水稻矮缩病毒非结构蛋白基因S6的表达和抗血清的制备

经RT-PCR扩增出水稻矮缩病毒（RDV）中国分离物非结构蛋白基因S6,并克隆至pGEM-Teasy载体上,序列分析表明该基因与日本株具有高度同源性,并且含有较高比例的稀有密码子。将S6基因克隆到表达载体pGEX-6P-1,并转化大肠杆菌,该基因在大肠杆菌以包涵体形式大量表达,以表达的融合蛋白作抗原免疫家兔,制备抗S6蛋白的抗血清,ELISA测定表明,该血清与抗原共价特异性反应,抗血清的效价为1：3000.Western blot印迹实验表明该抗血清能特异性检测RDV感染的水稻组织中的S6蛋白,因而可作为感染RDV的水稻植株的分子手段。     

水稻矮缩病毒非结构蛋白基因S6的表达和抗血清的制备

经RT-PCR扩增出水稻矮缩病毒(RDV)中国分离物非结构蛋白基因S6,并克隆至 pGEM-Teasy 载体上.序列分析表明该基因与日本株具有高度同源性,并且含有较高比例的稀有密码子.将S6基因克隆到表达载体pGEX-6P-1,并转化大肠杆菌,该基因在大肠杆菌以包涵体形式大量表达.以表达的融合蛋白作抗原免疫家兔,制备抗S6蛋白的抗血清,ELISA 测定表明,该血清与抗原共价特异性反应,抗血清的效价为13000. Western blot印迹实验表明该抗血清能特异性检测RDV感染的水稻组织中的S6蛋白,因而可作为感染RDV的水稻植株的分子手段.     

水稻矮缩病毒非结构蛋白Pns6的表达及其单克隆抗体的特异性分析

水稻矮缩病毒（RDV）的基因组包含12条双链RNA,其中基因组片段S6编码的非结构蛋白Pns6为该病毒的运动蛋白.在本研究中,在大肠杆菌中表达了N端融合His-tag的重组Pns6蛋白.在低温和低IPTG浓度的诱导后,通过Ni螯合亲和层析进行纯化获得了HisPns6蛋白.稳定性分析表明,HisPns6是一个稳定的蛋白,可耐受37℃下长达24h的处理.纯化的蛋白后续用于单克隆抗体的制备并得到18个杂交瘤细胞株系.使用从感染RDV的水稻叶片中提取的Pns6为样品,以健康水稻总蛋白为对照,通过Western blot法对抗体进行特异性分析,获得了15个阳性抗体.对其进行抗原决定簇分析表明,最敏感的抗原决定簇位于Pns6的C端区域（296~509位氨基酸）.该结果与生物信息学预测分析相吻合.     

水稻齿叶矮缩病毒Segment 9 dsRNA的序列分析及其在大肠杆菌DE3中的表达

通过有机试剂抽提,ＣＦ－１１纤维素柱层析,从感染水稻齿叶矮缩病毒菲律宾分离株（ＲｉｃｅＲａｇｇｅｄＳｔｕｎｔＶｉｒｕｓ,Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｉｓｏｌａｔｅ,简称ＲＲＳＶ－Ｐ）的水稻植株中获取该病毒的全基因组,即获得从Ｓｅｇｍｅｎｔ１到Ｓｅｇｍｅｎｔ１０（Ｓ１－Ｓ１０）的１０条双链ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）,然后设计合适的引物,用ＲＴ－ＰＣＲ方法得到Ｓ９的ｃＤＮＡ并将其克隆到ｐＵＣ１１９质粒上扩增,以双链测序法测定该ｃＤＮＡ的全序列。同时又将此ｃＤＮＡ克隆到大肠杆菌表达质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ上,在大肠杆菌菌株ＤＥ３中用ＩＰＴＧ诱导表达,经超声波破菌、离心、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析,得到纯化的分子量为６４ｋＤ的融合蛋白。     

大蒜E病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗血清制备

设计特异性引物PCR扩增了余杭大蒜病样中的大蒜E病毒 (GarV E)的全长CP基因 ,构建原核表达载体并在大肠杆菌中过量表达 ,纯化表达产物后免疫家兔制备抗血清。Westernblot检测结果表明 ,抗血清与GarV E的CP起强的特异性反应。 7个大蒜样品中 ,内蒙古赤峰市、宁夏银川和甘肃天水等 4个样品受到GarV E的侵染。试验也证明了田间GarV E编码的CP分子量为 35kD ,不同于已报道的其他葱X病毒属成员的 2 8kD外壳蛋白     

水稻矮缩病毒昆明分离物抗血清制备及免疫捕捉PCR检测

由水稻矮缩病毒(Rice dwarf viru S,RDV)引起的水稻矮缩病害,最早由日本报道,随后在东南亚等国以及我国的福建、云南等南方稻区普遍发生,云南主要发生于中部及南部地区[1].水稻在苗期至分蘖期感病后,植株矮缩,分蘖增多,叶片浓绿,僵直,出现白斑,生长后期病稻不能抽穗结实,在暴发流行年份可以引起水稻的严重减产.     

水稻矮缩病毒昆明分离物抗血清制备及免疫捕捉PCR检测

由水稻矮缩病毒(Rice dwarf virus,RDV)引起的水稻矮缩病害,最早由日本报道,随后在东南亚等国以及我国的福建、云南等南方稻区普遍发生,云南主要发生于中部及南部地区[1]。水稻在苗期至分蘖期感病后,植株矮缩,分蘖增多,叶片浓绿,僵直,出现白斑,生长后期病稻不能抽穗结实,在暴发流行年份可以引起水稻的严重减产。RDV在分类上属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)植物呼肠孤病毒属(Phytoreovirus)成员,病毒粒子为正十二面体球形结构,直径约为69.3nm,无刺突,无脂蛋白外膜包被,具有双层的蛋白衣壳[2]。病毒基因组由12条双链RNA片段组成,其中S8编…     

水稻齿叶矮缩病毒Segment 9 dsRNA的序列分析及其在大肠杆菌DE3中的…

通过有机试剂抽提,ＣＦ－１１纤维素柱层析,从感染水稻齿叶矮缩病毒菲律宾分离株（ＲＲＳＶ－Ｐ）的水稻植株中获取该病毒的全基因组,即获得从Ｓｅｇｍｅｎｔ １到Ｓｅｇｍｅｎｔ １０（Ｓ１－Ｓ１０）的１０条双链ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）,然后设计合适的引物,用ＲＴ－ＰＣＲ方法得到Ｓ９的ｃＤＮＡ并将其克隆到ｐＵＣ１１９质粒上扩增,以双链测序法测定该ｃＤＮＡ的全序列。同时又将此ｃＤＮＡ克隆到大肠杆菌表达质粒ｐＧＥＸ     

大蒜A病毒CP基因的原核表达及抗血清制备

根据GenBank报道的大蒜A病毒(GarV-A)序列设计引物、扩增其外壳蛋白基因并进行序列分析.结果表明,GarV-A的CP基因与目前已报道的两种GarV-A不同分离物CP基因的核苷酸序列同源性为98％-99％;氨基酸序列同源性均为98％.将GarV-A CP基因插入表达载体pSBET,在大肠杆菌BL21(DE3)Plys E菌株中诱导表达.CP经12％SDS-PAGE和5％-20％SDS-PAGE两次纯化,免疫小鼠获得抗CP血清,Western blotting分析表明确定制备的抗体对CP具有高度特异性,ELISA检测表明制备的抗体能够与天然病毒离子结合,因此可以作为该病毒的检测.     

侵染浙贝母3种病毒CP基因的原核表达、抗血清制备及其病毒检测

根据GenBank报道的浙贝母花叶病毒(Thunberg fritillary mosaic virus,TFMV)、浙贝母Y病毒(Fritillary virus Y,FVY)和百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)序列设计引物,扩增其CP基因。将CP基因插入表达载体pSBET,转化大肠杆菌BL21(DE3)Plys E菌株,IPTG诱导表达。经12% SDS-PAGE和5%~20%梯度SDS-PAGE两次纯化CP,分别免疫小鼠获得抗CP血清。采用Western blot分析确定抗体的特异性及其之间的血亲学关系;采用ELISA分析确定抗体是否能与天然病毒粒子结合。采用Western blot、间接ELISA法和Dot-ELISA 法检测侵染浙贝母的3种病毒。结果表明,制备的抗体对CP有高度特异性,相互之间无交叉反应,且能与天然病毒离子结合。制备的抗血清可以用于检测3种病毒,其中间接ELISA法和Dot-ELISA法检测效果较好。     

KCTD10基因的表达、抗体制备及其在常见细胞系中的表达

人类KCTD10(channe l tetram erisation dom a in-conta in ing 10)基因属于PD IP1(polym erase de lta-interactingprote in 1)基因家族。最近的研究表明,小鼠KCTD10能同时和PCNA以及DNA聚合酶δ相互作用,并受肿瘤坏死因子α诱导;可能在诸如DNA修复、DNA复制、细胞周期调控以及人类的多种疾病中发挥重要作用,但对其确切功能和作用机制研究不多。克隆人的KCTD10基因到pQE-N3原核表达载体,在原核细胞株BL21(DE3)中表达并获得融合表达产物。获得的融合蛋白产物通过免疫新西兰大白兔获得兔抗KCTD10多克隆抗体。采用western印迹技术,用该抗体检测KCTD10基因的原核和真核表达产物,证明该抗体有较好的针对KCTD10蛋白的专一性,可用于对KCTD10的结构与功能研究。同时利用实时定量PCR的方法检测该基因在几种常见细胞系的表达情况,发现在N IH3T3细胞系中表达较高,而在HeLa、HepG2、SW 480、PanC1、MCF7等癌细胞系中表达较低,由此推测KCTD10可能在癌症的发生中起到一定的作用。     

盐穗木HcDMC1的原核表达和抗血清的制备

DMC1是减数分裂过程中同源染色体配对和重组修复所必需的减数分裂特异蛋白。根据盐胁迫下盐穗木转录组数据库,克隆获得的盐穗木DNA损伤修复基因命名为HcDMC1。为深入分析盐穗木HcDMC1基因的耐盐功能,通过原核表达获得盐穗木HcDMC1的融合蛋白,用于免疫小鼠制备特异性的HcDMC1抗血清。结果表明,利用pET30a-HcDMC1能够在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达融合蛋白His-HcDMC1,纯化融合蛋白His-HcDMC1的含量为1.0 mg·mL^-1。每次每只小鼠免疫接种50 μg融合蛋白,三次免疫接种后进行抗体效价及特异性检测。ELISA检测抗血清滴度约为1：400 000,Western Blot检测证明了抗血清的特异性。本研究制备的小鼠抗血清能够为盐穗木HcDMC1蛋白的功能鉴定和免疫检测提供实验材料。     

GAS41蛋白的表达、抗体制备及其亚细胞定位

GAS41是新发现的与神经胶质瘤密切相关的基因。为了对该基因进行深入的功能研究,成功地将GAS41基因构建于原核表达载体pQE—N3,转化BL21（DE3）获得融合表达产物。对含融合蛋白的包含体进行溶解和复性,通过免疫新西兰大白兔获得兔抗GAS41多克隆抗体。采用Western印迹技术,用该抗体检测GAS41基因的原核和真核表达产物,证明该抗体有较好的针对GAS41蛋白的专一性,可用于对GAS41的结构和功能研究。同时,用该抗体通过荧光免疫细胞进行定位分析发现,GAS41蛋白均匀分布于COS7细胞的细胞核中,提示GAS41可能是一个重要的转录因子。     

薯蓣褪绿坏死花叶病毒CP基因的原核表达及抗血清的制备

薯蓣褪绿坏死花叶病毒(yam chlorotic necrotic mosaic virus,YCNMV)是马铃薯Y病毒科柘橙病毒属暂定成员。采用RT-PCR方法,以Sprimer/M4简并引物对扩增获得的YCNMV分离物3'端基因组序列为参考序列,根据该序列设计CP基因特异引物获得YCNMV CP基因并插入p ET-30a表达载体中,在BL21(DE3)菌株中诱导表达。获得的融合蛋白经Ni+-NTA柱纯化后免疫新西兰大白兔,制备抗血清。结果表明,连接在表达载体中的CP基因序列及表达的蛋白氨基酸序列与预期的CP基因核苷酸和氨基酸序列同源性均为99.65%。聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明,获得的融合蛋白大小约为44 k D,与预期蛋白大小相符。制备的抗血清经Western blotting和ID-ELISA检测表明,获得的多克隆抗体效价较高,能可靠、灵敏、特异地与YCNMV病毒颗粒结合,可应用到该病毒的检测中。     

豌豆铁蛋白的纯化及其抗血清的制备

干豌豆种子粗提物经MgCl2 盐析、AcA2 2 凝胶过滤和DEAE 纤维素阴离子交换柱层析等方法进行纯化 ,以邻菲咯啉显色法检测铁蛋白 ,最后获得纯的铁蛋白 .纯化的铁蛋白在PAGE上显示一条带 ,SDS PAGE显示该蛋白仅含 2 8kD一条亚基 .纯化的豌豆铁蛋白免疫兔 7周后 ,琼脂糖双扩散法检测抗血清效价达 1∶32 .用分级盐析法纯化抗血清 ,纯化后的抗体用琼脂糖双扩散法对大豆铁蛋白粗提物有免疫交叉反应     

昆虫神经毒素LqhIT2的表达、抗血清制备及活性分析

根据毕赤酵母密码子偏爱性,不改变毒素蛋白质一级结构,设计合成了昆虫神经毒素LqhIT2基因,并分别克隆至大肠杆菌融合表达载体pPET30-a( )和毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K.在IPTG的诱导下,神经毒素在大肠杆菌中融合表达,表达产物经镍亲和层析纯化后,用于免疫BALB/c小鼠,制备了特异性较高的抗血清,抗体滴度超过1:128 000.利用制备的抗血清,采用斑点杂交,筛选得到了较高水平分泌表达重组LqhIT2的酵母转化子,摇瓶条件下,毒素表达量约9 mg/L.大肠杆菌表达产物没有生物活性,酵母表达产物经注射蝗虫表现出杀虫活性.     

人蛋白二硫键异构酶的纯化及其抗血清制备

人蛋白二硫键异构酶的纯化及其抗血清制备吴秉毅,冯桂湘,吕静,张帆,冯永清,王福琴（第一军医大学珠江医院广州５１０２８０）关键词蛋白二硫键异构酶,分离与纯化,抗血清制备二硫键在维持蛋白质的空间结构、生物学活性中起重要作用。二硫键的形成是蛋白质翻译后修饰...