树鼩骨髓间充质干细胞体外分离培养及成脂成骨诱导

目的：探讨树鼩骨髓间充质干细胞（ BM-MSCs）的体外分离、传代及定向诱导为脂肪细和成骨细胞的可行性。方法通过密度梯度离心联合贴壁培养法对树鼩骨髓间充质干细胞进行体外分离、扩增、纯化,倒置相差显微镜进行形态学观察。用成脂诱导液（ DMEM/F12＋10％FBS＋100 U/mL青霉素＋100μg/mL链霉素＋1.0μmol/L地塞米松＋0.2 mmol/L吲哚美辛＋0.01 mg/mL胰岛素＋0.5 mmol/L IBMX）和成骨诱导液（高糖DMEM＋10％FBS＋100 U/mL青霉素＋100μg/mL链霉素＋50 ng/mL BMP-2）对分离的树鼩BM-MSCs分别定向诱导为脂肪细胞和成骨细胞。结果原代和传代细胞为梭形或三角形,可增殖形成克隆。 BM-MSCs成脂诱导后油红O染色细胞内出现红色脂滴,成骨诱导后茜素红染色可观察到矿化结节。结论密度梯度离心联合贴壁培养法分离培养树鼩BM-MSCs简便可行,获得的BM-MSCs可体外诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞。     

人脐带间充质干细胞的分离培养与鉴定简

目的：建立并优化人脐带间充质干细胞分离纯化方法,并对其表面标志与多向分化潜能进行鉴定。方法：收集健康足月产胎儿脐带组织,采用组织块贴壁法进行原代培养,流式细胞仪对其表面标志进行检测,通过向成骨成脂分化对其多向分化潜能进行鉴定,RT-PCR对其干细胞特性基因Oct4、Nanog、Sox2、Nestin进行检测。结果：采用组织块贴壁法可在2周左右获得大量间充质干细胞,培养的细胞经流式细胞仪检测,高表达CD29、CD44、CD105、CD106,低表达CD34、CD45;经成骨成脂诱导2周后可分化为成骨细胞和成脂细胞,RT-PCR检测发现原代细胞表达Oct4、Nanog、Sox2、Nestin基因。结论：人脐带间充质干细胞可在体外扩增培养,具有多向分化潜能,可作为组织工程种子细胞来源。     

人脐带间充质干细胞的分离培养与鉴定

目的:建立并优化人脐带间充质干细胞分离纯化方法,并对其表面标志与多向分化潜能进行鉴定。方法:收集健康足月产胎儿脐带组织,采用组织块贴壁法进行原代培养,流式细胞仪对其表面标志进行检测,通过向成骨成脂分化对其多向分化潜能进行鉴定,RT-PCR对其干细胞特性基因Oct4、Nanog、Sox2、Nestin进行检测。结果:采用组织块贴壁法可在2周左右获得大量间充质干细胞,培养的细胞经流式细胞仪检测,高表达CD29、CD44、CD105、CD106,低表达CD34、CD45;经成骨成脂诱导2周后可分化为成骨细胞和成脂细胞,RT-PCR检测发现原代细胞表达Oct4、Nanog、Sox2、Nestin基因。结论:人脐带间充质干细胞可在体外扩增培养,具有多向分化潜能,可作为组织工程种子细胞来源。     

大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为脂肪细胞的免疫细胞化学研究

目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)分离、纯化和体外诱导分化为脂肪细胞。方法 用密度梯度离心结合贴壁培养、定期换液,分离纯化出生大鼠MSC,传代扩增,并用免疫细胞化学法鉴定大鼠MSC的表面抗原。含地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和胰岛素的培养液诱导MSC分化后,油红O染色鉴定。结果 大鼠MSC体外扩增10代以上,稳定表达CD44、CD54、CD106。油红O染色显示诱导后,71.2％有脂滴积聚。结论 从大鼠骨髓分离、纯化、体外诱导培养MSC,可定向分化为脂肪细胞表型。     

脐血间充质干细胞诱导向神经元样细胞分化的实验研究

目的：研究脐血间充质干细胞生物学特性及向神经元样细胞分化的潜能。方法：采用密度梯度离心结合贴壁培养法自脐血中分离间充质干细胞,观察细胞生长情况,描绘生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面标志物,分别向成骨细胞、脂肪细胞、神经元样细胞进行诱导分化,通过茜素红染色、油红O染色检测脐血间充质干细胞成骨、成脂肪细胞诱导分化能力,而以免疫组织化学检测诱导后细胞表面神经标志物的表达。结果：纯化的脐血间充质干细胞贴壁生长,呈均一梭形,生长曲线呈S型,并以P3代增殖能力最强,细胞表面不表达或弱表达CD34、CD35、CD106,高表达CD29、CD44、CD105。成骨诱导2周后,可检测到钙化基质的形成,成脂肪诱导3周后,可检测到脂滴的形成。向神经元样细胞诱导分化后,可观察到典型的神经元样形态改变,且NSE、NF、GFAP阳性表达。结论：分离纯化的脐血间充质干细胞具有较强的增殖能力与分化潜能,并在体外诱导条件下可以向神经元样细胞定向分化。     

脐血间充质干细胞诱导向神经元样细胞分化的实验研究

目的:研究脐血间充质干细胞生物学特性及向神经元样细胞分化的潜能。方法:采用密度梯度离心结合贴壁培养法自脐血中分离间充质干细胞,观察细胞生长情况,描绘生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面标志物,分别向成骨细胞、脂肪细胞、神经元样细胞进行诱导分化,通过茜素红染色、油红O染色检测脐血间充质干细胞成骨、成脂肪细胞诱导分化能力,而以免疫组织化学检测诱导后细胞表面神经标志物的表达。结果:纯化的脐血间充质干细胞贴壁生长,呈均一梭形,生长曲线呈S型,并以P3代增殖能力最强,细胞表面不表达或弱表达CD34、CD35、CD106,高表达CD29、CD44、CD105。成骨诱导2周后,可检测到钙化基质的形成,成脂肪诱导3周后,可检测到脂滴的形成。向神经元样细胞诱导分化后,可观察到典型的神经元样形态改变,且NSE、NF、GFAP阳性表达。结论:分离纯化的脐血间充质干细胞具有较强的增殖能力与分化潜能,并在体外诱导条件下可以向神经元样细胞定向分化。     

雪貂脂肪间充质干细胞的分离、分化与鉴定

目的分离、多向诱导分化并进行鉴定雪貂脂肪间充质干细胞。方法无菌采取雪貂腹部皮下脂肪,机械剪碎为0.5 mm~2,采用含0.075%的胶原酶I消化,应用高糖-DMEM培养基(添加4 ng/mLβ-FGF)培养,观察细胞形态特征,流式细胞术分析细胞表面抗原标志的表达,并检测其体外成脂、成骨、成软骨分化能力,还进一步尝试了诱导神经分化。结果运用组织块贴壁法可以从新鲜脂肪组织中分离到贴壁生长的类似成纤维细胞样细胞,流式分析结果显示高表达CD29(53.1%),CD90(99.6%),CD105(93.7%),低表达CD11b(36.3%),CD45(28.3%)。这些细胞在体外经诱导可以分化成为脂肪、骨、软骨和神经元。结论从雪貂脂肪组织中可以分离得到脂肪间充质干细胞,这些细胞具有多向分化能力。     

贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性

目的建立一种简便有效的体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的方法。研究MSCs的生物学特性,为血管组织工程提供理想的种子细胞。方法贴壁培养法分离纯化大鼠MSCs体外培养和连续传代,在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化;利用MTT法测定MSCs的生长曲线;行免疫组化方法鉴定MSCs膜抗原;分别加成骨、成脂肪诱导剂后MSCs体外培养1到3周,分别做碱性磷酸酶(ALP)、VonKossa染色及油红O染色,观察细胞形态变化、成骨及成脂肪分化结果。结果MSCs体外培养生长状况良好,呈均一的成纤维细胞样,表达波形蛋白(Vimentin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),不表达层粘连蛋白(Laminin)、CD34、VIII因子相关抗原(VIII)。经体外诱导后具有多向分化潜能。结论贴壁培养法能有效分离纯化大鼠MSCs,用此方法培养的细胞生长稳定,增殖能力活跃,具有MSCs的一般生物学特性,为其成为血管组织工程理想的种子细胞提供了进一步的支持。     

兔骨髓间充质干细胞的体外分离培养和生物学特性观察

目的:探讨兔骨髓间充质干细胞体外分离、培养和鉴定方法,观察其生物学特性.方法:采集兔股骨及胫骨骨髓组织,采用密度梯度离心法结合贴壁培养法体外分离、培养和扩增兔骨髓间充质干细胞,倒置相差显微镜观察细胞形态,绘制原代、第1、3、8代细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞表面标志物,成骨和成脂肪诱导培养鉴定,观察细胞生物学特性.结果:培养的BMSCs呈纺锤形、长梭形,旋涡状排列、放射性生长,增值活跃.各代细胞生长曲线呈S型,细胞增值活跃.细胞表面标志物CD44分子阳性,CD34和CD45分子阴性.经成骨和成脂肪诱导后细胞碱性磷酸酶染色和油红O染色阳性.结论:成功建立了兔BMSCs体外分离、培养的有效方法,扩增的BMSCs仍保留多向分化潜能,是理想的组织工程种子细胞.     

脐带间充质干细胞——组织工程的新视角

目的 从脐带中分离培养脐带间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC) 并进行鉴定,阐明其多向分化的潜在作用.方法 收集健康胎儿脐带,分离培养脐带中的间充质干细胞,以流式细胞仪对培养的间充质干细胞进行细胞表面标志检测,多种成分联合诱导其向脂肪、成骨方向分化,细胞化学染色检测诱导后的细胞变化.结果 脐带中分离培养的间充质干细胞不表达造血细胞系的标志CD34、CD45、HLA-DR,强表达CD105、CD44、CD90,在适当的诱导条件下可向脂肪及成骨方向分化.结论 脐带中存在具有多向分化潜能的间充质干细胞.     

一种大量快速分离脐带间充质干细胞的新方法

目的:探讨体外快速大量分离脐带间充质干细胞的新方法。方法:采用复合胶原NB4、dispaseII、透明质酸酶三种酶消化3h,加入PBSA溶液稀释,离心获得脐带间充质干细胞,培养;用流式细胞仪对P3代细胞进行表面标记的鉴定,用化学诱导的方法使第3代细胞向脂肪、骨、软骨细胞分化,2~4周后,分别行oilred、Safranin'O和茜素红染色,倒置显微镜下观察诱导结果。结果:经3种酶消化和PBSA稀释,短时间内从脐带中获得了大量间充质干细胞;伴随着细胞的传代,形态逐渐均一,传至第3代,细胞的形态已基本相似;流式细胞仪鉴定,细胞强表达间充质细胞的特异性标记CD90,CD73,CD105,而不表达造血系或内皮系细胞的标记CD45、CD14、CD11、CD34、CD19,也不表达主要组织相容性抗原HLA-DR;向脂肪细胞诱导后第4周,oilred染色见细胞内大量红染的脂滴;向软骨细胞诱导后第4周,Safranin'O染色见多数切片呈阳性,细胞团块中存在大量软骨特异性的陷窝样结构;向骨细胞诱导后第4周,茜素红染色发现肉眼可见的广泛散在的红色阳性钙结节。结论:本研究所采用的3种酶消化结合PBSA稀释的方法可以快速获得脐带间...     

胰岛素样生长因子-1对脂肪间充质干细胞增殖的影响

目的：探讨胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1,IGF-1）对脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）增殖的影响。方法：采用密度梯度离心法结合贴壁法分离脂肪间充质干细胞,接种于含体积分数为10%的胎牛血清的DMEM培养基中行贴壁培养。流式细胞仪检测ADSCs表面标志物（CD90、CD29、CD31、CD34、CD45）的表达情况,利用成骨、成脂诱导液诱导ADSCs向成骨细胞、成脂细胞分化,用碱性磷酸酶、油红O染色观察。采用终浓度为0、5、10、15、20、30 ng/mL IGF的培养基培养ADSCs,利用Edu染色标记ADSCs,分析不同浓度的IGF-1对ADSCs增殖的影响。结果：流式细胞术显示ADSCs的表型分子CD90、CD29呈阳性,CD31、CD45呈阴性,成骨诱导后碱性磷酸酶染色阳性,成脂诱导后油红O染色可见大量脂滴,表明培养的ADSCs具有成骨、成脂分化的能力。IGF-1促进ADSCs增殖的作用随IGF-1的作用浓度的增加而增加,并逐渐趋于饱和,在趋于15μg/mL的浓度时达到最大促增殖作用,且随着IGF-1作用时间的延长其促ADSCs增殖的作用逐渐增强。结论：本实验成功分离培养ADSCs,IGF-1对体外培养的ADSCs有促进增殖的作用。     

牛脂肪间充质干细胞的分离、培养与鉴定

为了给组织工程提供种子细胞,对牛间充质干细胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs)进行体外分离培养。首先应用胶原酶消化法分离牛ADSCs,进行体外培养、连续传代,并观察细胞的形态变化,通过细胞计数绘制生长曲线,细胞压片进行染色体分析,采用细胞免疫荧光化学方法检测细胞表面标记,利用成骨分化和成脂分化检测其分化能力。结果显示牛ADSCs体外培养时细胞形态呈成纤维细胞样,增殖稳定;Vimentin、CD49d、CD13表达呈阳性,CD34表达呈阴性;成骨诱导条件下的细胞碱性磷酸酶活性高,茜素红染色呈阳性;成脂诱导条件下细胞周围脂滴明显,油红-O染色呈阳性。结果证明牛ADSCs体外生长稳定、增殖速度快、定向分化能力强,简易的体外分离培养及诱导方法为其在组织工程中的应用奠定了基础。     

猪脂肪基质细胞成骨与成脂分化潜能的研究

目的:探索猪脂肪基质细胞体外培养和向成骨与脂肪细胞分化的条件。方法:常规方法培养猪脂肪基质细胞,分别向成骨细胞与脂肪细胞进行诱导,应用免疫组化(碱性磷酸酶法、茜素红)及油红O染色对诱导分化的细胞进行鉴定。结果:在体外培养条件下,猪的脂肪基质细胞呈成纤维样,生长旺盛,在一定的条件下,可分别被诱导分化为成骨细胞与脂肪细胞,向成骨分化的细胞表达碱性磷酸酶,在培养皿中可形成钙化斑。而在向脂肪细胞诱导分化过程中,细胞中可见有小脂滴生成,用油红O染色呈橘红色。结论:脂肪基质细胞是一种混合细胞,除了能向脂肪细胞分化外,在一定的诱导条件下,也能向成骨细胞分化。     

脐带间充质干细胞成脂分化的研究

目的:探讨脐带间充质干细胞向成脂细胞方向分化的潜能,为脂肪组织工程提供一种来源丰富的干细胞来源。方法:采用胰酶和胶原酶Ⅰ型联合消化法获得脐带间充质干细胞,通过免疫细胞化学法对其表面标志物进行鉴定,化学诱导方法诱导脐带间充质干细胞向成脂细胞方向分化,倒置显微镜观察其形态变化,油红O染色对诱导后的细胞进行染色。结果:胰酶和胶原酶Ⅰ联合消化法分离的细胞贴壁生长,呈现成纤维细胞形态,免疫细胞化学显示脐带间充质干细胞表达CD29、CD44和CD105,但不表达CD31、CD34和CD105,脐带间充质干细胞在成脂诱导培养基中细胞生长速度明显减慢,细胞形态转变为肥大、扁平、含有大量脂滴的脂肪细胞,油红O染色示胞浆充满了油滴空泡。结论:脐带间充质干细胞具有向成脂细胞方向分化的潜能,为脂肪组织工程提供了一种来源丰富、免疫力低和低分化的种子细胞。     

胰岛素样生长因子-1 对脂肪间充质干细胞增殖的影响

目的：探讨胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)对脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs) 增殖的影响。方法：采用密度梯度离心法结合贴壁法分离脂肪间充质干细胞,接种于含体积分数为10%的胎牛血清的DMEM 培 养基中行贴壁培养。流式细胞仪检测ADSCs表面标志物(CD90、CD29、CD31、CD34、CD45)的表达情况,利用成骨、成脂诱导液诱 导ADSCs 向成骨细胞、成脂细胞分化,用碱性磷酸酶、油红O 染色观察。采用终浓度为0、5、10、15、20、30 ng/mL IGF的培养基培 养ADSCs,利用Edu 染色标记ADSCs,分析不同浓度的IGF-1 对ADSCs增殖的影响。结果：流式细胞术显示ADSCs的表型分子 CD90、CD29 呈阳性,CD31、CD45 呈阴性,成骨诱导后碱性磷酸酶染色阳性,成脂诱导后油红O染色可见大量脂滴,表明培养的 ADSCs具有成骨、成脂分化的能力。IGF-1 促进ADSCs 增殖的作用随IGF-1 的作用浓度的增加而增加,并逐渐趋于饱和,在趋于 15 滋g/mL的浓度时达到最大促增殖作用,且随着IGF-1 作用时间的延长其促ADSCs 增殖的作用逐渐增强。结论：本实验成功分 离培养ADSCs,IGF-1 对体外培养的ADSCs 有促进增殖的作用。     

脂肪来源细胞体外增殖规律及定向诱导分化研究

脂肪组织由整形外科吸脂术获得(19例,31．5±5．8岁)。酶消化法分离抽吸物中细胞,体外扩增至第10代．测定细胞生长曲线、累计倍增数目,明确其体外生长规律和增殖能力;通过对表面抗原CD29、CD105、CD106、CD166、CD49d、CD34、CD31、3G5等的检测分析脂肪来源细胞的群体组成：分别向软骨、骨、脂肪定向诱导,进一步明确该细胞群体定向分化能力。实验表明,每300ml脂肪抽吸物平均可获得5×10~7个有核细胞,体外扩增10代,平均每代倍增数目为1．59±0．224．累计倍增数目为15．53。流式细胞学及免疫细胞化学检测显示,干细胞相关抗原CD29、CD105、CD106、CD166等表达率均＞60%,但与造血系相关的CD34、CD31表达率也分别达到7．3%、29．2%。ADC向软骨诱导可检测到Ⅱ型胶原表达;向成骨诱导可见矿化结节形成,并可检测到AKP、Osteonectin基因表达;向脂肪诱导可检测到PPARr2、GLU-4、Leptin基因表达,细胞内有脂滴形成。脂肪来源的细胞获得量大,体外增殖能力强,并含有具有多向分化潜能细胞,有可能作为组织构建的种子细胞。     

人脐带间充质干细胞的成脂诱导分化及其相关基因鉴定

目的:探讨人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的分离提取、体外诱导分化为脂肪细胞的能力及其相关基因的表达情况。方法:取新生儿脐带经组织培养法提取后分离培养于αMEM完全培养基中,经大量纯化与扩增后,采用倒置显微镜观察其形态与细微结构;流式技术检测其细胞周期及表面标志;以含有成脂诱导剂的αMEM培养基对P3的hUC-MSCs进行培养,诱导其向脂肪细胞方向分化,对其对诱导后的细胞进行检测。应用油红"O"染色对其进行定性鉴定;应用实时定量RT-PCR对LPL、Leptin的基因含量进行测定。结果:经过组织培养法后,细胞呈贴壁生长,细胞呈梭性或旋涡状,形态不规则,多数有凸起,细胞核较大,核仁明显;第7代以前的细胞具有较强的生长活性;流式技术检测发现此类细胞高表达CD44、CD73和CD105等细胞表面标记,而几乎不表达CD34、CD45、CD31和HLA-DR。培养至第3代的细胞约72.724%的细胞处G1期、S期的细胞仅占18.069%,第7代时G1期细胞约为83.875%、S期为9.606%左右;经成脂诱导剂诱导分化后,细胞经油红"O"染色,分化为脂肪细胞的细胞着色并呈红色,实时定量RT-PCR结果显示该部分细胞表达脂肪细胞的标志性基因LPL和Leptin。结论:P7以前的hUC-MSCs具有较强的生长分化能力,可以向脂肪细胞进行分化并表达一定量的特定标志性基因。     

一种新方法获取颞下颌关节骨关节病患者滑膜间充质干细胞及细胞培养鉴定

该研究探讨从颞下颌关节骨关节病患者的关节冲洗液中获取滑膜间充质干细胞(synovial mesenchymal stem cells,SMSCs)并进行体外培养,研究其间充质干细胞特性。采用离心、贴壁培养法从颞下颌关节骨关节病患者的关节冲洗液中提取并分离细胞,进行细胞形态学观察、细胞生长及周期的分析,细胞表面物标志物流式细胞术检测,间充质干细胞标志物免疫荧光检测,成骨、成脂、成软骨多向分化能力检测,促血管分泌因子检测。结果显示,通过离心、贴壁培养法可稳定地从患者颞下颌关节冲洗液中获取滑膜间充质干细胞,体外培养呈对数生长。SMSCs表达间质源性细胞的特异性标记物CD73、CD90、CD105、波形蛋白(Vimentin)以及α平滑肌肌动蛋白的特异性标记物α-SMA。经诱导培养基诱导,SMSCs可分化为骨、软骨和脂肪细胞,细胞分泌液中可检测到如成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)、angiopoietin、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)等10余种促血管生长因子。以上结果表明,该研究成功建立了以微创的方式获取颞下颌关节骨关节病患者的滑膜间充质干细胞,有望为组织工程应用于骨软骨修复提供良好种子细胞的来源。     

鼻黏膜间充质干细胞的培养、鉴定及诱导分化

目的建立Sprague Dawley(SD)大鼠鼻黏膜间充质干细胞(NM-MSCs)的获取、分离、培养方法,初步了解其生物学特性。方法通过SD大鼠鼻黏膜贴壁法体外分离、培养NM-MSCs,光镜下细胞形态学观察,用免疫荧光技术检测间充质干细胞和神经干细胞标记物,用流式细胞术检测细胞表面标记物,再诱导其向骨组织及脂肪组织方向分化,最后对其进行细胞周期检测及分析。结果分离培养的NM-MSCs光镜下以梭形与多角形细胞为主,呈放射状排列,且生长旺盛;免疫荧光染色显示NM-MSCs同时表达STRO-1和Nestin;第4代NM-MSCs不表达CD19、CD31、CD34、CD45及HLADR细胞表面标记物,但表达CD90、CD105基质细胞标记物;NM-MSCs经成骨、成脂诱导后,茜素红染色和油红O染色均呈阳性;细胞周期分析显示NM-MSCs符合干细胞生长的特性。结论 SD大鼠NM-MSCs组织块贴壁法获取容易,操作简单,且可大量扩增用于细胞实验研究,经体外诱导后具有多向分化潜能,具有间充质干细胞的一般生物学特性。SD大鼠鼻黏膜组织块贴壁法为组织细胞工程研究提供了充足的种子细胞来源。