。通过生物信息学分析发现,该区间内有3个基因定位在叶绿体或与叶绿体发育相关。这些结果有助于该基因的克隆,为阐释叶绿体发育提供线索。     

秀丽隐杆线虫抗铜突变体的筛选及SNP定位

铜在有机体代谢过程中发挥着重要作用, 但过量可产生毒害效应。文章以秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)为模式生物, 寻找多细胞生物中铜代谢调节的关键基因。采用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变秀丽隐杆线虫, 通过100 000个杂合基因组的筛选得到两个抗铜突变体ms1和ms2。在筛选培养基上野生型停止发育, 而抗铜突变体则可发育到成虫, 且抗铜性状能稳定遗传。与N2的回交实验表明, ms1的抗铜表型可能由单基因隐性突变导致, ms2的抗铜表型消失, 可能是由多基因突变引起。以CB4856和ms1作为亲本, 构建了F2群, 经SNP定位, 确定ms1突变位点位于染色体II(LGII)上, 进一步对LGII染色体上的8个SNP标记进行分析, 将ms1的突变位点定位在LGII:-6附近。秀丽隐杆线虫抗铜突变体ms1的筛选和定位可为深入研究线虫铜代谢及调控的分子机制提供实验依据。     

fbxo32基因在traf6缺失斑马鱼肝脏中的表达分析

为了进一步研究fbxo32在肝脏相关疾病中的作用,进行了traf6缺失斑马鱼Danio rerio肝脏的组织切片分析,结果显示斑马鱼traf6缺失个体表现出明显的肝萎缩特征,包括肝脏组织结构松散、肝细胞排列不规则及缺少肝脂肪滴等症状。同时荧光定量实验表明fbxo32 mRNA在检测过的野生型斑马鱼组织中均有一定量的表达,在肝脏中表达量较低而在卵巢中表达量较高。而与野生型斑马鱼相比, fbxo32 mRNA在traf6突变体斑马鱼肝脏中的表达量上调超过100倍。进一步原位杂交结果显示, fbxo32 mRNA的信号主要集中于肝脏细胞,而在血细胞中则没有检测到信号。特别是与野生型斑马鱼相比, fbxo32 mRNA在traf6突变型斑马鱼肝脏中的信号明显增强。实验结果表明traf6缺失能引起fbxo32基因的上调表达,并会导致traf6突变型斑马鱼肝脏发育异常并发生萎缩。     

水稻内颖畸形或缺失基因OsAPP1的图位克隆及表达分析

在育种基地材料中发现一株内颖畸形或缺失(abnormal or absent palea)突变体,将其命名为app1。该突变体在营养生长时期发育正常,但抽穗后突变体表现出内颖畸形(比外稃短导致颖壳不闭合,或者出现两个内稃)或缺失,其花粉育性为55.52%,结实率为6.48%,千粒重为10.811 g,种子发芽率为55.21%。以突变体app1与日本晴杂交构建了F1和F2群体,F1颖壳表型正常,F2群体出现内颖畸形和正常表型分离,内颖正常和突变表型分离比例为3∶1,表明app1内颖突变表型由单隐性核基因控制。以F2为分离群体,将app1精细定位于第3染色体上,位于分子标记ID4231和ID4246之间,遗传距离1.3 cM,对应物理距离为13.2 kb。该区段内完全包含1个开放阅读框,包含两个部分开放阅读框,经过测序分析发现候选基因LOC_Os03g11614启动子区发生点突变和245 bp缺失,qRT-PCR分析证实LOC_Os03g11614为OsAPP1基因。已有报道LOC_Os03g11614编码OsMADS1,是调控水稻花器官发育的重要明星基因,其不同位置的突变可以导致叶状颖壳和不育、以及控制籽粒大小。与3000份水稻种子资源SNP/Indel变异类型对比分析发现,突变体app1启动子的突变完全不同于现已OsMADS1研究报道突变类型,且与数据库中的自然突变类型多数不同。因此,本研究发现的app1突变体,是以往报道中从未出现的OsMADS1启动子发生突变的新型突变,且该类突变导致了其降低表达量,并产生了不同于前人研究的新表型,这为深入研究OsMADS1基因在水稻花器官发育中的功能提供了新的种质资源和思路。     

拟南芥突变体uro的表型分析表明URO基因参与生长素调节的植物发育过程

在筛选拟南芥(ArabidopsisthalianaL.)叶突变体的过程中获得拟南芥uprightrosette(uro)突变体。uro为半显性突变体,因突变体在幼苗生长期莲座叶竖直生长而得名。对uro突变体的表型进行了详细的分析,结果表明uro突变不仅造成叶生长模式的改变,还出现多种其他异常表型。uro杂合和纯合突变体都表现出植物顶端优势的丧失,纯合突变体表现得更为严重。uro纯合突变体的一些二级分枝会被叶取代,这种叶的叶柄与叶片远轴面连接。突变体的花发育也有多种异常表型,主要表现为花瓣及雄蕊数目的改变、花器官的同源异型转化和不同花器官的融合。uro突变体茎软,细胞学水平分析表明突变体的内皮层组织发生增生,束间纤维发育及维管束分化受阻。顶端优势的丧失及维管组织的异常发育表明,URO基因可能参与生长素对植物发育的调节。pin1uro双突变体表型的分析表明,虽然双突变茎表型出现了两亲本表型的叠加,但双突变体的花却出现了新的表型,说明URO与PIN1基因在调节植物发育过程中具有部分遗传上的相互作用,这一结果进一步证明URO基因参与了生长素调节的植物发育过程。     

利用CRISPR/Cas9技术建立斑马鱼Asb11基因敲除品系

Asb11基因被报道与斑马鱼Notch信号的激活有关,本研究室过去的研究显示该基因在心肌和骨骼肌中特异性表达。因此推测Asb11基因可能是心脏发育相关候选基因。为了阐明Asb11基因在斑马鱼心脏发育过程中的作用,本文利用CRISPR/Cas9打靶技术构建敲除Asb11基因的斑马鱼品系。首先在线分析筛选出Asb11基因最适合的打靶位点,然后PCR扩增出Asb11基因gRNA的双链c DNA,再将Asb11基因的gRNA和Hcas9的mRNA共同注射到斑马鱼胚胎Ⅰ细胞期胚胎中。进行打靶的有效性检测,发现Asb11基因的一号外显子出现了碱基的缺失,表明CRISPR/Cas9系统对Asb11基因的敲除是有效的。对其F0代、F1代、F2代进行筛选,成功获得了Asb11基因敲除的斑马鱼品系,为探究Asb11在心脏发育中的作用奠定了基础。     

拟南芥突变体uro的表型分析表明URO基因参与生长素调节的植物发育过程

在筛选拟南芥(Arabidopsisthaliana L.)叶突变体的过程中获得拟南芥upright rosette(uro)突变体.uro为半显性突变体,因突变体在幼苗生长期莲座叶竖直生长而得名.对uro突变体的表型进行了详细的分析,结果表明:uro突变不仅造成叶生长模式的改变,还出现多种其他异常表型.uro杂合和纯合突变体都表现出植物顶端优势的丧失,纯合突变体表现得更为严重.uro纯合突变体的一些二级分枝会被叶取代,这种叶的叶柄与叶片远轴面连接.突变体的花发育也有多种异常表型,主要表现为花瓣及雄蕊数目的改变、花器官的同源异型转化和不同花器官的融合.uro突变体茎软,细胞学水平分析表明突变体的内皮层组织发生增生,束间纤维发育及维管束分化受阻.顶端优势的丧失及维管组织的异常发育表明,URO基因可能参与生长素对植物发育的调节.pin1 uro双突变体表型的分析表明,虽然双突变茎表型出现了两亲本表型的叠加,但双突变体的花却出现了新的表型,说明URO-与PIN1基因在调节植物发育过程中具有部分遗传上的相互作用,这一结果进一步证明URO基因参与了生长素调节的植物发育过程.     

Fus在斑马鱼生长发育及两性生长异形中的功能（英文）

为研究肉瘤融合基因(fus)在鱼类中的功能,在斑马鱼中利用CRISPR/Cas9基因突变技术使fus基因产生移码突变。fus~(-/-)纯合突变体斑马鱼发育正常并且完全可育,但体长和体重在幼鱼和成年阶段都小于野生型斑马鱼。此外,相较于野生型斑马鱼, fus~(-/-)纯合突变体斑马鱼不存在雌鱼身体比例大于雄鱼的性别异形现象。在fus~(-/-)纯合突变体斑马鱼早期幼鱼发育阶段,一些生长相关基因包括gh1、ghra、igf1、igf2a、stat5.1和socs6的表达水平显著低于野生型斑马鱼但其运动能力并未受到影响。因此,不同于fus基因在哺乳动物中的功能,它在斑马鱼中不参与运动神经元的发育,但在调节鱼类躯体生长发育与两性生长异形方面有着重要的功能。     

Fus在斑马鱼生长发育及两性生长异形中的功能

为研究肉瘤融合基因(fus)在鱼类中的功能, 在斑马鱼中利用CRISPR/Cas9基因突变技术使fus基因产生移码突变。fus-/-纯合突变体斑马鱼发育正常并且完全可育, 但体长和体重在幼鱼和成年阶段都小于野生型斑马鱼。此外, 相较于野生型斑马鱼, fus-/-纯合突变体斑马鱼不存在雌鱼身体比例大于雄鱼的性别异形现象。在fus-/-纯合突变体斑马鱼早期幼鱼发育阶段, 一些生长相关基因包括gh1、ghra、igf1、igf2a、stat5.1和socs6的表达水平显著低于野生型斑马鱼但其运动能力并未受到影响。因此, 不同于fus基因在哺乳动物中的功能, 它在斑马鱼中不参与运动神经元的发育, 但在调节鱼类躯体生长发育与两性生长异形方面有着重要的功能。     

以斑马鱼为模式动物研究器官的发育与再生

斑马鱼因其受精卵体外发育、胚胎透明、具有较强的再生能力以及适于大规模遗传筛选的优势, 成为研究脊椎动物器官发育与再生的新兴模式动物。通过数十年的探索, 科研工作者已经在斑马鱼中建立了一套成熟的研究方法, 并对斑马鱼胚胎发育早期的细胞命运决定和分化、组织器官的形态建成以及受损后的再生过程有了初步的认识。近年来, 随着遗传筛选技术的大规模开展和活体成像技术在斑马鱼中的深入应用, 许多在小鼠等模式动物中悬而未决的问题开始得到充分解答。随着研究的不断深化和技术的不断更新, 以斑马鱼为模式动物, 对脊椎动物器官发育与再生的研究将会更加深入, 相关的调控机制也会被逐步探明, 从而为临床相关疾病的防治提供富有价值的参考。文章通过对近年来发表的文章进行回顾, 总结了斑马鱼作为模式动物研究中枢神经系统、肝脏和胰腺、血液细胞和血管等重要器官早期发育过程及其调控机制的进展, 并阐述了以斑马鱼研究尾鳍、心脏、肝脏等器官再生的优势和初步发现。     

斑马鱼miR-196a-1基因敲除品系的构建

microRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为19～23个核苷酸的非编码RNA,通过影响mRNA的稳定性和翻译,来参与基因表达的转录后调控。生物信息学分析表明该基因在各个物种中高度保守。为了阐明该基因在肠道发育中的作用,本文利用Cloning free CRISPR/Cas9基因编辑技术构建miR-196a-1基因敲除的斑马鱼品系。首先通过分析软件筛选出斑马鱼miR-196a-1基因的两个敲除位点,两个敲除位点相隔132 bp,利用PCR技术扩增miR-196a-1的向导DNA,再以向导DNA为模板转录得到miR-196a-1的sgRNA,将miR-196a-1基因的sgRNA和Cas9蛋白共同注射到斑马鱼胚胎1细胞期胚胎中。斑马鱼胚胎发育到36 hpf后进行基因编辑的有效性检测,研究结果显示,miR-196a-1基因出现102 bp碱基的缺失,表明CRISPR/Cas9系统对miR-196a-1基因的敲除有效。对其F0代、F1代、F2代进行筛选,成功获得斑马鱼miR-196a-1基因敲除品系,为研究miR-196a-1在肠道发育中的作用奠定了基础。     

拟南芥角质层发育突变体中WBC11基因的分析与鉴定

从拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)突变体库中筛选到一个发育突变体ku7fy1,其突变表型为叶片狭长,生长缓慢。该研究利用图位克隆技术和候选基因测序鉴定出ku7fy1角质层发育基因(white-brown complex11,WBC11)有一个点突变。对该突变体cDNA测序结果显示,WBC11基因的突变导致其第7个内含子在形成成熟mRNA时无法被正常剪切,使该突变体内WBC11的mRNA大量降解并在翻译时提前引入终止密码子。甲苯胺蓝染色实验显示,突变体叶片表面角质层有缺陷;遗传互补实验进一步证明,突变体ku7fy1中的突变基因是WBC11,ku7fy1表型是由WBC11突变造成的。     

大丽轮枝菌（Verticillim dahliae）突变体库的构建与分析

为了更加快捷地筛选大丽轮枝菌致病关键基因,利用聚乙二醇介导的原生质体转化法构建病原菌随机插入突变体库,对部分阳性转化子的生长表型指标和致病力进行分析,筛选生长发育与致病缺陷突变体并进行靶标基因定位。结果表明,本研究共获得13 030多个阳性转化子,随机挑选5个转化子与V991野生型菌株进行比较分析,发现其中一个突变体在PDA和不同碳源培养基上的菌落直径、产孢量以及致病力均显著降低。侧翼序列测序结果结合Blast比对分析表明,该缺陷突变体中的潮霉素抗性基因表达盒定位于大丽轮枝菌3号染色体1 528 782 bp处,属于内切葡聚糖酶1基因（VDAG＿04017）。综上所述,本研究通过大丽轮枝菌插入突变体库构建、突变体生长表型指标和致病力鉴定及靶标基因定位等一系列分子生物学手段,可初步鉴定病原菌致病相关基因,为从全基因组层面深入研究大丽轮枝菌致病机制奠定了一定基础。     

小球藻细胞壁缺陷型突变体的筛选及转化系统的建立

由于高效、稳定遗传转化系统的缺乏,小球藻遗传改良以及油脂代谢机理的研究等工作难以进行。研究旨在通过筛选获得小球藻Chlorella vulgaris细胞壁缺陷型突变体,在此基础上建立其转化系统。首先通过紫外诱变获得小球藻Chlorella vulgaris的突变体库,基于细胞壁缺陷型突变体在1% Triton X-100处理后叶绿素会释放到上清中的原理,利用酶标仪高通量地从约4000个突变体中筛选获得10株细胞壁缺陷的小球藻。同时以小球藻内源性-tubulin的启动子和终止子作为启动子和终止子,以AphⅧ (Aminoglycoside 3'-Phosphotransferase type Ⅷ)作为报告基因构建了转化载体pHK203。通过优化电转缓冲液组分和电击参数,确定了细胞壁缺陷型突变体CWD-3的最佳转化条件,即2 g pHK203,ddH2O作为电转缓冲液,1500 V,525 ,50 F的电击条件下,转化效率可达到40个转化子/g DNA。研究为小球藻Chlorella vulgaris的油脂代谢通路和遗传改良提供了技术基础,同时由于可降低破壁成本,筛选获得的细胞壁缺陷型突变体适于工业化生产小球藻藻粉。     

斑马鱼心脏发育候选基因Titin-Cap的CRISPR/Cas9打靶有效性分析

CRISPR/Cas9基因打靶技术是近几年发展起来的一种高效率的定向打靶技术,被认为是遗传领域的革命性技术。Titin-Cap基因是本实验室已初步鉴定的斑马鱼心脏发育候选基因,且国内外目前尚无斑马鱼Titin-Cap基因的敲除品系。为了研究Titin-Cap基因在心脏发育过程中的作用机制,我们利用CRISPR/Cas9基因打靶技术建立斑马鱼Titin-Cap基因的敲除品系。测序结果显示,注射了CRISPR/Cas9 gRNA的胚胎出现双峰,说明在打靶位点附近出现了碱基缺失或插入,证明我们设计的gRNA是有效的。对F0代突变体成鱼的筛选中,测序结果同样显示有阳性结果。这些结果说明用CRISPR/Cas9基因打靶技术成功敲除了斑马鱼Titin-Cap基因,获得了Titin-Cap基因敲除的嵌合体斑马鱼。